Summary
Bu makale diblock co-polimerler kullanarak polimer bazlı nanopartiküller sentezlemek için nanoprecipitation yöntem açıklanır. Biz diblock sentezi co-polimerler, nanoprecipitation tekniği ve potansiyel uygulamalar ele alınacaktır.
Abstract
Nanoteknoloji harnessing ölçekte nanometre (nanopartiküller) parçacıkların eşsiz özelliklerini içerir nispeten yeni bir bilim dalıdır. Nanopartiküller boyutları, bileşimi ve yüzey kimyası dikkatli bir şekilde kontrol edilebilir kesin bir biçimde tasarlanmış olabilir. Bu onların kargo temel özellikleri, çözünürlük, yayınım, biodistribution, sürüm özellikleri ve immünojenite gibi bazı değiştirmek için benzeri görülmemiş bir özgürlük sağlar. , Kuruluşundan bu yana, nanoparçacıkların, ilaç dağıtım, görüntüleme ve hücre biyolojisi 1-4 da dahil olmak üzere birçok alanda, bilim ve tıp kullanılmıştır. Ancak, tam olarak algılanan teknik bir engel nedeniyle "nanoteknoloji laboratuvarları dışında kullanılmıştır değildir. Bu makalede, potansiyel uygulamaları çok geniş bir yelpazesi olan bir polimer esaslı nanoparçacık platformu sentezlemek için basit bir yöntem açıklanmaktadır.
Hidrofobik bir etki alanı ve hidrofilik etki alanı hem de bir diblock co-polimer sentezlemek için ilk adım. PLGA ve PEG model polimerler olarak kullanarak, EDC / NHS kimya 5 (Şekil 1) kullanarak bir konjugasyon tepki nitelendirdi. Ayrıca polimer arınma süreci tartışacağız. Sentezlenmiş diblock co-polimer hidrofilik-hidrofobik etkileşimler yoluyla nanoprecipitation sürecinde nanopartiküller içine kendi kendine bir araya getirebilirsiniz.
Açıklanan polimer nanoparçacık çok yönlü. Nanoparçacık hidrofobik çekirdek ilaç dağıtım experiments6 için az çözünen ilaç taşımak için kullanılabilir. Ayrıca, nanopartiküller, DMSO gibi bir çözücü gerektirir wortmannin az çözünür moleküler biyoloji reaktifleri, toksik solventlerin sorunun üstesinden gelebilir. Bununla birlikte, DMSO hücreleri için toksik ve deney ile müdahale edebilirsiniz. Bu kötü çözünen ilaçlar ve reaktifler etkili minimal toksisite ile polimer nanopartiküller kullanılarak teslim edilebilir. Polimer nanoparçacıkların da floresan boya ile yüklenir ve hücre içi ticareti çalışmaları için kullanılmaktadır. Son olarak, bu polimer nanopartiküller yüzey PEG yoluyla ligandlar hedefleyen konjuge olabilir. Bu hedef nanopartiküller 7-10 veya hücreleri belirli epitoplar etiket kullanılabilir.
Protocol
1. PLGA-b-PEG polimerin sentezi
- Terminali karboksilat grupları ile poli (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA) (PLGA-karboksilat) 5mM bir konsantrasyon PLGA (malzeme bölümünde belirtildiği gibi) için herhangi bir çözücü içinde çözülür. PLGA nazik karıştırma bu konsantrasyonda çözünmüş olabilir.
- NHS (moleküler ağırlığı 115,09) ve EDC (molekül ağırlığı 191,7) 25mm bir konsantrasyon PLGA çözelti içinde çözülür. (EDC ve NHS PLGA kıyasla 5 kat aşan bir stokiyometrik eklenir). PLGA-karboksilat EDC ve NHS ekleyerek yaklaşık 1 saat için nazik karıştırma PLGA-karboksilat çözüm için PLGA-NHS dönüştürülür.
- Reaksiyon ürünü PLGA-NHS yıkama solüsyonu metanol eklenerek çöktürülür. Metanol yaklaşık 10 kat fazla hacim çözüm eklenir. Çözüm çökelti PLGA-NHS ve supernatant atın (EDC ve NHS izlerini ortadan kaldırır. Metanol ile yıkama Bu işlem en az üç kez tekrarlanır xg 2000 santrifüj edilir.
- PLGA-NHS pelet yıkama solüsyonu tüm izlerini silmek için 30 dakika süreyle vakum altında kurutulur.
