Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Nanopräzipitation Methode zur Polymer-Nanopartikel mit Diblock-Copolymere zu synthetisieren. Wir besprechen die Synthese von Di-Co-Polymeren, die Nanopräzipitation Technik und Einsatzmöglichkeiten.
Abstract
Nanotechnologie ist ein relativ neuer Zweig der Wissenschaft, die Nutzung beinhaltet die einzigartigen Eigenschaften von Teilchen, die Nanometer-Skala (Nanopartikel) sind. Nanopartikel können in einer präzisen Art und Weise, wo ihre Größe, Zusammensetzung und Oberflächenchemie sorgfältig kontrolliert werden können manipuliert werden. Dies ermöglicht eine beispiellose Freiheit, um einige der grundlegenden Eigenschaften ihrer Ladung, wie Löslichkeit, Diffusion, Gewebeverteilung Release-Eigenschaften und Immunogenität zu ändern. Seit ihrer Gründung haben Nanopartikel in vielen Bereichen der Naturwissenschaften und der Medizin, einschließlich Drug-Delivery-, Bildbearbeitungs-und Zellbiologie 1-4 verwendet worden. Es ist jedoch nicht vollständig außerhalb der "Nanotechnologie Laboratorien" durch wahrgenommene technische Barriere eingesetzt. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache Methode, um eine Polymer-Nanopartikel, die ein breites Spektrum möglicher Anwendungen ist zu synthetisieren.
Der erste Schritt ist, um ein Diblock Co-Polymer, das sowohl eine hydrophobe Domäne und hydrophilen Domäne zu synthetisieren. Mit PLGA und PEG als Modell Polymere, beschrieben wir eine Konjugationsreaktion mit EDC / NHS-Chemie 5 (Abb. 1). Wir diskutieren auch die Polymer-Reinigungsprozess. Die synthetisierten Diblock-Copolymer kann in Nanopartikel selbst zusammen in der Nanopräzipitation Prozess durch hydrophobe-hydrophile Wechselwirkungen.
Die beschriebenen Polymer-Nanopartikel ist sehr vielseitig. Der hydrophobe Kern der Nanopartikel genutzt werden, um schwer löslichen Medikamenten für Drug-Delivery experiments6 tragen. Darüber hinaus können die Nanopartikel das Problem der toxischen Lösungsmittel für schwerlösliche Molekularbiologie Reagenzien, wie Wortmannin, die ein Lösungsmittel wie DMSO erfordert überwinden. Allerdings kann DMSO toxisch für Zellen und stören mit dem Experiment. Diese schwer löslichen Medikamenten und Reagenzien kann effektiv geliefert werden unter Verwendung von Polymer-Nanopartikeln mit minimaler Toxizität. Polymer-Nanopartikel können auch mit Fluoreszenzfarbstoff beladen und genutzt werden für intrazellulären Transport Studien. Schließlich können diese Polymer-Nanopartikel konjugiert werden, um Targeting-Liganden durch die Oberfläche PEG. Solche gezielten Nanopartikel können verwendet werden, um spezifische Epitope auf oder in Zellen 7-10 Label sein.
Protocol
1. Synthese von PLGA-b-PEG-Polymer
- Poly (D, L-Lactid-co-Glycolid) (PLGA) mit Terminal Carboxylatgruppen (PLGA-Carboxylat) ist in jedem Lösungsmittel für PLGA (wie in Materialien Abschnitt erwähnt) in einer Konzentration von 5 mM aufgelöst. PLGA kann bei dieser Konzentration unter leichtem Rühren gelöst werden.
- Beide NHS (Molekulargewicht 115,09) und EDC (Molekulargewicht 191,7) sind in den PLGA-Lösung bei einer Konzentration von 25 mM gelöst. (Beide EDC und NHS sind in einem stöchiometrischen Überschuß von 5-mal im Vergleich zu PLGA hinzugefügt). PLGA-Carboxylat in PLGA-NHS, indem EDC und NHS zu PLGA-Carboxylat-Lösung unter leichtem Rühren für ca. 1 Stunde umgerechnet.
- Das Reaktionsprodukt PLGA-NHS wird durchgeführt, indem die Waschlösung Methanol ausgefällt. Etwa 10 mal Volumen Überschuss Methanol wird zu der Lösung gegeben. Die Lösung ist bei 2000 xg zentrifugiert auszufallen der PLGA-NHS und den Überstand verwerfen (entfernt die Spuren von EDC und NHS. Dieses Verfahren der Wäsche mit Methanol ist mindestens dreimal wiederholt.
