تمتد سلاسل قصيرة من الحمض النووي مع ثابت القوة المحورية الملقط البصري

Summary

نحن توضيح استخدام القوة البصرية ملاقط ثابتة المحوري لاستكشاف الخواص الميكانيكية للجزيئات DNA قصيرة. بواسطة DNA تمتد محوريا، ونحن تقليل العوائق الفراغية والتحف التي تنشأ في التلاعب الجانبية التقليدية، مما يسمح لنا لدراسة جزيئات DNA قصيرة قدر نانومتر 100 ~.

Abstract

واحدة جزيء DNA تقنيات لتمتد أطوال محيط أقل من كيلو قاعدة محفوفة الصعوبات التجريبية. ومع ذلك، العديد من الأحداث البيولوجية مثيرة للاهتمام مثل هيستون والبروتين ملزمة بوساطة حلقات من DNA ^1،2، تحدث على هذا النطاق طول. في السنوات الأخيرة، وقد تبين الخواص الميكانيكية للDNA للعب دورا هاما في العمليات الخلوية الأساسية مثل التعبئة والتغليف من الحمض النووي في Nucleosomes للألياف الكروماتين المدمجة ^و3،4. بوضوح، ومن ثم من المهم أن نفهم الخواص الميكانيكية للمسافات قصيرة من الحمض النووي. في هذه الورقة، ونحن نقدم دليل عملي لتقنية واحدة جزيء البصرية نتف الريش التي قمنا بتطويرها لدراسة السلوك الميكانيكي للDNA مع أطوال قصيرة قدر كفاف لbasepairs بضع مئات.

العقبة الرئيسية في قطاعات تمتد قصيرة من الحمض النووي هو التي تم تصميمها بشكل عام ملاقط البصرية التقليدية لاستخدام القوة في directioن الجانبي إلى المرحلة ^5،6، (انظر الشكل 1). في هذه الهندسة، والزاوية بين حبة وساترة، والتي يتم ربط الحمض النووي، ويصبح حاد جدا لطول DNA submicron. ويجب الآن أن الموقف المحوري تمثل، والذي يمكن أن يشكل تحديا، ومنذ التمديد للالمكروية تستمر أقرب إلى ساترة، وتعزيز الآثار الفراغية. وعلاوة على ذلك، نتيجة لعدم التكافؤ في المجهرية، وتمديد الجانبي توليد مستويات مختلفة من عزم الدوران بسبب دوران الكرة المكروية في فخ البصرية منذ اتجاه التغييرات قوة رد الفعل خلال فترة التمديد.

طرق بديلة لتشغيل DNA submicron تمتد حتى ضد حواجز فريدة خاصة بهم. على سبيل المثال، يقتصر فخ مزدوج الحزمة الضوئية لتمتد من DNA حول الطول الموجي، والذي آثار التدخل نقطة بين اثنين والفخاخ من تشتت الضوء بين المجهرية تبدأ تشكل مشكلة كبيرة. استبدال واحدة من الفخاخومع micropipette على الأرجح تعاني من تحديات مماثلة. في حين يمكن للمرء أن استخدام مباشرة المحتملة المحوري لتمتد DNA سوف تكون هناك حاجة إلى وجود مخطط التقييم بالموقع لتطبيق قوة ثابتة وعرض النطاق الترددي لهذا ستكون محدودة للغاية، وخاصة في القوات منخفضة.

نحن الالتفاف على هذه المشاكل الأساسية عن طريق سحب مباشرة DNA بعيدا عن ساترة باستخدام قوة ثابتة المحوري البصرية ملاقط ^7،8. ويتحقق ذلك من خلال محاصرة حبة في منطقة خطية من الإمكانات البصرية، حيث القوة البصرية يمكن ضبطها ثابت قوة التي من خلال تعديل قوة الليزر. محاصرة داخل المنطقة الخطية أيضا بمثابة المشبك القوة البصرية على جميع DNA الذي يمتد لقرابة 350 نيوتن متر في الاتجاه المحوري. نحن في وقت واحد لتعويض الانجراف الحرارية والميكانيكية عن طريق ضبط دقة موقف المرحلة بحيث المكروية إشارة إلى تمسك ساترة لا يزال في نفس الموقف والتركيز، وهوالنماذج التالية لفترة غير محدودة تقريبا المراقبة.