- PLGA-NHS pelet PLGA çözmek için başlangıçta kullanılan aynı konsantrasyonda aynı çözücü yeniden çözülür. Heterobifunctional PEG (amin-PEG-karboksilat) sonra 5mM bir konsantrasyon PLGA çözüm eklenir (1:1 stokiyometrik oranı). Karışımı bir çözüm sürekli karıştırarak 24 saat inkübe edilir.
- 24 saat sonra, reaksiyon ürünü PLGA-b-PEG blok kopolimer aşırı yıkama solüsyonu metanol eklenerek çöktürülür. Üç kez Yukarıda da belirtildiği gibi yıkama ve santrifüj işlemi tekrarlayın. Bu, tüm aşırı girmemiş PEG kaldıracaktır.
- PLGA-b-PEG blok kopolimer, vakum altında kurutulur.
2. PLGA-b-PEG nanoparçacık hazırlık
Yüzeyde PEG ile kaplı PLGA çekirdekli Nanopartiküller bu diblock kopolimerler hazırlanabilir. Bir dizi farklı hidrofobik ilaçlar gibi nanopartiküller kapsüllü olabilir. Floresan bileşikler nanopartiküller kapsüllü olabilir veya PLGA konjuge ve böylece bu nanopartiküller floresan görüntüleme için kullanılabilir olabilir.
Nanoprecipitation yöntem özellikle kapsüllü olması istenen kargo son derece doğal hidrofobik nanopartiküller yapmak için kullanılır.
- PLGA-b-PEG blok kopolimeri ve uyuşturucu / kargo (kapsüllü) PLGA çözünür olan herhangi bir çözücü içinde çözülür. PLGA asetonitril, DKMP, tetrahidrofuran, aseton veya etil asetat da dahil olmak üzere pek çok ortak çözücüler tarafından çözülebilir. Nanoparçacık özelliklerini etkiler olarak solvent seçimi kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, uygun bir çözücü bu adımda kullanılmalıdır.
- Polimer / ilaç karışımı daha sonra yaklaşık 3 mg / ml son bir polimer konsantrasyonu vererek su karıştırarak 3-5 birimlere damla damla eklenir. (Şekil 2)
- Karıştırarak nanopartiküller self-assembly oluşturmak için izin ve organik çözücü izlerini kaldırmak için düşük basınç altında 2 saat boyunca devam eder.
- Hasat ve saflaştırma: nanopartiküller sonra yıkanmış bir Amicon filtresi (MWCO 20KDa) kullanarak 10 dakika için 2.700 x g santrifüj konsantre ve PBS içinde sulandırılmış. Bu tüm un-sürüklenen bir ilaç / kargo kaldırır. Temel biyofiziksel boyut gibi nitelendirmeler, yüzey yükü ve ilaç yükleme verimliliğini nanoparçacıkların özelliklerini daha iyi anlamak için yapılabilir.
3. Depolama
Dondurma-kurutma nanopartiküller 11 depolamak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Dondurma-kurutma, uzun vadeli istikrar için 12 nanopartiküller fiziksel ve kimyasal özellikleri koruyacaktır . Dondurarak kurutma işlemi parçacıklar üzerinde strese neden ve formülasyon istikrarsızlaştırmak, cryo-koruyucu (donma stresinden koruma) ve LYO-koruyucu (kurutma stres koruma) yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu koruyucu seçim saklama süresi 13 istenilen uzunluğa göre belirlenir.
- Dondurarak kurutma, toplam katılaşma, Tg donma noktasının altına örnek vardır.
- Kuruma adım, buz süblimasyonu kaldırılır. Sıcaklık ve basınç etkili bir dondurarak kurutma işlemi ulaşmak için optimize edilmelidir.
4. Temsilcisi sonuçları:
PLGA-b-PEG Di-blok kopolimeri Karakterizasyonu
Polimerlerin başarılı konjugasyon onaylamak için farklı teknikler kullanılabilir. PLGA-b-PEG kompozisyon, 400 MHz 1H nükleer manyetik rezonans (NMR) ile karakterize edilebilir. Jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) oluşan ürün Moleküler ağırlığı (PLGA-b-PEG) tarafından kontrol edilebilir. PLGA-b-PEG molekül ağırlığı distribution eğrisi ve elüsyon zaman PLGA ve PEG tek başına farklı olmalıdır. Birlikte, bu tekniklerin oluşan ürün karakterize ve konjugasyon reaksiyon başarılı olup olmadığını belirlemek gerekir.
