Summary
Este artigo descreve um método para sintetizar nanoprecipitation polímero baseado em nanopartículas usando dibloco co-polímeros. Vamos discutir a síntese de dibloco co-polímeros, a técnica nanoprecipitation e aplicações potenciais.
Abstract
A nanotecnologia é um ramo relativamente novo da ciência que envolve aproveitar as propriedades únicas de partículas que são nanômetros em escala (nanopartículas). Nanopartículas podem ser projetados de forma precisa onde a química tamanho, composição e superfície pode ser cuidadosamente controlada. Isto permite uma liberdade sem precedentes para modificar algumas das propriedades fundamentais da sua carga, tais como solubilidade, de difusividade, biodistribuição características, liberação e imunogenicidade. Desde a sua criação, as nanopartículas têm sido utilizados em muitas áreas da ciência e da medicina, incluindo a entrega da droga, imagem e biologia celular 1-4. No entanto, não foi totalmente utilizado fora de "laboratórios de nanotecnologia", devido à percepção barreira técnica. Neste artigo, descrevemos um método simples para sintetizar uma plataforma de nanopartículas à base de polímeros que tem uma vasta gama de aplicações potenciais.
O primeiro passo é sintetizar uma dibloco co-polímero que tem tanto domínio de um domínio hidrofóbico e hidrofílico. Utilizando PLGA e PEG como polímeros de modelo, descrevemos uma reação de conjugação usando EDC / NHS química 5 (Fig. 1). Discutimos também o processo de purificação de polímeros. O dibloco sintetizado co-polímero pode auto-organizar em nanopartículas no processo nanoprecipitation através hidrofóbico-hidrofílico interações.
A nanopartícula de polímero descrito é muito versátil. O núcleo hidrofóbico da nanopartícula pode ser utilizado para transportar drogas pouco solúveis para a entrega da droga experiments6. Além disso, as nanopartículas podem superar o problema de solventes tóxicos para pouco solúveis reagentes de biologia molecular, tais como wortmannin, o que exige um solvente como o DMSO. No entanto, DMSO pode ser tóxico para as células e interferir com o experimento. Estes fármacos pouco solúveis e reagentes podem ser efetivamente entregue usando nanopartículas poliméricas com toxicidade mínima. Nanopartículas poliméricas também pode ser carregado com corante fluorescente e utilizados para estudos de tráfico intracelular. Por fim, essas nanopartículas de polímeros pode ser conjugado com a segmentação ligantes através PEG superfície. Tais nanopartículas alvo pode ser utilizada para rotular epítopos específicos em células ou em 10/07.
Protocol
1. Síntese de PLGA-b-polímero PEG
- Poli (D, L-ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA) com terminal grupos carboxilato (PLGA-carboxilato) é dissolvido em qualquer solvente para PLGA (como mencionado na seção de materiais) na concentração de 5mM. PLGA pode ser dissolvido nesta concentração com agitação suave.
- Ambos NHS (peso molecular 115,09) e EDC (peso molecular 191,7) são dissolvidos na solução PLGA em uma concentração de 25mM. (Ambos EDC e NHS são adicionados em um excesso estequiométrico de 5 vezes comparado ao PLGA). PLGA-carboxilato é convertida em PLGA-NHS adicionando EDC e NHS para PLGA-carboxilato solução com agitação suave por cerca de 1 hora.
- O produto da reação PLGA-NHS é precipitado pela adição de metanol a solução de lavagem. Aproximadamente 10 vezes excesso de volume de metanol é adicionado à solução. A solução é centrifugada a 2000 xg para precipitar o PLGA-NHS e desprezar o sobrenadante (remove os traços de EDC e NHS. Este procedimento de lavagem com metanol é repetido pelo menos três vezes.
- O pellet PLGA-NHS é seco sob vácuo por 30 minutos para remover qualquer vestígio da solução desengraxante.
- O pellet PLGA-NHS é agora re-dissolvido no mesmo solvente na mesma concentração que foi usado inicialmente para dissolver PLGA. O PEG heterobifunctional (PEG-amina-carboxilato) é então adicionado à solução PLGA na concentração de 5mM (relação estequiométrica de 1:1). A solução mistura é incubada por 24 horas, com agitação constante.
- Após 24 horas, o produto da reação PLGA-b-PEG copolímero em bloco é precipitado pela adição de metanol a solução de lavagem em excesso. Repita o processo de lavagem e centrifugação, tal como mencionado acima três vezes. Isto irá remover todos os PEG em excesso que não reagiu.
- O PLGA-b-PEG copolímero em bloco é seco sob vácuo.
