Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching

Summary

Daha kısa DNA moleküllerinin mekanik özelliklerini incelemek için sabit bir kuvvet eksensel optik cımbız kullanımını göstermektedir. Eksenel DNA germe, biz bize ~ 100 nm gibi kısa DNA molekülleri çalışmaya izin sterik engel ve konvansiyonel yanal manipülasyon doğan eserler minimize.

Abstract

Az kilobaz daha kontur uzunluklarda DNA germe için Tek molekül tekniklerin deneysel güçlüklerle doludur. Bununla birlikte, bu gibi histon ve DNA bağlayıcı ^{protein, 1,2-aracılı} döngü olarak çok ilginç biyolojik etkinlikleri, bu uzunluk ölçek üzerinde meydana gelir. Son yıllarda, DNA mekanik özelliklerini kompakt nükleozom ve kromatin ipliklerinin ^3,4 içine DNA paketleme gibi temel hücresel süreçler önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Açıkçası, DNA'nın kısa menziller mekanik özelliklerini anlamak için o önemlidir. Bu yazıda, biz birkaç yüz basepairs gibi kısa kontur uzunluktaki DNA'nın mekanik davranışlarını incelemek için geliştirmiş olduğumuz tek-molekül optik tweezing tekniği için pratik bir kılavuz sağlamak.

DNA'nın kısa segmentlerinde gerilmelerde büyük engel, geleneksel optik cımbız genellikle directio kuvvet uygulamak için tasarlanmış olann, aşama ^{5,6 yanal,} (bakınız Şek. 1). Bu geometri olarak, boncuk ve lamel arasındaki açı olan DNA gergin olduğu, mikron uzunlukta DNA için çok dik hale gelir. Eksenel pozisyonunu artık uzatma yakın lamel mikroküre sürükler yana, sterik etkiler geliştirilmiştir, bir meydan okuma olabilir, sorumluydu, ve olmalıdır. Buna ek olarak, mikro asimetri bir sonucu olarak, yan uzantılar oluşturur uzantı boyunca reaktif güç yönü değişirse beri optik tuzak içinde nedeniyle mikrosfer dönme momenti, değişen.

Germe Mikronaltı DNA için alternatif yöntemlerin kendilerine özgü engellerin karşı çalıştırın. Örneğin, bir çift-kiriş optik tuzak hangi iki tuzak arasında ve mikroküreler arasında ışık saçılması ikinci nokta parazit etkileri önemli bir sorun teşkil başlar, bir dalga boyu yaklaşık DNA germe ile sınırlıdır. Tuzakları biri DeğiştirilmesiBir mikropipet ile büyük olasılıkla benzer sorunlar muzdarip olacaktır. Biri doğrudan DNA germek için eksenel potansiyel kullanabilirsiniz iken, aktif bir geribildirim düzeni sabit bir kuvvet ve bu bant genişliği özellikle düşük güçlerine, oldukça sınırlı olacaktır uygulamak için gerekli olacaktır.

Biz doğrudan sabit bir kuvvet eksenel optik cımbız ^7,8 kullanarak lamel uzak DNA çekerek bu temel sorunları aşmak. Bu, optik gücü sabit güç olan lazer gücü ayarlamak suretiyle ayarlanabilir olan optik potansiyel bir doğrusal bölgesinde, boncuk yakalama ile elde edilir. Doğrusal bölgede bindirme ayrıca eksenel yönde yaklaşık 350 nm boyunca uzanan DNA üzerinde bir bütün optik güç kelepçe olarak hizmet vermektedir. Lamel yapışmış bir referans mikroküre, aynı konumda ve odak kalır, böylece Biz aynı anda ince sahne konumunu ayarlayarak termal ve mekanik sürüklenme telafi birneredeyse sınırsız gözlem dönemi için llowing.