- Die PLGA-NHS Pellet wird unter Vakuum für 30 Minuten, um alle Spuren der Waschlösung zu entfernen getrocknet.
- Die PLGA-NHS Pellet wird nun in dem gleichen Lösungsmittel in der gleichen Konzentration, die ursprünglich verwendet wurde, um PLGA aufzulösen wieder aufgelöst. Die hetero-PEG (Amin-PEG-Carboxylat) wird dann an den PLGA-Lösung bei einer Konzentration von 5 mM zugegeben (stöchiometrischen Verhältnis von 1:1). Die Mischung Lösung wird für 24 Stunden unter ständigem Rühren inkubiert.
- Nach 24 Stunden wird das Reaktionsprodukt PLGA-b-PEG-Blockcopolymer durch Zugabe der Waschlösung Methanol im Überschuß gefällt. Wiederholen Sie die Wasch-und Zentrifugation wie oben dreimal erwähnt. Dadurch werden alle überschüssigen nicht umgesetzten PEG.
- Die PLGA-b-PEG-Blockcopolymer wird unter Vakuum getrocknet.
2. PLGA-b-PEG-Nanopartikel Vorbereitung
Nanopartikel mit PLGA Kern mit PEG an der Oberfläche bedeckt mit diesen Diblockcopolymere vorbereitet werden. Eine Vielzahl von unterschiedlichen hydrophoben Medikamente können in solchen Nanopartikeln verkapselt werden. Fluoreszierende Verbindungen können in den Nanopartikeln verkapselt werden oder konjugiert werden PLGA und damit diese Nanopartikel können für die Fluoreszenz-Bildgebung verwendet werden.
Nanopräzipitation Methode wird verwendet, um Nanopartikel zu machen vor allem, wenn die gewünschte Ladung zu verkapselnden ist stark hydrophob in der Natur.
- Die PLGA-b-PEG-Blockcopolymer und das Medikament / Cargo (eingekapselt werden) sind in jedem Lösungsmittel, das PLGA löst aufgelöst. PLGA kann durch viele gebräuchliche Lösungsmittel, einschließlich Acetonitril, DCM, Tetrahydrofuran, Aceton oder Ethylacetat gelöst werden. Die Wahl des Lösungsmittels ist von entscheidender Bedeutung, da sie die Eigenschaften der Nanopartikel beeinflusst. Daher sollten geeignete Lösungsmittel in diesem Schritt verwendet werden.
- Das Polymer / Wirkstoff-Gemisch wird dann tropfenweise auf 3-5 Bände Rühren Wasser eine endgültige Polymer-Konzentration von etwa 3 mg / ml zugegeben. (Abb. 2)
- Das Rühren wird für 2 Stunden unter vermindertem Druck setzte, damit die Nanopartikel durch Selbstorganisation bilden, und entfernen Sie die Spuren des organischen Lösungsmittels.
- Ernte und Reinigung: Die Nanopartikel werden dann durch Zentrifugation bei 2.700 x g für 10 min unter Verwendung einer Amicon-Filter (MWCO 20KDa), gewaschen konzentriert und rekonstituiert in PBS. Diese entfernt alle un-eingeschlossene Wirkstoff / Fracht. Grundlegende biophysikalischen Charakterisierungen, wie Größe, Oberflächenladung und Drogen Beladungseffizienz durchgeführt werden, um ein besseres Verständnis der Eigenschaften von Nanopartikeln werden.
3. Lagerung
Die Gefriertrocknung ist eine häufig verwendete Methode, um Nanopartikel 11 Bewahren. Die Gefriertrocknung wird die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Nanopartikel für die langfristige Stabilität 12 zu erhalten. Die Gefriertrocknung kann Stress auf die Partikel verursachen und zu destabilisieren die Formulierung, so Kryo-Schutzmittel (Schutz vor Einfrieren Stress) und Lyo-Schutzmittel (Schutz vor dem Austrocknen Stress) häufig verwendet werden. Die Wahl dieser Schutzmittel wird durch die gewünschte Länge der Lagerzeit 13 bestimmt.
- In der Gefriertrocknung, gibt es insgesamt Erstarrung der Probe durch Einfrieren unterhalb seines Tg.
