コンスタント·フォース軸光ピンセットを用いたDNAの短い配列を伸ばす

Summary

我々は、短いDNA分子の機械的性質を探求する一定の力軸光ピンセットの使用を例証します。軸方向にDNAを延伸することによって、私たちは私たちが約100nm限り短くDNA分子を研究できるように、立体障害と、従来の横方向の操作で生じるアーチファクトを最小限に抑えることができます。

Abstract

小さいキロより輪郭の長さのDNAを延伸する単一分子技術は実験的困難をはらんでいます。しかし、このようなヒストン結合し、DNAの^1,2タンパク質媒介ルーピングなど、多くの興味深い生物学的事象は、この長さスケールで発生します。近年では、DNAの機械的特性は、コンパクトなヌクレオソームとクロマチン繊維^3,4へのDNAのパッケージングのような基本的な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されている。明らかに、それは、DNAの短いストレッチの機械的性質を理解することが次に重要です。本稿では、我々は数百塩基対程度の短い輪郭長を持つDNAの機械的挙動を研究するために開発した単一分子光tweezing技術に実用的なガイドを提供します。

DNAの短いセグメントをストレッチングの主なハードルは、従来の光ピンセットは、一般のdirectioに力を適用するために設計されていることであるnは^5,6ステージに^横方向（図1参照）。この幾何学では、DNAが繋がれているためビーズとカバーガラス、、の間の角度は、サブミクロンの長さのDNAのための非常に急峻になる。軸方向の位置は、現在拡張子がカバースリップに近い微小球をドラッグしているので、立体効果が強化され、挑戦することができ、これを占めており、されなければならない。さらに、微小球の非対称性の結果として、横方向の拡張は、拡張時の反力の変化の方向が光学トラップ内の微小球の回転によるトルクのさまざまなレベルを生成します。

ストレッチサブミクロンDNAのための代替方法は、独自のユニークなハードルにぶつかる。例えば、デュアルビーム光学トラップが2つのトラップの間に微小球の間の光の散乱点からの干渉の影響が重大な問題を提起するために開始する波長、周りのDNAを引き伸ばしに制限されています。トラップの1つを交換マイクロピペットで最も可能性が高い同様の課題に苦しむだろう。一つは直接DNAを伸ばすために軸方向のポテンシャルを使うこともできますが、アクティブ·フィードバック方式は一定の力を適用し、この帯域幅は、特に低力で、かなり限定されますが必要でしょう。

我々は、直接一定の力軸方向の光ピンセット^7,8を使用^してカバーグラスから離したDNAを引いて、これらの根本的な問題を回避する。これは、光力がある光学ポテンシャル、定レーザーパワーを調節することによって調整することができるの強さの線形領域でビーズを捕捉することによって達成される。線形領域内トラッピングも軸方向に約350 nmの拡張するDNA上のすべての光力クランプとして機能します。我々は同時に、細かくカバースリップにこだわった基準微小球が同じ位置とフォーカスのままであるように、ステージの位置を調整することにより、熱的、機械的なドリフトを補償実質的に無限の観察期間のためllowing。

Protocol

1。ピンセットセットアップ

1. 1064 nmのレーザーからのビームは、2つの直交偏光ビームに分割される。一つは、他のが（図2参照）、キャリブレーション用に使用されている間生体分子を操作するために使用されています。
2. 各ビームの位置と焦点がそれぞれ独立して、ビーム·ステアリングミラーや光学望遠鏡によって制御されながら操作ビームの強度は、音響光学偏向器（AOD）によって制御されます。
3. ビームは、その後、別の偏光ビームスプリッタと再結合し、わずかに顕微鏡対物レンズの背面開口部を入れすぎする伸縮式光学系の最終セットでさらに条件付けられる。操作ビームのためのわずかに小さい因子、約20％が、線形ポテンシャルの大きい実行可能な領域に変換することを浅いフォーカスを与えながら、キャリブレーションビームは50％オーバーフィルは、タイトな光学トラップにつながる。ビームはしっかりPlanApo 60x/1.4油浸顕微鏡objで集中している試料セルにective。
4. このピンセットのセットアップは、凝縮器で試料室に集束ハロゲンランプからの照明を提供しています自宅内蔵明視野顕微鏡と組み合わされています。明視野像は、ダイクロイックミラーにより、レーザ光から分離し、次いで2つのCCDカメラ上に結像される。他のCCDは画像その位置が顕微鏡でドリフトを補償するフィードバック制御システムとして機能する単一立ち往生参照ミクロスするのに使用される一方のCCDデータを取得する私たちの主な手段として作用し、正確なサンプリングレートを生成するためにトリガするソフトウェアです。
5. サンプルは粗くXYステージによる客観に対して位置決めされた後、正確に埋め込まれた3次元のピエゾステージにより位置決めすることができる。
6. 前方散乱と透過したレーザ光は、明視野コンデンサーによって収集され、光検出器上に集光される。得られた信号は、100kHzでのアンチエイリアシングフィルタを通して濾過増幅されDAQカードを使用して200kHzでcquired。