2. PLGA-b-PEG preparação de nanopartículas
Nanopartículas de PLGA com núcleo coberto com PEG na superfície podem ser preparados com estes copolímeros dibloco. Uma variedade de diferentes drogas hidrofóbicas podem ser encapsulados em nanopartículas tal. Compostos fluorescentes podem ser encapsulados em nanopartículas de ou pode ser conjugado com PLGA e, portanto, essas nanopartículas podem ser usadas para imagens de fluorescência.
Nanoprecipitation método é usado para fazer as nanopartículas especialmente quando a carga desejada para ser encapsulado é altamente hidrofóbico na natureza.
- O PLGA-b-PEG copolímero em bloco ea droga / carga (a ser encapsulados) são dissolvidos em qualquer solvente que dissolve PLGA. PLGA pode ser dissolvido por muitos solventes comuns, incluindo acetonitrila, DCM, tetrahidrofurano, acetona ou acetato de etila. A escolha do solvente é fundamental, pois influencia as propriedades de nanopartículas. Assim, solvente apropriado deve ser usado nesta etapa.
- A mistura de polímero / medicamento é então adicionado gota a gota a 3-5 volumes de água mexendo, dando uma concentração de polímero final de cerca de 3 mg / mL. (Fig. 2)
- A agitação é mantida por 2 horas sob pressão reduzida para permitir que as nanopartículas para formar por auto-montagem e remover vestígios do solvente orgânico.
- Colheita e purificação: As nanopartículas são, então, concentrada por centrifugação a 2.700 x g por 10 min, utilizando um filtro Amicon (MWCO 20KDa), lavado e reconstituída em PBS. Isso remove todas as cargas não-entrapped droga /. Caracterizações básicas biofísicos, tais como tamanho, carga superficial, e eficiência de carregamento de drogas podem ser realizados para melhor compreender as propriedades das nanopartículas.
3. Armazenamento
Liofilização é um método comumente usado para armazenar nanopartículas 11. Liofilização vai preservar as características físicas e químicas das nanopartículas para a estabilidade a longo prazo 12. O processo de liofilização pode causar estresse sobre as partículas e desestabilizar a formulação, por isso crio-protetores (proteção contra o estresse de congelamento) e lyo-protetores (proteção contra o estresse de secagem) são comumente usados. A escolha destes protetores é determinada pelo comprimento desejado do tempo de armazenamento 13.
- Na liofilização, há a solidificação total da amostra por congelamento abaixo de sua Tg.
- Na etapa de secagem, o gelo é removido por sublimação. Temperatura e pressão devem ser otimizados para atingir um processo de liofilização eficiente.
4. Resultados representativos:
Caracterização de Copolímero Di-bloco PLGA-b-PEG
Diferentes técnicas podem ser usadas para confirmar a conjugação de sucesso de polímeros. A composição do PLGA-PEG-b podem ser caracterizadas usando um 400 MHz 1H de ressonância magnética nuclear (RMN). Peso molecular do produto formado (PLGA-b-PEG) pode ser verificada por cromatografia de permeação em gel (GPC). O PLGA-b - PEG repartição do peso molecularn curva e tempo de eluição deve ser diferente do PLGA e sozinho PEG. Em conjunto, essas técnicas devem caracterizar o produto formado e determinar se a reação de conjugação foi bem sucedida.
Caracterização de PLGA-b-PEG nanopartículas
Tamanho das partículas e distribuição de tamanho pode ser medido por espalhamento de luz dinâmico. Diferentes parâmetros no processo nanoprecipitation afetar o tamanho das partículas. Peso molecular dos polímeros usados inicialmente (ambos PLGA e PEG) também efeito da distribuição de tamanho de partícula. Microscopia eletrônica de transição (TEM) também pode ser usado para confirmar a distribuição do tamanho e estrutura das nanopartículas como visto na figura 3. A faixa de tamanho de partícula é geralmente na faixa de nm. Tamanhos de partículas grandes, com distribuição de tamanho irregular pode indicar um erro na reação de conjugação ou o método de otimização nanoprecipitation necessidades. Além disso, o potencial zeta da superfície pode ser medida por ZetaPALS.
A eficiência de carregamento de drogas / carga pode ser quantificado com o padrão HPLC.
As partículas são dissolvidos em solvente orgânico e HPLC pode ser realizada para medir a absorvância da droga / carga (Fig. 4). O estudo de liberação do fármaco cinética pode ser feito quando conhecidos quantidades fixas das nanopartículas são dialisada em 30 Slide-A-Lyzer unidades de diálise MINI. Em intervalos fixos, o conteúdo na unidade de diálise é coletado e volume igual de solvente orgânico é adicionado para dissolver as nanopartículas. HPLC é feito sobre essas amostras para quantificar o conteúdo de drogas / carga.