Protocol

1. ملاقط الإعداد

1. يتم تقسيم شعاع من ليزر 1064 نانومتر إلى شعاعين الاستقطاب orthogonally. ويستخدم واحد لمعالجة جزيء حيوي بينما يستخدم الآخر لأغراض المعايرة (انظر الشكل 2).
2. يتم التحكم في شدة شعاع تلاعب من قبل منحرف صوتية البصرية (AOD)، في حين يتم التحكم بشكل مستقل الموقف وتركيز كل شعاع من شعاع توجيه المرايا والتلسكوبات البصرية، على التوالي.
3. ومعاد ثم الحزم مع آخر شعاع الاستقطاب والتقسيم مشروطة بمزيد من مجموعة نهائية من البصريات تصغير أملا قليلا الفتحة الخلفي من الهدف المجهر. A يفيض 50٪ للمعايرة شعاع يؤدي إلى فخ بصري ضيق، في حين أن عامل أصغر قليلا لشعاع تلاعب، ما يقرب من 20٪، ويعطي عمقا التركيز الذي يترجم إلى المنطقة أكبر عملية لإمكانية الخطية. وتركز أشعة بإحكام من قبل الكائنات PlanApo النفط 60x/1.4 المجهر الغمرECTIVE على عينة الخلية.
4. يتم الجمع بين هذا الإعداد مع ملاقط brightfield المجهر بني المنزل التي توفر الإضاءة من مصابيح الهالوجين ركزت على حجرة العينة من قبل المكثف. يتم فصل الصورة brightfield من ضوء الليزر بواسطة مرآة مزدوج اللون وتصويرها على كاميرات CCD ثم اثنين. احد اعمال CCD كوسيلة لدينا الرئيسي للحصول على البيانات وتشغيلها هو برنامج لانتاج معدلات أخذ العينات دقيقة، في حين يتم استخدام CCD صورة أخرى لمرجع واحد المكروية التي تمسك الموقف بمثابة نظام التغذية المرتدة لمراقبة للتعويض عن الانجراف في المجهر.
5. يتم وضع العينة بخشونة فيما يتعلق الهدف من مرحلة XY، ويمكن بعد ذلك وضع على وجه التحديد من قبل ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من مرحلة بيزو.
6. يتم جمع ضوء الليزر إلى الأمام المتناثرة والتي أحالها المكثف brightfield وتركز في الصعود إلى photodetector. يتم تصفية الإشارة الناتجة من خلال عامل تصفية تنعيم عند 100 كيلو هرتز، وتضخيمcquired في 200 كيلو هرتز باستخدام بطاقة دق.

2. معايرة الحجم الظاهري للحبة لموقف المحورية

1. تحميل حجرة العينة ⁹ مع تفريق حل قطرها 800 نانومتر المجهرية البوليسترين مخففة في الفوسفات مخزنة المالحة. اسمحوا الجلوس لمدة 10-15 دقيقة ثم مسح برفق مع العازلة لإزالة الزائدة المجهرية.
2. تحديد موقع المكروية تمسك بشكل عشوائي إلى ساترة وضبط ارتفاع حجرة العينة حتى المكروية حوالي 1 ميكرومتر أدناه التركيز على توليد صورة امتبائر.
3. لقياس حجم ما يبدو من الصورة، والعثور على أول مركز المكروية باستخدام نمط هندسي مطابقة ظيفة في ابفيف.
4. المقبل، إنشاء ملف تعريف كثافة شعاعي للالمكروية عن طريق حساب متوسط ​​360 درجة حول مركز كل مقطع عرضي. يمكن تركيبها في الملف شعاعي، والتي تتطابق مع حلقة بيضاء في كل من الصور brightfield، مع وظيفة من الدرجة الثانية للعثور علىذروة السطوع. ويمكن استخدام هذه المسافة بين الذروة ومركز كمقياس لحجم الظاهرة للحبة.
5. باستخدام piezostage معايرة، وزيادة تدريجيا موقف محوري من المكروية والحصول على صورة في كل موقف محوري مع الكاميرا CCD.
6. تكرار تحليل الصور لكل صورة متتالية لربط حجم الظاهرة للالمكروية مع موقعها المحوري (انظر الشكل 3). القرار المحوري حصلت عليها الأسلوب هو حوالي 1.4 نانومتر ^7.

