Alongamento curtas seqüências de DNA com Pinça força constante óptico axial

Summary

Ilustramos o uso de uma constante de força axial pinças ópticas para explorar as propriedades mecânicas das moléculas de ADN curtas. Esticando DNA axialmente, minimizamos impedimento estérico e artefatos provenientes de manipulação laterais convencional, o que nos permite estudar moléculas de DNA tão curto quanto ~ 100 nm.

Abstract

Molécula única de técnicas de alongamento de ADN de comprimentos de contorno inferior a uma kilobase estão repletas de dificuldades experimentais. No entanto, muitos interessantes eventos biológicos tais como a ligação histona e proteínas mediada por looping de ADN ^{a 1,2,} ocorrem nesta escala de comprimento. Nos últimos anos, as propriedades mecânicas do ADN têm sido mostrados para desempenhar um papel importante em processos celulares fundamentais como a embalagem do ADN em nucleossomas compactos e fibras de cromatina ^3,4. Claramente, é então importante compreender as propriedades mecânicas dos trechos curtos de DNA. Neste artigo, apresentamos um guia prático para uma técnica de uma única molécula de óptica tweezing que temos desenvolvido para estudar o comportamento mecânico de DNA com comprimentos de contorno tão curtos quanto a algumas centenas de pares de bases.

O grande obstáculo no alongamento pequenos segmentos de DNA é que convencionais pinças ópticas são geralmente projetados para aplicar a força em um direction lateral ao estágio ^5,6, (ver fig. 1). Nesta geometria, o ângulo entre o rebordo e as lamelas, para o qual o DNA é presa, torna-se muito íngremes para submicron DNA comprimento. A posição axial deve agora ser considerado, que pode ser um desafio, e, uma vez que a extensão da microesfera arrasta mais perto da lamela, efeitos estéricos são melhoradas. Além disso, como resultado da assimetria das microesferas, as extensões laterais irá gerar vários níveis de binário devido à rotação da microesfera no interior da armadilha óptica uma vez que a direcção das variações de força reactiva durante a extensão.

Métodos alternativos para DNA submicron alongamento correr até contra seus próprios obstáculos únicos. Por exemplo, uma armadilha de duplo feixe óptico é limitada ao estiramento DNA de cerca de um comprimento de onda, em que os efeitos de interferência entre os pontos de duas armadilhas e de dispersão da luz entre as microsferas começam a ser um problema significativo. Substituindo uma das armadilhascom uma micropipeta provavelmente sofrem de desafios semelhantes. Embora se possa utilizar directamente o potencial axial para alongar o DNA, um esquema de feedback ativo que seria necessário para aplicar uma força constante e a largura de banda que será bastante limitado, especialmente em baixas forças.

Nós contornar esses problemas fundamentais diretamente puxando o DNA de distância da lamínula usando uma força constante axial pinças ópticas ^7,8. Isto é conseguido prendendo o grânulo em uma região linear do potencial óptico, em que a força óptica é constante, a força que pode ser ajustada através do ajuste da potência do laser. Prendendo dentro da região linear também serve como um todo óptico força de fixação sobre o ADN que se estende por cerca de 350 nm no sentido axial. Nós simultaneamente compensar o desvio térmico e mecânico com a ajustar com precisão a posição da fase de modo a que uma microesfera referência preso à lamela permanece na mesma posição e foco, umllowing para um período de observação de praticamente ilimitadas.

Protocol

1. Pinças Setup

1. O feixe de um laser 1064 nm é dividida em dois feixes polarizados ortogonalmente. Um é utilizado para manipular a biomolécula, enquanto o outro é usado para fins de calibração (ver a Fig. 2.).
2. A intensidade do feixe de manipulação é controlada por um deflector acústico-óptico (AOD), enquanto que a posição de focagem e de cada feixe é controlada de forma independente por espelhos de feixe de direcção e telescópios ópticos, respectivamente.
3. Os feixes são então recombinadas com um outro divisor de feixe polarizador e mais condicionada por um conjunto final de óptica de telescopagem para ligeiramente sobrecarregue a abertura traseira da objectiva do microscópio. Um transbordo de 50% para o feixe de calibração leva a uma armadilha apertado óptico, enquanto que um factor ligeiramente menor para o feixe de manipulação, cerca de 20%, dá uma menor atenção que se traduz numa maior região funcional do potencial linear. As vigas são bem focada por um 60x/1.4 obj óleo microscópio PlanApo imersãotiva para a célula de amostra.
4. Esta configuração de pinça é combinada com um microscópio de campo brilhante casa construída que proporciona uma iluminação de uma lâmpada de halogéneo focalizada sobre a câmara de amostra por um condensador. A imagem de campo claro é separada da luz de laser por um espelho dicróico e depois trabalhada em duas câmaras CCD. Um age CCD como nosso principal meio de aquisição de dados e software é accionado, para se obter as taxas de amostragem de precisão, enquanto que a outra CCD é usada para a imagem de uma microesfera de referência única presa cuja posição serve como um sistema de realimentação de controlo, para compensar o desvio no microscópio.
5. A amostra é grosseiramente posicionada em relação ao objectivo, um estágio XY, e pode, então, ser posicionado com precisão por um incorporado tridimensional piezo-fase.
6. A luz do laser para a frente-disperso e transmitido é recolhido pelo condensador de campo claro e focado em um fotodetector. O sinal resultante é filtrada através de um filtro anti-aliasing a 100 kHz, e amplificada umacquired a 200 kHz, utilizando uma placa de aquisição de dados.