PLGA-b-PEG Karakterizasyonu nanopartiküller
Partikül boyut ve boyut dağılımı, dinamik ışık saçılması ile ölçülebilir. Nanoprecipitation süreç içinde farklı parametreler partiküllerin boyutunu etkileyebilir. Başlangıçta kullanılan polimerler (PLGA ve PEG) Moleküler ağırlıkları da tanecik boyut dağılımı etkisi. Geçiş elektron mikroskobu (TEM) de Şekil 3'te görüldüğü gibi nanopartiküllerin boyut dağılımı ve yapısını onaylamak için kullanılabilir. Partikül boyutu aralığı nm aralığında genellikle. Düzensiz boyut dağılımı ile büyük parçacık boyutları ya nanoprecipitation yöntemi ihtiyaçlarını optimizasyonu konjugasyon reaksiyon veya bir hata olduğu anlamına gelebilir. Buna ek olarak, yüzey zeta potansiyel ZetaPALS tarafından ölçülebilir.
Uyuşturucu / kargo yükleme verimliliği standart HPLC ile belirlenebilir.
Parçacıklar organik çözücü ve HPLC çözülür ilaç / kargo (Şekil 4) absorbansı ölçmek için yapılabilir. Nanopartiküller sabit miktarları 30 Slayt-A-Lyzer MINI Diyaliz üniteleri diyalize bilinen yerlerde ilaç salım kinetik çalışmada yapılabilir. Sabit zaman aralıklarında içerik, diyaliz ünitesinde toplanan ve eşit miktarda organik çözücü nanopartiküller çözmek için eklenir. HPLC, uyuşturucu / kargo içeriği ölçmek için bu numuneler üzerinde yapılır.
Şekil 1. EDC / NHS kimya
Şekil 2. Polimerik nanopartiküller hazırlamak için Nanoprecipitation yöntemi. PEG-PLGA diblock ve parçacık yüklü olması uyuşturucu ya da kargo içeren (acetonitrile veya DCM) bir çözücü organik çözelti 3-5 mL H 2 O karıştırarak damla damla eklenir
Şekil 3. Nanopartices Transmisyon Elektron Mikroskobu PEG-PLGA TEM görüntü wortamin içeren nanopartiküller. Fosfotungstik asit, bir kontrast madde olarak kullanılmıştır.
Şekil 4. PBS içinde diyaliz sonra nanopartiküller Paklitakselin nanoparçacık ilaç kontrollü salım Release. Kaydetti zamanda parçacıklar diyaliz kaset çıkarıldı asetonitril'de solublized. Çözüm HPLC ile ölçüldü. İki ayrı nanoparçacıkların birçok karşılaştırıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diblock co-polimerler kullanarak nanoprecipitation yöntem polimer nanopartiküller mühendisi basit ve hızlı bir yöntem temsil eder. Nanopartiküller az çözünebilir bileşiklerin teslimat için kullanılabilir bir hidrofobik çekirdeğin oluşmaktadır. Bir hedefleme ligand potansiyeli daha fazla konjugasyon için benzer parçaları sağlarken hidrofilik yüzey tabakası mükemmel sulu çözünürlük sağlar.
Lipozomlar dahil olmak üzere birçok nanoparçacık platformları, polimerik nanoparçacıkların, dendrimers, metal parçacıklar ve kuantum noktaları 14 vardır. Bu platformlar arasında, polimerik nanoparçacık platformu uygulamaları açısından formüle etmek için en kolay ve en çok yönlü biridir. Bu minimum donanım kurulum gerektirir ve birkaç saat içinde tekniğini öğrenmiş olabilir. Aynı zamanda geniş bir uygulama yelpazesine sahiptir ve biyouyumluluk hem de in vitro ve in vivo uygulamaları sağlar. Bir kargo taşıma kabiliyetini görüntüleme ve tedavi edici özellikleri sağlar.
EDC / NHS kimya diblock kopolimer oluşturmak için burada sunulmuştur. Ancak, blok kopolimerler farklı katalizörler kullanılarak sentezlenebilir. Sıklıkla kullanılan diğer bir katalizör kalay octoate. PEG terminal hidroksil grupları blok kopolimerler sentezlemek için gruplar başlatılması olarak kullanılır. Dihidroksi PEG veya monometoksi PEG tarafından başlatılan lactide ve glycolide Ring polimerizasyon ABA veya AB tipi blok kopolimerler sırasıyla 15 yol açabilir. Bu yöntem, hazırlık tasarımında daha fazla esneklik sağlar, ancak EDC / NHS kimya kullanımı daha kolaydır ve ticari PLGA polimer kullanarak zamandan tasarruf edebilirsiniz.