Protocol

1. Cımbızlar Kurulumu

1. Bir 1064 nm lazer ışını iki ortogonal polarize ışınları ayrılmıştır. Bir başka (bakınız Şek. 2) kalibrasyon amacıyla kullanılan en biyomolekül işlemek için kullanılır.
2. Her bir kiriş pozisyon ve odak bağımsız olarak, sırasıyla, ışın yönlendirme aynası ve optik teleskoplar ile kontrol edilir manipülasyon ışın yoğunluğu, bir akusto-optik deflektör (ATH) tarafından kontrol edilir.
3. Kirişler sonra başka bir polarize ışın ayırıcı ile recombined ve biraz mikroskop objektif arkasına diyafram doldurmayın için teleskop optik bir final seti daha da klimalıdır. Manipülasyon kiriş için biraz daha küçük bir faktörü, yaklaşık% 20, lineer potansiyel büyük bir çalışılabilir bölgeye çeviren bir sığ odak verirken kalibrasyon ışını için% 50 fazla doldurmayın, sıkı bir optik tuzağına götürür. Kirişler sıkıca PlanApo 60x/1.4 yağ immersiyon obj tarafından duruldunumune hücresi üzerine uygulamada etkili.
4. Bu cımbız kurulum bir kondansatör tarafından numune odacığı üzerine odaklanmış bir Halojen lamba aydınlatma sağlar bir ev inşa aydınlık mikroskop ile birleştirilmiştir. Aydınlık görüntü bir dikroik ayna tarafından lazer ışık ayrılır ve daha sonra iki CCD kamera üzerinde görüntülenmektedir. Diğer CCD görüntü olan pozisyon mikroskop sürüklenme telafi etmek için bir geri besleme kontrol sistemi olarak hizmet tek bir sıkışmış referans mikroküre için kullanılırken, biri CCD veri edinme bizim birincil aracı olarak görür ve, hassas örnekleme oranları elde etmek için tetiklenir yazılımdır.
5. Örnek kabaca bir XY aşama ile objektif ile ilgili olarak konumlandırılır ve daha sonra tam gömülü bir üç boyutlu bir piezo-katı ile yerleştirilebilir.
6. Öne saçılan ve yayılan lazer ışığı aydınlık kondenser tarafından toplanan ve bir fotodetektör üzerine odaklanmıştır. Elde edilen sinyal, 100 kHz bir yumuşatma filtre içinden süzülmüş amplifiye edilir ve birBir DAQ kartı kullanarak 200 kHz'de cquired.

2. Eksenel Pozisyon Boncuk Görünür Büyüklüğü Kalibre

1. Bir fosfat içinde seyreltilmiş 800 nm çaplı polistren mikroküre çözümü Dispers bir örnek odası ⁹ yükleyin tamponlu salin. 10-15 dakika bekletin ve sonra hafifçe aşırı mikroküreler kaldırmak için tamponu ile yıkayın edelim.
2. Rastgele coverglass yapışmış bir mikroküre bulup mikroküre bir defocused görüntü oluşturmak için odak altında yaklaşık 1 mikron kadar numune odasının yüksekliğini ayarlayın.
3. Resmin görünen boyutunu ölçmek için, ilk LabView eşleşen fonksiyonu geometrik desen kullanarak mikroküre merkezi bulabilirsiniz.
4. Daha sonra, her bir enine kesit merkezine yaklaşık 360 ° ortalaması alınarak mikrosfer, radyal bir yoğunluk profili oluşturmak. Aydınlık görüntülerin her bir beyaz halka karşılık radyal profil, bulmak için ikinci dereceden bir fonksiyonu takılabilirparlaklık pik. Bu tepe noktası ile merkez arasındaki mesafe boncuk mevcut boyutlarını bir ölçü olarak kullanılabilir.
5. Kalibre piezostage kullanarak, yavaş yavaş mikroküre arasında eksenel pozisyonunu artırmak ve CCD kamera ile her eksenel konumda bir görüntü kazanır.
6. (Bkz. Şek. 3) eksenel konumu ile mikroküre belirgin boyutu ilişkilendirmek için birbirini izleyen her görüntü için görüntü analizi tekrarlayın. Yöntemi ile elde edilen eksenel çözünürlüğü yaklaşık 1,4 mil ^7'dir.