2. Calibrar tamanho aparente do Talão a posição axial

1. Carregar uma câmara de amostra ⁹ com uma solução dispersa de 800 nm de diâmetro de poliestireno microesferas diluído em solução salina tamponada com fosfato. Deixe descansar por 10-15 minutos e depois lave levemente com tampão para remover o excesso de microesferas.
2. Localizar uma microesfera aleatoriamente preso à lamela e ajustar a altura da câmara de amostra até a microesfera é de cerca de 1 um a seguir a focagem para gerar uma imagem desfocada.
3. Para medir o tamanho aparente da imagem, em primeiro lugar encontra o centro da microesfera utilizando o padrão geométrico correspondente em função LabView.
4. Em seguida, gerar um perfil de intensidade radial da microesfera pela média de 360 ​​° em torno do centro de cada secção transversal. O perfil radial, o que corresponde a um anel branco em cada uma das imagens de campo claro, pode ser equipado com uma função quadrática para encontrarum pico de brilho. A distância entre o pico e o centro pode ser usado como uma medida do tamanho aparente do grânulo.
5. Usando o piezostage calibrado, aumentar gradualmente a posição axial da microesfera e adquirir uma imagem em cada posição axial com a câmara CCD.
6. Repita a análise de imagem para cada imagem sucessiva de correlacionar o tamanho aparente da microesfera com a sua localização axial (ver fig. 3). A resolução axial obtida por método é de cerca de 1,4 nm ^7.

3. Mapeamento do Potencial óptica do Boca Manipulação

1. Comece colinearmente alinhar o feixe de manipulação e o feixe de calibração. O feixe de calibração deve ser cerca de 50 mW na abertura traseira do objectivo que o feixe de manipulação devem ser muito mais fracas, digamos, 10 mW.
2. Com o feixe de manipulação desligado, confinar uma microesfera livre dentro da armadilha muito mais dura do feixe de calibração.
3. Agora, ligue o manifeixe pulação. Uma vez que o feixe de manipulação é muito mais fraco do que o feixe de calibração, a posição axial da microesfera seja ligeiramente perturbado. A alteração resultante na posição axial pode ser medida a partir das imagens de campo claro defocused como já descrito.
4. Desligue o feixe de manipulação e com a microesfera ainda preso no feixe de calibração, mudar o foco axial do feixe de calibração, ajustando a lente telescópica. Ligue o feixe de manipulação, medir o deslocamento subsequente da microesfera e de repetição.
5. A AX deslocamentos pode ser registada em função da posição axial do foco do feixe de calibração. A posição axial correspondente ao maior deslocamento da microesfera determina o centro da região linear da armadilha óptica (ver fig. 4).
6. O passo final para a obtenção da força óptico do feixe de manipulação como uma função da posição axial requer uma medição cuidadosa da rigidez dofeixe de calibração. Para se obter isso, mover o microesfera, preso pelo feixe de calibração, para cerca de um micrómetro acima da superfície através do ajuste da lente telescópica, enquanto o feixe de manipulação é desligado.
7. Gravar o movimento térmico axial da microesfera, medindo a intensidade da luz transmitida com um fotodetector.
8. A autocorrelação do sinal pode ser ligado a uma função de decaimento exponencial simples para dar a constante de tempo das flutuações,. Τ _z
9. O coeficiente de atrito hidrodinâmico ζ, da microesfera pode ser corrigido para a proximidade a um microesferas ^5,10 superficiais. A rigidez da armadilha de calibração é então dada por κ _z = ζ / τ _z (ver Materiais Suplementares A e B).
10. Conhecendo a rigidez da armadilha de calibração permite converter os deslocamentos axiais previamente medidos em uma força ƒ _z = _z κ Integração AX de this gera uma curva de mapeamento espacial do potencial axial óptico do feixe de manipulação (ver fig. 4).