Nanoprecipitation yanı sıra, diğer yöntemler diblock polimer nanopartiküller kullanılabilir oluşturmak için. Ortak bir alternatif emülsiyon yöntemi 16, "su içinde yağ" . Emülsiyon yöntemi tekrar diblock kopolimer ve sulu bir faz içeren organik bir aşaması ile başlar. Ancak, iki çözüm karıştırma üzerine nanopartiküller vorteks ve sonicating yoluyla üretilir. Bu yöntem çok benzer, ancak nanoprecipitaion yöntemi karıştırma adım gibi daha fazla kontrol sonication kullanımı önler sağlar.
Bu platform için birçok potansiyel uygulamalar vardır. İlk olarak, ilaç dağıtım çalışmaları hidrofobik / kötü çözünen ilaçlar teslimat için kullanılabilir. Örneğin, taksanlar az çözünür ve in vivo çalışmalar için bir çözücü gerektirir. Polimerik nanopartiküller taksan ilaçların saklanması ve çözücüler için ihtiyacı ortadan kaldırmaz. Nanopartiküller gibi wortmannin gibi, kötü çözünür hücre biyolojisi reaktifler de sunabilirsiniz. Polimer nanoparçacıkların da floresan boya ile yüklenir ve hücre içi ticareti çalışmaları için kullanılmaktadır. Bu polimer nanopartiküller yüzey PEG yoluyla ligandlar hedefleyen konjuge olabilir. Floresan etiketleme ile birlikte, bu hedefe yönelik nanopartiküller hücreleri üzerinde veya belirli epitoplar etiketlemek için kullanılabilir. Her nanoparçacık floresan moleküllerin çok sayıda sarabiliriz nanopartiküller biyolojik çalışmalar duyarlılığı artırabilir. Floresan etiketli nanopartiküller gibi, kan damarları ve aterosklerotik plakların görselleştirme gibi, in vivo görüntüleme için kullanılacaktır .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kanser, Carolina Nanoteknoloji Mükemmeliyet Pilot hibe Üniversitesi Kanser Araştırma Fonu ve Ulusal Sağlık Enstitüsü K-12 Kariyer Geliştirme Ödülü Merkezi Karşı Golfçüler tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDC | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | Conjugation Reagent |
| NHS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | Conjugation Reagent |
| amine-PEG-carboxylate | Laysan Bio Inc. | Nh2-PEG-CM-5000 | Polymer (Can use any PEG MW, 5000 is listed here) |
| PLGA-carbxylate |  Lactel |
B6013-2 | Polymer |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 34856 | Solvent |
| Acetonitrile >99% purity | Sigma-Aldrich | 34851 | Solvent |
| Methanol >99% purity | Sigma-Aldrich | 34860 | Wash |
References
- Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Goëpferich, A. Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).
- Bulte, J. W. M. Nanoparticles in Biomedical Imaging. 3, (2008).
- Omid, C., Farokhzad, R. L. Impact of Nanotechnology on Drug Delivery. ACS NANO. 3, 16-20 (2009).
- Li, Y. -P., Pei, Y. -Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats. Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , 2nd Edition, (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. W. Biodegradable block copolymers as injectable drug-delivery systems. Nature. 388, 860-862 (1997).
- Yoo, H. S., Park, T. G. Folate receptor targeted biodegradable polymeric doxorubicin micelles. Journal of Controlled Release. 96, 273-283 (2004).
- Cheng, J., Teply, B. A., Sherifi, I., Sung, J., Luther, G., Gu, F. X., Levy-Nissenbaum, E., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles for In Vivo Targeted Drug Delivery. Biomaterials. 28, 869-876 (2007).
- Gu, F., Zhang, L. F., Teply, B. A., Mann, N., Wang, A., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers. Proceedings of the National Academy of Science. 105, 2586-2591 (2008).
- Sanna, V., Pintus, G., Roggio, A. M., Punzoni, A., Posadino, A. M., Arca, A., Marceddu, S., Bandiera, P., Uzzau, S., Sechi, M. Targeted Biocompatible Nanoparticles for the Delivery of (-)-Epigallocatechin 3-Gallate to Prostate Cancer Cells. J. Med. Chem. 54, 1321-1332 (2011).
- Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58, 1688-1713 (2006).
- Holzer, M., Vogel, V., Mäntele, W., Schwartz, D., Haase, W., Langer, K. Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 428-437 (2009).
- Lee, M. K., Kim, M. Y., Kim, S., Lee, J. Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).
- Wang, A. Z. Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications. Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. W. Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers. J. Control Release. 63, 155-163 (2000).
- Gref, R. Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres. Science. 263, 1600-1603 (1994).