3. Manipülasyon Işın Optik Potansiyeli

1. Collinearly manipülasyon ışını ve kalibrasyon ışın hizalayarak başlayın. Manipülasyon ışın çok zayıf olmalı iken kalibrasyon ışın hedefi arka diyafram yaklaşık 50 mW olmalıdır, 10 mW söylüyorlar.
2. Manipülasyon ışını kapalı olan, kalibrasyon ışının çok sert tuzak içinde bir serbest mikroküre sınırlandırmak.
3. Şimdi, mani açınpulation kiriş. Bu sayede, manipülasyon ışın demeti kalibrasyon çok daha zayıf olduğu için, bir mikrosfer eksenel pozisyonunu biraz bozulursa olacaktır. Eksenel konumda çıkan değişiklik olarak daha önce tarif odak dışı aydınlık alan görüntüleri ölçülebilir.
4. Manipülasyon ışını kapatın ve hala kalibrasyon kiriş içinde sıkışıp mikroküre ile teleskopik lens ayarlayarak kalibrasyon kirişin eksenel odak kayması. , Manipülasyon kiriş açın mikroküre ve tekrarın sonraki deplasman ölçer.
5. Değiştirmeler ΔX kalibrasyon ışının odak eksenel pozisyonunu karşı çizilebilir. Mikrosfer en büyük deplasman karşılık gelen eksenel pozisyonunu optik tuzak doğrusal bölgede (bakınız Şek. 4) merkezi belirler.
6. Eksenel konumunun bir fonksiyonu olarak manipülasyon kiriş optik güç elde son adım sertliğinin dikkatli bir şekilde ölçülmesi gereklidirkalibrasyon kiriş. Bunu elde etmek için, manipülasyon ışını kapalıyken teleskopik lens ayarlayarak yüzeyinden bir mikrometre civarına kalibrasyon ışını tarafından tuzağa mikroküre, hareket.
7. Bir fotodetektör ile iletilen ışığın yoğunluğunu ölçerek mikrosfer bir termal eksenel hareket kaydedin.
8. Sinyalin otokorelasyon, dalgalanmalar zaman sabitini vermek için tek bir üstel bozulma fonksiyonu takılabilir. Τ _z
9. Hidrodinamik sürtünme katsayısı ζ, mikrosfer bir yüzey ^5,10, mikrosferler yakınlık için düzeltilebilir. Kalibrasyon tuzak sertliği sonra κ _z = ζ / τ _z (bkz. Yardımcı Malzeme A ve B) tarafından verilir.
10. Kalibrasyon tuzak sertliği bilmek tek bir kuvvet ƒ içine thi _z = κ _z ΔX Entegrasyon önce ölçülen eksenel deplasman dönüştürmek sağlars eğri manipülasyon kiriş eksenel optik potansiyeli (bakınız Şek. 4) konumsal bir eşleme verir.

4. Bir DNA Sample Stretching

1. Odasının ⁹ içeren yüzey gergin DNA molekülleri (<1 kbp) monte ve aydınlık görüntü dikkat ederek, teleskop ayarlayarak hafifçe gerilmemiş mikrosferler yukarıda manipülasyon kiriş odağı yerleştirin. Daha sonra mikro biri tutulur kadar aşamasının konumunu ayarlamak.
2. Kabaca optik tuzak XY düzlemi merkezinde mikrosfer yerleştirin. LabView kare dalgalar bir dizi oluşturun ve tekrarlayan lazer ışını ve kapatmak için AOD gönderebilirsiniz. Dikkatlice lazer ve numune odasının ısınmasını önlemek için üzerindeki hal süresini yoğunluğunu kontrol. Genellikle, lazer güç (objektif arkasındaki diyafram ölçülen) 2 mW etrafında kullanımı ve 200 ms (açık) ve 500 ms (açık) ve bakliyat gönderebilirsiniz. Kare w genliğiave AOD gönderilen 0.5 civarında olmalıdır V.
3. Tuzak defalarca açılıp kapandığında olarak mikroküre İzle ve lazer mikroküre en hareketine herhangi bir tercihli yöne yönlendiren, unutmayın. Iteratif X ve Y yönünde hem mikroküre konumunu ayarlarken, piezostage kontrol ederek, mikroküre ve rasgele hareket lazer açıkken bile fark yoktur, XY düzleminde izotropik haline gelmelidir.
4. Sonra, Z doğrultusunda boncuk hizalanır. , Bu kez, aynı anda gerçek zamanlı mikroküreler eksenel deplasman ölçüm yaparken tekrar lazer ışını darbeli ve kapatır. Lineer bölge içinde merkezi aşama, ki Z deplasman yüksek olduğu noktadır.
5. Z yönünde dikkatli bir hizalama sonra, tuzak hala XY düzleminde merkezli olup olmadığını kontrol etmek şarttır. XY hizalama değiştirilmişse mikroküre üç boyunca düzgün ortalanmış kadar, XY ve Z hizalama hem tekrarlanmalıdıreksenleri.
6. DNA germe için, onları eksenel deplasman elde etmek için kayıt, 0.025 adımlarla V. Her adımda 0 V 0.5 V, AOD 400 100 fps kare ve ortalama bir voltaj sinyali göndererek lazer yoğunluğu rampa.
7. Kuvvet-uzama eğrileri şimdi (B Yardımcı Malzemeler bakınız) çizilen ve modifiye WLC modeli ¹¹ için uygun olabilir.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Bir 1298 bp ve 247 bp dizisi, biz tekrarlanabilir germek mümkün olmuştur kısa dizisi olmanın ikincisi: Biz iki DNA dizileri için yürürlüğe uzatma eğrileri sunuyoruz. Bu uzunluk ölçeklerinde tek sonlu boyutlu efektler ve sınır kısıtlamaları kaynaklanan sıfır kuvvete uzantısı için hesap gerekir, çünkü DNA kısa menziller için, konvansiyonel Worm-beğendiniz Zincir (WLC) modeli tam kuvvet uzantısı ilişkisini açıklamaz. Kuvvet-uzama ölçümleri, bu nedenle, etkin bir e sahip bir modifiye WLC modeli kullanılarak uygun olması gerekirsebat uzunluğu ve ek materyalleri de açıklanan uyum parametreleri, bir sıfır kuvvete uzantısı ettik. DsDNA büyük kontur uzunlukları için, etkili bir kalıcılık süresini sadece nominal sebat uzunluğu (~ 50 nm) ve sıfır kuvvete uzantısı ihmal edilebilir. Bununla birlikte, çevre uzunluğu daha kısa hale olarak, etkili kalıcılık uzunluğu da 50 nm ve DNA altına düştüğünde hatta sıfır kuvvet altında, belirgin bir uzantı göstermektedir.