4. Esticar uma amostra de DNA

1. Montar a câmara ⁹ de superfície que contêm as moléculas de ADN ancoradas (<1 kbp) e, enquanto observa a imagem de campo claro, posicionar o foco do feixe de manipulação ligeiramente acima das microesferas não estirada através do ajuste do telescópio. Em seguida, ajustar a posição da fase até que uma das microesferas é aprisionado.
2. Cerca de posicionar a microesfera no centro do plano XY da armadilha óptica. Gerar uma série de ondas quadradas em LabView e enviá-los para a AOD para repetidamente transformar o feixe de laser ligado e desligado. Cuidadosamente controlar a intensidade do laser e da duração do estado de ligado para evitar o aquecimento da câmara de amostragem. Normalmente, uso em torno de 2 MW de potência do laser (medido na abertura de trás do objetivo) e enviar pulsos de 200 ms (on) e MS 500 (off). A amplitude do quadrado wav enviado para o AOD deve ser cerca de 0,5 V.
3. Assista ao microesfera como a armadilha é repetidamente ligado e desligado e observe se o laser induz qualquer direção preferencial ao movimento da microesfera de. Embora de forma iterativa o ajuste da posição de microsferas tanto na direcção X e Y, por meio do controle do piezostage, o movimento aleatório das microesferas devem tornar-se isotrópica, no plano XY, embora notavelmente restringida quando o laser é ligado.
4. Em seguida, alinhar o talão na direcção Z. Novamente pulsar o feixe de laser ligado e desligado enquanto, desta vez, para medir simultaneamente a microesferas de deslocamento axial em tempo real. Centro de fase dentro da região linear, que é o ponto em que o deslocamento Z é maior.
5. Depois de um alinhamento cuidadoso na direcção Z, que é imperativo para verificar que a armadilha está ainda centrado no plano XY. Se o alinhamento XY mudou, tanto o XY e Z alinhamento deve ser repetido até que a microesfera é centrada adequadamente ao longo de todos os trêseixos.
6. Para o alongamento do ADN, rampa a intensidade do laser através do envio de um sinal de tensão para o AOD, a partir de 0 V para 0,5 V em incrementos de 0,025 V. Em cada passo, o registro 400 quadros a 100 fps e média-los para obter o deslocamento axial.
7. As curvas de força de extensão pode agora ser traçados e ajustados a um modelo modificado WLC ¹¹ (ver Materiais Suplementares B).

5. Resultados representativos:

Apresentamos as curvas de força de extensão para duas sequências de ADN: um pb 1298 e uma sequência de 247 pb, sendo este último o mais curto de sequência, temos sido capazes de esticar de forma reprodutível. Para trechos curtos de DNA, a Cadeia Worm-Like convencional (WLC) modelo não explica totalmente a relação de extensão força, porque em ambas as escalas de comprimento deve levar em conta um tamanho finito efeitos e extensão vigor a zero resultante de restrições de limite. As medições de extensão de força, portanto, tem que estar em forma usando um modelo modificado WLC que tem uma efetividadeve tamanho de persistência e uma extensão de força zero como parâmetros de ajuste, descritas ainda mais nos materiais complementares. Para comprimentos de contorno grandes de dsDNA, o comprimento efectivo de persistência é simplesmente o comprimento nominal de persistência (~ 50 nm) e a extensão de força zero pode ser negligenciada. No entanto, como o comprimento do contorno é mais curto o comprimento eficaz persistência diminui bem abaixo de 50 nm e o DNA, mesmo sob a força de zero, mostra um aumento significativo.

Os dados e os ajustes correspondentes das curvas de força de extensão são mostrados na Fig. 5 para as duas sequências. A partir do WLC modificado encaixa, determinamos os comprimentos eficazes de persistência para ser de 35 nm para a 1298 pb de ADN e 25 nm de 247 pb de DNA. Para fins ilustrativos, estamos apresentando medidas individuais das curvas de força de extensão para cada seqüência. Na prática, pode-se repetir as medições várias vezes e obter os resultados médios, juntamente com os desvios-padrão. Deve também ser notado that após a obtenção de cada curva é imperativo para assegurar que a microesfera fica presa e adequadamente posicionada dentro da região linear, caso contrário, a microsfera tem de ser realinhada, como anteriormente descrito no protocolo.

