Summary
本文介绍了nanoprecipitation方法使用嵌段共聚物的合成聚合物为基础的纳米粒子。我们将讨论合成的嵌段共聚物，nanoprecipitation技术，和潜在的应用。
Abstract
纳米技术是一项相对较新的科学的分支，它涉及到利用规模的纳米颗粒（纳米颗粒）的独特性能。纳米粒子可以被设计在一个精确的时尚，他们的规模，组成和表面化学可仔细控制。这使前所未有的自由，他们的货物的基本特性，如溶解度，扩散，生物分布，释放特性和免疫原性，修改一些。自创建以来，已经利用纳米粒子科学和医学的许多领域，包括药物递送，成像和细胞生物学 1-4 。但是，它并没有得到充分利用“纳米技术实验室”由于感知技术壁垒之外。在这篇文章中，我们描述了一个简单的方法合成的聚合物为基础的纳米颗粒平台，具有广泛的应用潜力。
第一步是合成一个嵌段共聚物，既是一个疏水区和亲水域。使用模型聚合物PLGA和PEG，我们描述了共轭反应，使用EDC / NHS的化学 5（图1） 。我们还讨论了聚合物的净化过程。合成的嵌段共聚物可以自组装在nanoprecipitation过程中通过疏水 - 亲水相互作用成纳米粒子。
所描述的聚合物纳米粒子是非常灵活。可以利用纳米颗粒的疏水核心，进行药物输送experiments6难溶性药物。此外，纳米粒子可以克服难溶性的分子生物学试剂，如渥曼青霉素，这就需要一个像DMSO溶剂，有毒溶剂的问题。然而，二甲基亚砜细胞毒性，干扰实验。这些难溶性药物和试剂，可以有效地交付使用聚合物纳米粒子的毒性极小。高分子纳米粒子也可以被载入与荧光染料和细胞内贩卖的研究利用。最后，这些聚合物纳米粒子可以通过表面的PEG目标配体的结合。这些有针对性的纳米粒子，可以利用标签或细胞中的7-10的特定抗原决定簇。
Protocol
1。 PLGA - B - PEG聚合物的合成
- 聚（D，L -乳酸- CO -乙醇酸）（PLGA）终端羧基 - 羧酸（PLGA）是溶解在浓度为5mm的PLGA（材料一节中提到的）在任何溶剂。 PLGA可以在这个浓度轻轻搅拌溶解。
- 国民保健服务（分子量115.09）和EDC（分子量191.7）溶解在PLGA溶液浓度为25mm。 （EDC和NHS在添加了5次计量过剩相比，以PLGA）。 PLGA -羧酸转化为PLGA - NHS轻轻搅拌约1小时的PLGA - 羧酸溶液加入EDC和NHS。
- 反应产物PLGA - NHS加入甲醇洗涤液沉淀出来。约10倍体积的甲醇过量添加到解决方案。解决的办法是在2000年的离心XG沉淀出PLGA - NHS和上清液（EDC和NHS删除的痕迹，这与甲醇洗涤过程至少重复3次。
- PLGA - NHS颗粒是下一个30分钟的洗涤液中取出任何痕迹的真空干燥。
- 现在重新PLGA - NHS沉淀溶解在相同的溶剂，在相同浓度最初是用来溶解的PLGA。异型聚乙二醇（胺 - 聚乙二醇 - 羧酸），然后加入浓度为5mm的PLGA溶液（配比1:1）。混合溶液中孵育24小时并不断搅拌。
- 24小时后，反应产物PLGA - B - PEG嵌段共聚物沉淀，加入过量的洗涤液甲醇。重复三次以上所述的洗衣机和离心过程。这将删除所有多余的未反应的聚乙二醇。
- PLGA - B - PEG嵌段共聚物，是在真空条件下干燥。
2。 PLGA - B - PEG纳米粒子的制备
这些嵌段共聚物PLGA的核心与PEG在表面覆盖的纳米粒子可以准备。在这种纳米粒子，可封装各种不同的疏水性药物。荧光化合物可以被封装在纳米粒子或可结合的PLGA，因此，这些纳米粒子可以被用于荧光成像。
Nanoprecipitation方法是用来制造纳米粒子，尤其是当封装所需的货物是高度疏水的性质。
- PLGA - B - PEG嵌段共聚物和药物/货运（封装）溶于任何溶剂溶解的PLGA。 PLGA的可溶于许多共同的溶剂，包括乙腈，DCM，四氢呋喃，丙酮或乙酸乙酯。溶剂的选择是至关重要的，因为它影响纳米粒子的性质。因此，应该用适当的溶剂，在这一步。
- 聚合物/药物混合，然后滴加3-5卷搅拌水，给人一种最终聚合物浓度约300毫克/毫升。 （图2）
- 搅拌是持续了2小时减压，让纳米粒子自组装形成的有机溶剂中删除的痕迹。
- 采伐和净化：纳米粒子，然后集中在2700 X克离心10分钟使用Amicon过滤器（截留分子量20KDa），洗净，在PBS重组。这将删除所有联合国包埋药物/货物。可以进行基本的生物物理表征，如大小，表面电荷，和载药效率，更好地了解纳米粒子的性质。
3。存储
冷冻干燥是一种常用的方法来存储纳米粒子 11 。冷冻干燥将保持长期稳定的12纳米粒子的物理和化学特性。冷冻干燥过程中可能会导致粒子的压力和破坏制定，所以常用的冷冻保护剂（保护冻结应力）和lyo防护剂（保护干燥应力）。这些防护剂的选择是由所需长度的存储时间 13 。
- 在冷冻干燥，有样品中总凝固，冻结它的Tg以下。
- 在干燥的步骤，删除冰升华。应该优化，实现了高效的冷冻干燥过程的温度和压力。
4。代表性的成果：
PLGA - B - PEG迪嵌段共聚物的表征
不同的技术可以被用来确认成功的共轭聚合物。 PLGA - B - PEG的组成，可以使用一个400 MHz 1H核磁共振（NMR）的特点。凝胶渗透色谱（GPC），形成产品的分子量（PLGA - B - PEG）可以验证。 PLGA - B - PEG分子量distributioN曲线和洗脱时间应仅PLGA和PEG不同。结合，这些技术特点而形成的产品，并确定是否成功的共轭反应。
PLGA - B - PEG表征