- In der Trocknung ist das Eis durch Sublimation entfernt. Temperatur und Druck sollten optimiert werden, um eine effiziente Gefriertrocknung zu erreichen.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Charakterisierung von PLGA-b-PEG Di-Block-Copolymer
Verschiedene Techniken können verwendet werden, um die erfolgreiche Konjugation von Polymeren zu bestätigen. Die Zusammensetzung der PLGA-b-PEG kann charakterisiert mit einem 400 MHz 1H Kernspinresonanz (NMR) werden. Molekulargewicht des gebildeten Produkts (PLGA-b-PEG) kann durch Gelpermeationschromatographie (GPC) nachgewiesen werden. Die PLGA-b - PEG Molekulargewicht Distribution-Kurve und Elutionszeit sollte sich von PLGA und PEG allein. In Kombination sollten diese Techniken prägen das gebildete Produkt und festzustellen, ob die Konjugationsreaktion erfolgreich war.
Charakterisierung von PLGA-b-PEG-Nanopartikeln
Partikelgröße und Größenverteilung kann durch dynamische Lichtstreuung gemessen werden. Verschiedene Parameter in der Nanopräzipitation Prozess beeinflussen die Größe der Partikel. Die Molekulargewichte der verwendeten Polymere zunächst (beide PLGA und PEG) auch Wirkung der Partikelgrößenverteilung. Transition-Elektronenmikroskopie (TEM) kann auch verwendet werden, um die Größenverteilung und Struktur der Nanopartikel, wie in Abbildung 3 zu sehen bestätigen. Die Partikelgröße liegt im Allgemeinen im nm-Bereich. Große Partikelgrößen mit ungleichen Größenverteilung könnte entweder auf einen Fehler in der Konjugationsreaktion oder Nanopräzipitation Methode benötigt Optimierung. Darüber hinaus kann die Oberfläche Zeta-Potential von ZetaPALS gemessen werden.
Das Medikament / der Fracht Effizienz kann mit Standard-HPLC quantifiziert werden.
Die Partikel werden in einem organischen Lösungsmittel und HPLC aufgelöst werden durchgeführt, um die Absorption des Medikaments / Fracht (Abb. 4) zu messen. Die Wirkstoff-Freisetzung kinetische Untersuchung kann getan werden, wo bekannte feste Größen der Nanopartikel in 30 Slide-A-Lyzer MINI Dialyse-Einheiten sind dialysiert werden. In festen zeitlichen Abständen wird der Inhalt in der Dialyse-Einheit gesammelt und gleichen Volumen an organischem Lösungsmittel zugesetzt wird, um die Nanopartikel zu lösen. HPLC wird an diesen Proben durchgeführt, um die Droge / cargo Inhalte zu quantifizieren.
Abbildung 1. EDC / NHS-Chemie
Abbildung 2. Nanopräzipitation Verfahren zur Herstellung von polymeren Nanopartikeln. Die organische Lösung eines Lösungsmittels (Acetonitril oder DCM), die die PEG-PLGA Diblock und das Medikament oder der Ladung in die Teilchen geladen werden zugetropft auf 3-5 ml Rühren H 2 O.
Abbildung 3. Transmission Electron Microscopy von nanopartices. Eine TEM-Aufnahme von PEG-PLGA-Nanopartikel enthalten wortamin. Phosphorwolframsäure wurde als Kontrastmittel verwendet.
Abbildung 4. Kontrollierte Freisetzung von Medikamenten aus Nanopartikeln. Freisetzung von Paclitaxel aus Nanopartikeln nach der Dialyse in PBS. Am darauf hingewiesen Zeit wurden Partikel aus Dialyse-Kassetten entnommen und solubilisiert in Acetonitril. Die Lösung wurde mittels HPLC gemessen. Zwei Losen von Nanopartikeln wurden verglichen.
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Discussion
Die Nanopräzipitation Methode mit Diblock-Copolymeren stellt eine einfache, schnelle Methode, um polymere Nanopartikel Ingenieur. Die entstehenden Nanopartikel bestehen aus einem hydrophoben Kern, der für die Lieferung von schwer löslichen Verbindungen genutzt werden können zusammengesetzt. Die Oberfläche hydrophilen Schicht ermöglicht eine ausgezeichnete Löslichkeit in Wasser und gleichzeitig eine Einheit für mögliche weitere Konjugation an ein Targeting-Liganden.