2。軸方向の位置にビーズの見かけの大きさのキャリブレーション

1. 緩衝食塩水ミクロスはリン酸で希釈し800nm ​​の直径のポリスチレンの分散溶液を試料室^{9をロードします} 。 10-15分後、過剰微小球を除去するバッファーで軽くフラッシュに座ってみましょう。
2. ランダムにカバーガラスに付着した微小球の位置を確認し、マイクロスフェアは、焦点がぼけた画像を生成するために、フォーカス以下1μm程度になるまで試料室の高さを調整します。
3. 画像の見かけの大きさを測定するには、まずLabVIEWのマッチング機能を幾何学的なパターンを使用して微小球の中心を見つける。
4. 次に、各断面の中心の周りに360°を平均化することにより、微小球の半径方向の強度プロファイルを生成します。明視野画像のそれぞれに白いリングに対応して放射状のプロフィールは、見つけることが二次関数を取り付けることができます明るさのピーク。このピークと中心間の距離は、ビーズの見かけの大きさの尺度として使用することができます。
5. キャリブレーションpiezostageを使用して、徐々にマイクロスフェアの軸方向の位置を向上させ、CCDカメラを用いて各軸の位置に画像を取得する。
6. その軸の位置（図3参照）と微小球の見かけの大きさを相関させるための連続した​​各画像の画像解析を繰り返します。方法によって得られた軸方向の分解能は1.4 nm付近⁷です。

3。操作ビームの光学ポテンシャルのマッピング

1. 一直線操作ビームとキャリブレーションビームを整列させることから始めます。操作ビームはかなり弱いはずですが、キャリブレーションビームは、対物レンズの背面開口部には約50 mWである必要があり、10 mWを言う。
2. 操作ビームのスイッチを切って、キャリブレーションビームのはるかに硬くトラップ内での自由なミクロスフェアを閉じ込める。
3. さて、マニオンにするpulationビーム。操作ビームは、キャリブレーションビームよりもはるかに弱いですので、微小球の軸方向の位置がわずかに摂動されます。すでに説明したように軸方向の位置の結果の変化がぼけ明視野画像から測定することができる。
4. 操作ビームをオフにしても、キャリブレーションビームの中に閉じ込めミクロスと、望遠レンズを調整することにより、キャリブレーションビームの軸方向の焦点を移す。操作ビームをオンにして、マイクロスフェアと繰り返し、その後の変位を測定します。
5. 変位のΔXは、キャリブレーションビームの焦点の軸方向の位置に対してプロットすることができます。ミクロスフェアの最大の変位に対応する軸方向位置（図4参照）光学トラップの線形領域の中心を決定する。
6. 軸方向の位置の関数としての操作ビームの光力を得るための最後のステップは、剛性の慎重な測定を必要とするキャリブレーションビーム。これを取得するには、操作ビームがオフになっている間、望遠レンズを調整することによって、表面上マイクロメートル程度にキャリブレーションビームによってトラップミクロスフェアを、動かす。
7. 光検出器と透過光の強度を測定することにより微小球の熱軸方向の動きを記録します。
8. 信号の自己相関は、変動の時定数を与えるために、単一指数減衰関数にフィッティングすることができます_。τZ
9. 微小球の流体力学的摩擦係数ζは、表面^5,10へミクロス近接補正することができる。キャリブレーショントラップの剛性はその後（補足資料AおよびBを参照）は、κ _のz =ζ/τは_zで与えられます。
10. キャリブレーショントラップの剛性を知ることは、一つは力ƒにTHI _の z _=κzの ΔXの統合を以前に測定された軸方向変位に変換することができますSカーブは、操作ビームの軸方向の光学ポテンシャル（図4参照）の空間マッピングを生成します。