3. رسم خرائط المحتملة البصرية من الحزم التلاعب

1. تبدأ عن طريق مواءمة collinearly شعاع شعاع تلاعب والمعايرة. شعاع المعايرة يجب أن يكون حوالي 50 ميجاوات في الفتحة الخلفي من الهدف في حين أن شعاع تلاعب ينبغي أن يكون أضعف بكثير، ويقول 10 ميغاواط.
2. مع شعاع التلاعب مغلقا، وحصر المكروية الحرة داخل مصيدة أشد بكثير من الحزم المعايرة.
3. الآن، تشغيل مانيpulation شعاع. منذ شعاع التلاعب أضعف بكثير من شعاع المعايرة، فإن الموقف المحوري للالمكروية يكون مضطرب قليلا. ويمكن قياس التغيير مما أدى إلى موقف محوري من الصور brightfield امتبائر بالفعل كما هو موضح.
4. إيقاف شعاع التلاعب ومع المكروية الذين لا يزالون محاصرين في شعاع المعايرة، تحويل التركيز المحوري لشعاع المعايرة عن طريق ضبط عدسة تلسكوبية. بدوره على شعاع التلاعب، وقياس الإزاحة لاحقة من المكروية وتكرار.
5. يمكن رسم ΔX التشريد ضد الموقف المحوري للتركيز شعاع المعايرة. الموقف المحوري المقابلة لتهجير أكبر المكروية يحدد مركز المنطقة خطية من فخ الضوئية (انظر الشكل 4).
6. الخطوة الأخيرة في الحصول على القوة البصرية من الحزم التلاعب بوصفها وظيفة للموقف المحوري يتطلب قياس دقيق للصلابة منشعاع المعايرة. للحصول على هذا، نقل المكروية، محاصرين من قبل شعاع المعايرة، إلى نحو ميكرومتر فوق سطح العدسة من خلال تعديل تلسكوبية أثناء إغلاق شعاع من التلاعب.
7. تسجيل الحركة الحرارية المحورية للالمكروية عن طريق قياس شدة الضوء المرسل مع photodetector.
8. يمكن تركيبها على الارتباط الذاتي للإشارة إلى وظيفة واحدة تسوس الأسي لإتاحة الوقت للتقلبات المستمرة. τ _Z
9. يمكن تصحيح معامل الاحتكاك الهيدروديناميكية ζ، من المكروية لقربها المجهرية إلى ^5،10 السطح. ثم يتم إعطاء صلابة من فخ المعايرة بواسطة (A المواد التكميلية رؤية وB) = _Z ζ / τ κ _Z.
10. معرفة صلابة من فخ المعايرة يسمح احد لتحويل التشريد قياس سابقا المحوري في ƒ القوة _Z = _Z κ التكامل ΔX من ثيق منحنى غلة تعيين المكاني للإمكانات البصرية المحورية من الحزم التلاعب (انظر الشكل 4).

4. تمتد على عينة من الحمض النووي

1. تحميل تحتوي على جزيئات غرفة ⁹ سطح DNA المربوطة (<1 KBP) و، مع مراعاة الصورة brightfield، ضع تركيز شعاع التلاعب قليلا فوق المجهرية غير المتمدد عن طريق ضبط التلسكوب. ثم ضبط الموقف من مرحلة حتى يتم المحاصرين واحدة من المجهرية.
2. موقف تقريبا المكروية في وسط الطائرة XY من فخ البصرية. توليد سلسلة من موجات مربع في ابفيف وإرسالها إلى AOD متكررة لتحويل شعاع الليزر وخارجها. التحكم بعناية شدة الليزر ومدة الولاية يوم لمنع التدفئة للغرفة العينة. عادة، استخدم حوالي 2 ميغاواط من الطاقة ليزر (قياس فتحة في الجزء الخلفي من الهدف) وإرسال نبضات من 200 مللي ثانية (على) و 500 مللي (إيقاف). اتساع ث مربعيجب افي إرسالها إلى AOD يكون نحو 0.5 V.
3. مشاهدة المكروية كما يتم تشغيل بشكل متكرر في فخ وخارجها، وملاحظة إذا كان ليزر يدفع أي اتجاه تفضيلية لتحريك الكرة المكروية في. حين تعديل تكرارا موقف المكروية في كل من X والاتجاه Y، من خلال التحكم في piezostage، ينبغي أن الحركة العشوائية للالمكروية تصبح موحد الخواص في الطائرة XY، على الرغم من تقييد ملحوظ عندما ليزر على.
4. المقبل، محاذاة حبة في الاتجاه Z. نبض مرة أخرى شعاع الليزر وإيقاف الوقت، هذا الوقت، وقياس الإزاحة المحورية في نفس الوقت المجهرية في الوقت الحقيقي. مركز المرحلة في المنطقة الخطية، التي هي النقطة التي تشريد Z هو أعظم.
5. بعد محاذاة دقيق في الاتجاه Z، لا بد من التحقق من أن يتركز في فخ لا تزال في الطائرة XY. إذا محاذاة XY قد تغير، يجب تكرار كل من XY Z والمواءمة حتى يتم توسيط المكروية بشكل صحيح على طول كل ثلاثةمحاور.
6. لتمتد DNA، المنحدر من شدة الليزر عن طريق إرسال إشارة إلى الجهد AOD، من 0 إلى 0.5 V V في الخطوات من 0،025 V. في كل خطوة، وسجل 400 في 100 إطارا في الثانية إطارات ومتوسط ​​لهم للحصول على الإزاحة المحورية.
7. ويمكن الآن تمديد منحنيات القوة يمكن رسم ونموذج يصلح لتعديل WLC ¹¹ (انظر المواد التكميلية B).