Es gibt viele Nanopartikel-Plattformen, einschließlich Liposomen, polymere Nanopartikel, Dendrimere, Metallpartikel und Quantenpunkte 14. Unter diesen Plattformen wird das polymere Nanopartikel-Plattform eine der am einfachsten zu formulieren und zu den vielseitigsten in Bezug auf Anwendungen. Es erfordert nur minimale Ausrüstung Aufbau und die Technik kann in einigen Stunden gelernt werden. Es hat auch eine breite Palette von Anwendungen und ihrer Biokompatibilität ermöglicht sowohl in vitro und in vivo-Anwendungen. Seine Fähigkeit, eine Ladung tragen können Bildgebung und therapeutische Möglichkeiten.
EDC / NHS-Chemie ist hier, um die Diblockcopolymer generieren vorgestellt. Allerdings können Blockcopolymere synthetisiert unter Verwendung verschiedener Katalysatoren sein. Eine andere häufig verwendete Katalysator ist Zinnoctoat. Die terminalen Hydroxygruppen von PEG als Einleitung Gruppen Blockcopolymere synthetisiert werden. Ring Polymerisation von Lactid und Glycolid von Dihydroxy PEG oder PEG Monomethoxy eingeleitet werden, um ABA-oder AB-Typ Block-Copolymere bzw. 15 führen. Diese Art der Herstellung ermöglicht mehr Flexibilität in der Gestaltung, aber die EDC / NHS-Chemie ist einfacher zu benutzen und können rechtzeitig mit einem kommerziell erhältlichen PLGA-Polymer zu speichern.
Neben Nanopräzipitation, zu anderen Methoden zu generieren Diblockpolymer Nanopartikeln verwendet werden können. Eine verbreitete Alternative ist ein "Öl in Wasser"-Emulsion Methode 16. Die Emulsion Methode erneut beginnt mit einer organischen Phase mit dem Diblockcopolymer und eine wässrige Phase. Doch nach dem Mischen der beiden Lösungen werden Nanopartikel durch Vortexen und Ultraschallbehandlung erzeugt. Diese Methode ist sehr ähnlich, aber die nanoprecipitaion Methode erlaubt mehr Kontrolle in der Mischstufe sowie vermeidet den Einsatz von Ultraschall.
Es gibt viele mögliche Anwendungen für diese Plattform. Erstens kann es für die Lieferung von hydrophoben / schwer löslichen Medikamenten in Drug-Delivery-Studien genutzt werden. Zum Beispiel sind Taxane schlecht löslich und erfordern ein Lösungsmittel für in-vivo-Studien. Polymere Nanopartikel können kapseln Taxan Drogen und hebt die Notwendigkeit für Lösungsmittel. Nanopartikel können auch liefern Zellbiologie Reagenzien, die schlecht löslich sind, wie Wortmannin sind. Polymer-Nanopartikel können auch mit Fluoreszenzfarbstoff beladen und genutzt werden für intrazellulären Transport Studien. Diese Polymer-Nanopartikel können konjugiert werden, um Targeting-Liganden durch die Oberfläche PEG. Kombiniert mit Fluoreszenzmarkierung, können diese gezielt Nanopartikel verwendet werden, um spezifische Epitope auf oder in Zellen zu markieren. Da jedes Nanopartikel eine große Anzahl von fluoreszierenden Molekülen kapseln kann, können die Nanopartikel verbessern die Empfindlichkeit solcher biologischer Studien. Fluoreszenzmarkierte Nanopartikel können auch in-vivo-Bildgebung genutzt werden, wie die Darstellung von Blutgefäßen und atherosklerotischen Plaques.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Golfers Against Cancer, Carolina Zentrum für Nanotechnologie Excellence Pilot gewähren, University Cancer Research Fund und National Health Institute K-12 Career Development Award finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDC | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | Conjugation Reagent |
| NHS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | Conjugation Reagent |
| amine-PEG-carboxylate | Laysan Bio Inc. | Nh2-PEG-CM-5000 | Polymer (Can use any PEG MW, 5000 is listed here) |
| PLGA-carbxylate |  Lactel |
B6013-2 | Polymer |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 34856 | Solvent |
| Acetonitrile >99% purity | Sigma-Aldrich | 34851 | Solvent |
| Methanol >99% purity | Sigma-Aldrich | 34860 | Wash |
References
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