4。 DNAサンプルを伸ばす

1. チャンバ⁹含む表面テザーDNA分子（<1 KBP）をマウントし、明視野像を観察しながら、望遠鏡を調整することによって、少し延伸ミクロス上記操作ビームの焦点を置きます。ミクロスフェアの1がトラップされるまで、ステージの位置を調整します。
2. 大体光学トラップのXY平面の中央に微小球の位置を合わせます。 LabVIEWで方形波のシリーズを生成し、繰り返しレーザービームをオンおよびオフにしたAODに送信します。慎重にレーザーと試料室の加熱を防ぐために上の状態の持続時間の強度を制御する。一般的に、レーザーパワーの約2 mWを（客観の背面開口部で測定）を使用し、200ミリ（上）と500ミリ（オフ）のパルスを送信します。正方形wの振幅AODに送信aveは0.5前後となるはずV.
3. トラップが繰り返しオン·オフとされるマイクロスフェアを見て、レーザーはマイクロスフェアの動きに任意の優先方向を誘導する場合に注意してください。反復して、XとY方向ともに微小球の位置を調整しながら、piezostageを制御することにより、マイクロスフェアのランダムな動きは、レーザーがオンのときに著しく制限されても、XY平面内で等方的になる必要があります。
4. 次に、Z方向にビーズを合わせます。 、今回は、リアルタイムで同時にミクロス軸の変位を測定しながら、再びオンにレーザビームをパルスとオフ。 Zの変位が最大となる点である線形領域内のセンターステージ。
5. Z方向に慎重に位置合わせした後、トラップがまだXY平面の中央に配置されていることを確認することが不可欠です。 XYアライメントが変更されている場合は、すべてのマイクロスフェア3に沿って適切にセンタリングされるまで、XYとZアライメント両方を繰り返す必要があります軸。
6. DNAをストレッチについては、各手順で0.025 Vのステップで0 Vから0.5 Vに、AODに電圧信号を送信することにより、レーザー強度を上げ、レコード400フレーム100 fpsで、それらを軸方向の変位を得るために平均。
7. 力拡張曲線がプロットされ、今では修正されたWLCモデル^11（B補足資料を参照）に適合することができます。

5。代表的な結果：

我々2つのDNA配列のために存在力の延長曲線：1298 bpおよび247 bpの配列、最短シーケンス後者は、我々は、再現伸ばすことができました。これらの長さスケールで一つは有限サイズ効果と境界の制約から生じるゼロ力の拡張を考慮しなければならないので、DNAの短いストレッチのために、従来のワームのようなチェーン（WLC）のモデルでは、完全に力拡張の関係を説明していません。力拡張の測定は、そのため、effectiを持つ改変WLCモデルを用いて適合しなければならない持続長とフィットパラメータとしてゼロ力の拡張子をVE、補助教材で、より詳しく説明。 dsDNAの大きな輪郭長については、効果的な持続長は、単に名目上の持続長（〜50 nm）であり、ゼロフォースの拡張子は無視することができます。しかし輪郭長が短くなるほど、効果的な持続長は、よく50nmおよびDNAの下に減少してもゼロの力の下で、大幅な拡張を示しています。

力拡張曲線のデータとそれに対応するフィットをFig。二つの配列のための5。修正されたWLCのフィットから、我々は、1298 bpのDNAと247 bpのDNAの25 nmの35 nmであることが効果的な永続性の長さを決定した。例示的な目的のために、我々は、各シーケンスの力の延長曲線の単一の対策を提示している。実際には、測定を複数回繰り返すと標準誤差とともに平均的な結果を得るだろう。これは、股関節にも留意しなければならないトン各曲線を得た後、それがマイクロスフェアは、以前のプロトコルで説明したようにそうしないとミクロスが再編されている必要があり、線形領域内に捕捉され、適切に配置されたままことを保証するために不可欠です。