5. ممثل النتائج:

نقدم منحنيات التمديد للقوة تسلسل الحمض النووي الثاني: BP 1298 وتسلسل BP 247، وهذا الأخير هو أقصر تسلسل استطعنا أن تمتد بتكاثر. لفترات قصيرة من الحمض النووي، ودودة التقليدية على غرار سلسلة (WLC) النموذج لا يفسر تماما العلاقة تمديد قوة لأنه في هذه المقاييس يجب على المرء أن طول تشكل محدود الحجم والآثار صفر تمديد قوة الناشئ عن القيود الحدودية. القياسات تمديد القوة، لذلك، يجب أن يكون لائقا باستخدام نموذج WLC المحور الذي يحتوي على effectiهاء طول استمرار وامتداد القوة صفر كمعلمات مناسبا، كذلك ورد في المواد التكميلية. كفاف لفترات كبيرة من dsDNA، وطول استمرار فعالية هو ببساطة استمرار طول الاسمية (~ 50 نانومتر)، وتوسيع قوة الصفر يمكن إهمالها. لكن، وكما طول محيط يصبح أقصر من طول استمرار انخفاض فعالية أقل بكثير من 50 نانومتر والحمض النووي، وحتى في ظل قوة الصفر، ويظهر على تمديد مهمة.

وتظهر البيانات ويناسب المقابلة من منحنيات التمديد القوة في الشكل. (5) لمتواليات اثنين. من WLC تعديل تناسبها، فقد قررنا أطوال فعالة لاستمرار منها 35 نانومتر لDNA بي بي 1298 و 25 نانومتر لDNA BP 247. لأغراض التوضيح، نحن نقدم واحدة من التدابير تمديد منحنيات القوة لكل سلسة. في الممارسة العملية، فإن المرء تكرار القياسات عدة مرات والحصول على نتائج متوسط ​​جنبا إلى جنب مع الأخطاء المعيارية. يجب أن يلاحظ أيضا ثار بعد الحصول على كل منحنى لا بد من التأكد من أن يبقى محاصرا المكروية وضعه بشكل صحيح داخل المنطقة الخطية، وإلا يجب إعادة ترتيب المكروية كما هو موضح سابقا في البروتوكول.

الشكل 1 مبدأ ملاقط بصرية المحوري. (يسار) التقليدية فخ ملاقط بصرية بالقرب من التركيز. ثم يتم نقل حبة الجانبي إلى ساترة لممارسة التوتر. (الحق) في ملاقط بصرية المحوري، هو المحاصرين في المكروية بعيدا عن التركيز، في المنطقة الخطية من إمكانيات البصرية. في هذا التكوين، الذي عقد تحت البوليمر توتر دائم لمجموعة من الملحقات. وعلاوة على ذلك، وزيادة كثافة الليزر يحرك المكروية في الاتجاه المحوري.