Princípio figura 1 do axial pinças ópticas. (Esquerda) Convencional armadilha pinças ópticas perto do foco. O talão é então deslocado lateralmente à lamela de exercer tensão. (Direita) Em axiais pinças ópticas, uma microesfera está presa para longe do foco, na região linear do potencial óptico. Nesta configuração, o polímero é mantido sob tensão constante para uma série de extensões. Além disso, aumentando a intensidade do laser se move da microesfera na direcção axial.

Figura Representação esquemática 2 deAxiais pinças ópticas do laser de luz (1064nm Nd: YVO _4). Está dividida em dois feixes por passagem através de um divisor de feixe polarizador (PBS). O feixe de manipulação, passa através de um deflector acústico-óptico (AOD) e o feixe de calibração pode ser ajustado independentemente usando lentes telescópicas. Os dois feixes são então recombinados usando outro PBS e centrada sobre a amostra por um objectivo NA elevada. Simultaneamente, a iluminação de campo claro usado para controlar a microesfera, passa através da amostra, é de infravermelhos (IR) e filtrado é, então, visualizado por duas câmaras CCD, uma das quais toma as medições, enquanto o outro atua como parte de um sistema de controlo de realimentação.

Figura 3 Calibração posição axial. Para calibrar a posição axial, adquirimos imagens desfocadas de um cordão preso ao lamela câmara em diferentes posições axiais do palco. O tamanho do microsfera é determinado pela distância entre o seu centro e a posição do pico de intensidade sobre o anel brilhante formado em torno da imagem da microesfera. A inserção mostra a distribuição de intensidade radial que proporciona o tamanho do grânulo.

Figura 4 Mapeamento do princípio atrás Potential óptico. Para mapear a força óptico do feixe de manipulação, o deslocamento axial que induz numa microesfera presa dentro de um feixe de calibração muito mais forte é medido. O centro da região linear que este deslocamento é uma máxima está situado. A Força óptica em função da curva de posição axial pode ser integrado para encontrar o potencial óptico.

Figura 5 Curva de Extensão Force. Dados é mostrado por alguns aleatórios 1298 pb e 247 pb (detalhe) Segment de dsDNA esticado por axiais pinças ópticas. Os pontos de dados foram ajustados para o WLC modificado modelo de equação. 3 (linhas a cheio) e rendeu comprimentos de persistência eficazes de 34 nm e 25 nm, respectivamente, para o 1298bp e ​​247bp.

Discussion

Pinças ópticas convencionais dependem tanto de feedback analógico ou controlado por computador para aplicar uma força constante sobre um objecto refrangente. Estes sistemas de retroalimentação activas têm dificuldade em realizar, em condições em que as alterações súbitas na extensão do espécime ocorrem, por exemplo, a partir da ligação de uma proteína ao ADN ou a intensificação rápida de um motor molecular ao longo de um filamento. Vários métodos para a aplicação de forças passivas constantes foram recentemente desenvolvidas. Um tal método, usado para resolver a intensificação da RNA polimerase a resolução pares de bases, envolveu o trabalho dentro da região linear do potencial óptico de um laser de feixe de Gaussian ^12. Nós adaptamos este método para a manipulação de biomoléculas curtos, criando uma constante força axial pinças ópticas.

Axiais pinças ópticas podem ser usadas para estudar trechos curtos de DNA que são inacessíveis a manipulação por métodos convencionais de ópticas. Eles têm sido utilizados para stUdy a elasticidade de moléculas de ADN curtas tão pequena quanto a algumas centenas de pares de bases ⁸ e para sondar os efeitos de tensão elástica na proteína-DNA mediada por loops de ^13,14. Em escalas de comprimento curto, os efeitos dependentes de sequências resultantes de variações de ligações de hidrogénio e as energias de empilhamento, pode contribuir fortemente para as propriedades elásticas do DNA. Axiais pinças ópticas são uma ferramenta ideal para descobrir estes efeitos seqüência dependentes elasticidade DNA ^15. Além disso, axiais pinças ópticas será uma ferramenta sensível para estudar o envolvimento do DNA em torno de histonas individuais e para sondar a atividade de qualquer motor rapidamente processamento molecular, e viria a ser uma técnica nova e valiosa na caixa de ferramentas de molécula única.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction C–fficient
For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10:
where the following shorthand has been introduced:
The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 where ε is the relative DNA extension.