Figura 1. EDC / NHS química
Figura 2. Nanoprecipitation método para a preparação de nanopartículas poliméricas. A solução orgânica de um solvente (acetonitrila ou DCM) que contém o dibloco PEG-PLGA ea droga ou carga a ser carregada para a partícula é adicionado gota a gota a 3-5 mL de H 2 O. mexendo
Figura 3. Microscopia eletrônica de transmissão de nanopartices. A imagem TEM de PEG-PLGA contendo nanopartículas wortamin. Ácido fosfotúngstico foi usado como um agente de contraste.
Figura 4. Liberação controlada de drogas a partir de nanopartículas. Liberação de paclitaxel a partir de nanopartículas após a diálise em PBS. No momento observado, as partículas foram retirados a partir de cassetes de diálise e solublized em acetonitrila. A solução foi medido por HPLC. Dois lotes separados de nanopartículas foram comparados.
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Discussion
O método nanoprecipitation usando dibloco co-polímeros representa um método simples e rápida de engenheiro nanopartículas poliméricas. As nanopartículas resultantes são compostos por um núcleo hidrofóbico que pode ser utilizado para a entrega de compostos pouco solúveis. A camada de superfície hidrofílica permite excelente solubilidade em água, proporcionando uma porção de conjugação mais potencial para um ligante alvo.
Existem plataformas de nanopartículas muitos, incluindo os lipossomas, as nanopartículas poliméricas, dendrímeros, partículas de metal, e pontos quânticos 14. Entre essas plataformas, a plataforma de nanopartículas poliméricas é um dos mais fáceis de formular e o mais versátil em termos de aplicações. Ela exige configuração mínima de equipamentos ea técnica pode ser aprendida em algumas horas. Ele também tem uma ampla gama de aplicações e permite sua biocompatibilidade in vitro e em aplicações in vivo. Sua capacidade de transportar uma carga permite imagens e capacidades terapêuticas.
EDC / NHS química é apresentada aqui para gerar o copolímero dibloco. No entanto, copolímeros em bloco podem ser sintetizados usando catalisadores diferentes. Outro catalisador comumente utilizado é octoato estanoso. Os grupos hidroxila terminal de PEG são usados como o início de grupos para sintetizar copolímeros em bloco. Polimerização anel de ácido lático e ácido glicólico iniciado por dihidroxi PEG ou PEG monometoxi pode levar a ABA ou copolímeros de bloco do tipo AB, respectivamente 15. Este método de preparação dá mais flexibilidade no design, no entanto a química EDC / NHS é mais fácil de usar e pode poupar tempo usando um polímero PLGA disponíveis comercialmente.
Além nanoprecipitation, outros métodos para gerar nanopartículas de polímeros dibloco pode ser usado. Uma alternativa comum é um "óleo em água" método de emulsão 16. O método de emulsão de novo começa com uma fase orgânica contendo o copolímero dibloco e uma fase aquosa. No entanto, após misturar as duas soluções, as nanopartículas são gerados através de vórtex e sonicando. Este método é muito semelhante, mas o método nanoprecipitaion permite mais controle na etapa de mistura, bem como evita o uso de sonicação.
Existem muitas possíveis aplicações para esta plataforma. Primeiro, ele pode ser utilizado para a entrega do hidrofóbico / fármacos pouco solúveis em estudos de entrega da droga. Por exemplo, taxanos são pouco solúveis e exigem um solvente para estudos in vivo. Nanopartículas poliméricas podem encapsular drogas taxano e revogará a necessidade de solventes. Nanopartículas também podem entregar os reagentes de biologia celular que são pouco solúveis, como wortmannin. Nanopartículas poliméricas também pode ser carregado com corante fluorescente e utilizados para estudos de tráfico intracelular. Estas nanopartículas de polímeros pode ser conjugado com a segmentação ligantes através PEG superfície. Combinado com marcação fluorescente, essas nanopartículas alvo pode ser usado para rotular epítopos específicos sobre ou dentro de células. Uma vez que cada nanopartícula pode encapsular um grande número de moléculas fluorescentes, as nanopartículas podem melhorar a sensibilidade de tais estudos biológicos. Nanopartículas fluorescentes rotulados também pode ser utilizado para in vivo de imagem, como a visualização dos vasos sanguíneos e placas ateroscleróticas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Golfers Contra o Câncer, Carolina Centro de Nanotecnologia Excelência Pilot concessão, Cancer Research Fund e Universidade Nacional de Saúde Instituto K-12 Prêmio de Desenvolvimento de Carreira.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDC | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | Conjugation Reagent |
| NHS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | Conjugation Reagent |
| amine-PEG-carboxylate | Laysan Bio Inc. | Nh2-PEG-CM-5000 | Polymer (Can use any PEG MW, 5000 is listed here) |
| PLGA-carbxylate |  Lactel |
B6013-2 | Polymer |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 34856 | Solvent |
| Acetonitrile >99% purity | Sigma-Aldrich | 34851 | Solvent |
| Methanol >99% purity | Sigma-Aldrich | 34860 | Wash |
References
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