التمثيل التخطيطي الرقم 2 منوانقسم الى اثنين من الحزم تمر الخائن شعاع الاستقطاب (PBS): ملاقط بصرية المحوري ضوء الليزر (ايفو ₄ 1064nm بدون تاريخ). شعاع التلاعب، ويمر من خلال منحرف صوتية البصرية (AOD) ويمكن تعديلها بشكل مستقل شعاع المعايرة باستخدام عدسات تلسكوبية. ومعاد ثم شعاعين باستخدام آخر PBS وركز على عينة من هدف NA عالية. في نفس الوقت، brightfield الإضاءة تستخدم لتعقب المكروية، ويمر من خلال عينة، هو الأشعة تحت الحمراء (IR) وتمت تصفيتها ثم تصويرها بواسطة كاميرات CCD اثنين، واحد من القياسات التي تأخذ في حين أن غيرها من الأعمال كجزء من التقييم نظام التحكم.

الشكل 3 معايرة الوظيفة المحورية. لمعايرة موقف محوري، ونحن الحصول على صور من امتبائر حبة تمسك ساترة غرفة في مواقف مختلفة المحوري للمرحلة. حجم مايكروونوتعطى من قبل فيري المسافة بين مركزها وموقف كثافة الذروة عن حلقة مشرقة تشكلت حول صورة المكروية. وأقحم يعرض توزيع كثافة شعاعي الذي يعطي حجم حبة.

الشكل 4 المبدأ الكامن وراء رسم خريطة المحتملة البصرية. لرسم القوة البصرية من الحزم التلاعب، يتم قياس الإزاحة المحورية أنه يدفع على المكروية محاصرين داخل شعاع المعايرة أقوى بكثير. يقع وسط المنطقة حيث الخطي هذا النزوح هو الحد الأقصى. يمكن أن تكون متكاملة قوة البصرية مقابل منحنى الوظيفة المحورية للعثور على إمكانية البصرية.

يظهر الرقم ملحق بقوة 5 المنحنى. البيانات لبي بي 1298 بي بي العشوائية و 247 (أقحم) segmenامتدت طن من dsDNA بواسطة ملاقط بصرية المحوري. وتناسب نقاط البيانات لنموذج WLC معدلة من المعادلة. أسفرت 3 (خطوط متصلة) وأطوال استمرار فعالة من 34 نانومتر ونانومتر على التوالي 25 ل1298bp و247bp.

Discussion

ملاقط البصرية التقليدية تعتمد على التغذية المرتدة إما التناظرية أو الكمبيوتر التي تسيطر عليها لتطبيق قوة ثابتة على كائن سهل الانكسار. هذه النظم ملاحظات بالموقع يجدون صعوبة في أداء حيث ظل ظروف التغيرات المفاجئة في تمديد العينة يحدث، على سبيل المثال، من من البروتين ملزمة لDNA أو خطوة السريع للمحرك الجزيئية على طول خيوط. وقد تم مؤخرا طرق مختلفة لتطبيق السلبي المستمر القوات المتقدمة. أسلوب واحد من هذا القبيل، وتستخدم لحل خطوة من بوليميريز RNA في القرار basepair، والمشاركة العاملة في المنطقة الخطية من إمكانيات الضوئية من أشعة الليزر جاوس ^12. تكيفنا هذه الطريقة للتلاعب من الجزيئات الحيوية قصيرة عن طريق إنشاء قوة ثابت ملاقط بصرية المحوري.

ويمكن استخدام ملاقط بصرية المحوري لدراسة مسافات قصيرة من الحمض النووي التي لا يمكن الوصول إليها للتلاعب من قبل وسائل بصرية التقليدية. وقد تم استخدامها لشudy مرونة جزيئات الحمض النووي قصيرة صغيرة مثل أزواج قليلة قاعدة ⁸ و 100 للتحقيق في آثار التوتر مرنة على البروتين بوساطة الحمض النووي حلقات ^13،14. على مقاييس الطول قصيرة، والآثار الناجمة عن تسلسل تعتمد الاختلافات في الرابطة الهيدروجينية والطاقات التراص، قد تسهم بقوة إلى خصائص المرونة من الحمض النووي. ملاقط بصرية محورية هي أداة مثالية لكشف هذه الآثار تعتمد على تسلسل الحمض النووي مرونة ^15. وعلاوة على ذلك، سوف ملاقط بصرية المحوري تكون أداة حساسة لدراسة التفاف حول الهستونات DNA الفرد ويحقق في نشاط السيارات الجزيئية أي معالجة بسرعة، وسوف يثبت أن تقنية جديدة وقيمة في مربع الأدوات أحادية الجزيء.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction C–fficient
For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10:
where the following shorthand has been introduced:
The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 where ε is the relative DNA extension.