可以测量动态光散射粒度和粒度分布。不同的参数，在nanoprecipitation过程中影响粒子的大小。所使用的最初的聚合物（PLGA和PEG）分子量也影响粒径分布。过渡电子显微镜（TEM）也可以用来确认图3可以看出，纳米粒子尺寸分布和结构。粒度范围一般是在纳米范围内。大颗粒大小，粒度分布不均匀，可能表明在共轭反应或nanoprecipitation方法需要优化的错误。此外，表面zeta电位可以衡量的ZetaPALS。
药物/货物装卸效率是可以量化的标准高效液相色谱法。
可以执行的颗粒溶解在有机溶剂和高效液相色谱法来衡量药物/货物（图4）的吸收。可以做药物释放动力学研究，其中已知的固定数量的纳米粒子在30滑动阿仪的微型透析单位透析。在固定的时间间隔，在透析单元的内容是收集和添加有机溶剂等体积溶解的纳米颗粒。高效液相色谱法对这些样本进行量化药物/货物内容。
图1。 EDC / NHS的化学
图2。 Nanoprecipitation准备聚合物纳米粒子的方法，含有PEG - PLGA嵌段和药物或货物装载到粒子溶剂（乙腈或DCM）的有机溶液滴加3-5毫升搅拌H 2 O
图3。传输的nanopartices电子显微镜 TEM图像的PEG - PLGA纳米粒的wortamin。磷钨酸作为造影剂。
图4。从纳米粒子药物控释纳米粒子在PBS透析后释放紫杉醇。指出，粒子被拆除透析录音带和乙腈solublized。解决的办法是用HPLC法测定。纳米粒子的两个单独的地段进行了比较。
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Discussion
nanoprecipitation方法使用嵌段共聚物是一种简单，快速的方法，工程师聚合物纳米粒子。由此产生的纳米粒子组成一个疏水核心，可用于难溶化合物的交付使用。表面的亲水层，使优良的水溶性，同时提供了可能进一步靶向配体共轭基团。
有许多纳米颗粒平台，包括脂质体，聚合物纳米粒子，树枝状，金属粒子，量子点14。在这些平台中，聚合物纳米粒子的平台是一个最简单的制定和应用方面最多才多艺的。它需要最少的设备安装和技术可以在几个小时的经验。它还具有广泛的应用范围，并在体外和体内的应用使得其生物相容性。它能够携带货物，使成像和治疗能力。
这里介绍的EDC / NHS的化学生成的嵌段共聚物。然而，嵌段共聚物，可以使用不同的催化剂合成。另一种常用的催化剂辛酸亚锡。端羟基聚乙二醇用作启动组，合成的嵌段共聚物。环聚合羟基聚乙二醇或monomethoxy聚乙二醇发起的乳酸和乙醇酸可以导致ABA或AB型嵌段共聚物分别为15。这种制备方法的设计提供了更多的灵活性，但是EDC / NHS的化学是更容易使用，可以节省时间，使用市售的PLGA聚合物。
除了以nanoprecipitation，其他方法来生成嵌段聚合物纳米粒子可以被使用。一种常见的是“水包油”的乳化方法 16 。乳液法再启动一个有机的嵌段共聚物的相和水相。然而，混合两个解决方案后，纳米粒子的生成，通过振荡和超声。这种方法非常类似，但允许在混合步骤以及更多的控制，避免了使用超声nanoprecipitaion方法。
这个平台有很多潜在的应用。首先，它可以被用于运送疏水/难溶性药物给药研究。例如，紫杉烷类化合物是难溶，需要在体内研究中的溶剂。高分子纳米粒子可以封装紫杉类药物和废溶剂需要。纳米粒子也可以提供难溶，如渥曼青霉素，细胞生物学试剂。高分子纳米粒子也可以被载入与荧光染料和细胞内贩卖的研究利用。这些聚合物纳米粒子可以通过表面的PEG目标配体的结合。结合荧光标记，这些有针对性的纳米粒子可用于标签上或在特定细胞表位。由于每个纳米粒子可以封装了大量的荧光分子，纳米粒子可以提高灵敏度等生物学研究。也可以利用荧光标记的纳米颗粒在活体成像，如血管和动脉粥样硬化斑块的可视化。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由对抗癌症，卡罗来纳州为纳米技术卓越试点补助，大学癌症研究基金会和国家卫生研究所的K - 12的职业发展奖中心的高尔夫球手。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDC | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | Conjugation Reagent |
| NHS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | Conjugation Reagent |
| amine-PEG-carboxylate | Laysan Bio Inc. | Nh2-PEG-CM-5000 | Polymer (Can use any PEG MW, 5000 is listed here) |
| PLGA-carbxylate |  Lactel |
B6013-2 | Polymer |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 34856 | Solvent |
| Acetonitrile >99% purity | Sigma-Aldrich | 34851 | Solvent |
| Methanol >99% purity | Sigma-Aldrich | 34860 | Wash |
References
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