アキシャル光ピンセットの原理図1（左）焦点の近くに従来の光ピンセットトラップ。ビーズは、その後テンションを発揮するカバースリップに横移動されます。 （右）軸方向の光ピンセットでは、マイクロスフェアは、光学ポテンシャルの線形領域では、焦点から離れて捕集される。この構成では、ポリマーは、拡張子の範囲のための一定の張力の下で開催されています。また、レーザ強度​​を増加させると、軸方向に微小球を移動します。

図2の模式図軸方向の光ピンセットレーザ光 ​​（波長1064nmのNd：YVO _4）は 、偏光ビームスプリッタ（PBS）を通過させることによって2つのビームに分割されます。操作ビームは、音響光学偏向器（AOD）を通過して、キャリブレーションビームが独立して伸縮自在のレンズを使用して調整できます。 2つのビームは、その後、別のPBSを用いて再結合し、高NA対物レンズによって試料上に集束されています。同時に、マイクロスフェアを追跡するために使用される明視野照明は、赤外線（IR）を濾過し、その後のフィードバック制御系の一部としてその他の行為しながら測定を行いそのうちの1つのCCDカメラによって撮像され、サンプルを通過します。

図3軸方向位置のキャリブレーション。軸方向の位置を較正するために、私たちはステージの軸方向の位置を変化させてチャンバーカバーグラスに付着したビーズのピンボケ画像を取得する。マイクロのサイズphereは、その中心とミクロスフェアの画像の周りに形成された明るいリングについてのピーク強度の位置との距離によって与えられる。挿入図は、ビーズの大きさを与えるラジアル強度分布を示している。

光学ポテンシャルのマッピングの背後に4原則を示しています。操作ビームの光力をマッピングするには、それがはるかに強いのキャリブレーションビーム内に捕捉された微小球に誘導することを軸方向の変位を測定する。この変位が最大となる線形領域の中心が位置しています。光力対軸方向位置曲線は光の可能性を見つけるために統合することができます。

図5フォース伸展曲線。データはランダム1298 bpおよび247 bpの（挿入図）segmenために示されているdsDNAのトンは、軸方向の光ピンセットによって伸張。データポイントは、式の修正されたWLCモデルに適合させた。 3（実線）および34 nmおよびそれぞれ1298bpと247bpのために25nmの効果的な永続性の長さが得られた。

Discussion

従来の光ピンセットは、屈折物体に一定の力を適用するために、アナログまたはコンピューター制御のフィードバックに依存しています。これらのアクティブ·フィードバック·システムは、タンパク質の結合に由来するDNAまたはフィラメントに沿って分子モーターの急速なステッピングには、例えば、試料の延長の急激な変化が発生した条件の下で行うことが困難である。一定の力を加えるための様々な受動的方法が最近開発された。塩基対の分解能でRNAポリメラーゼのステッピングを解決するために使用されるような方法の一つは、ガウシアンレーザービーム¹²の光学ポテンシャルの線形領域内での作業に関与。我々は、定荷重軸光ピンセットを作成することによって、短いの生体分子の操作のためにこの方法を適応している。

軸方向の光ピンセットは、従来の光学的方法による操作にアクセスできないDNAの短いストレッチを研究するために使用することができます。それらがSTに使用されてきたudy数百塩基対のような小さな短いDNA分子の弾力⁸およびタンパク質媒介DNA上に弾性張力の影響を調べるためには^、13,14をループ^します 。短い長さスケールでは、水素結合とスタッキングエネルギーの変動から生じる配列依存効果は、強くDNAの弾性特性に寄与することができる。軸方向の光ピンセットは、DNAの弾力^15日にこれらのシーケンスに依存する効果を発見するための理想的なツールです。また、軸方向の光ピンセットは、個々のヒストンの周りにDNAの折り返​​しを研究するための、任意の急速処理分子モーターの活性をプロービングするための敏感なツールとなるでしょうし、単一分子ツールボックスの貴重な新しい手法であると証明する。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction C–fficient
For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10:
where the following shorthand has been introduced:
The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 where ε is the relative DNA extension.