Kuvvet-uzama eğrisi verileri ve ilgili uyan Şekil 'de gösterilmiştir. İki dizileri için 5. Modifiye WLC uyuyor, biz etkili kalıcılık uzunlukları 1298 bp DNA ve 247 bp DNA için 25 nm 35 nm olarak belirlenmiştir. Amaçlıdır, her sıra için güç uzatma eğrileri tek önlemleri sunuyoruz. Uygulamada, bir ölçüm birden çok kez tekrarlayın ve standart hataları ile birlikte ortalama sonuçlar elde ederim. Bu tha da belirtmek gerekirt her bir eğri elde etmek sonra mikrosfer önceden protokolde tarif edildiği gibi başka bir mikrosfer yeniden hizalanmalıdır, lineer bölge içinde sıkışmış ve uygun bir şekilde yerleştirilmiş olmasını sağlamak için zorunludur.

Eksenel Optik cımbız Şekil 1. İlke. (Sol) Odak yakınındaki Konvansiyonel optik cımbız tuzak. Boncuk sonra gerilim uygulamak için lamel yanal hareket ettirilir. (Sağ) eksenel optik cımbız, bir mikroküre optik potansiyel doğrusal bölgede, odak uzak tutulur. Bu düzenlemede, polimer uzantılar için bir dizi sabit gerilim altında tutulur. Ayrıca, lazer yoğunluğu artan eksenel yönde mikrosfer hareket eder.

Şekil 2 Şematik GösterimiEksenel Optik cımbız Lazer ışığı (1064nm Nd: Yvo _4). Polarize ışın ayırıcı (PBS) üzerinden geçerek iki kiriş ayrılmıştır. Manipülasyon ışın, bir acousto-optik saptırıcı (AOD) geçer ve kalibrasyon kiriş teleskopik lens kullanan bağımsız olarak ayarlanabilir. İki ışın, sonra yüksek bir NA objektif ile bir başka PBS ile yeniden birleştirilmesi, ve numune üzerine odaklanmıştır. Aynı zamanda, aydınlık alan aydınlatma mikrosfer izlemek için kullanılabilir, örnek geçen süzülmüş kızılötesi (IR) ve daha sonra bir geri besleme kontrol sisteminin bir parçası olarak diğer işlemler sırasında ölçüm yapar ve bunlardan biri iki CCD kamera tarafından görüntülenmektedir.

3 Eksenel Pozisyon Kalibrasyon Şekil. Eksenel pozisyonunu kalibre etmek için, biz sahne eksenel pozisyonları değişen odasına lamel yapışmış bir boncuk defocused görüntüler elde. Mikro boyutuphere merkezinde ve mikroküre bir görüntü etrafında oluşan parlak halka yaklaşık doruk şiddeti pozisyonu arasındaki mesafe tarafından verilir. Içerlek boncuk boyutunu verir radyal yoğunluğu dağılımını göstermektedir.

Optik Potansiyeli ardında 4. İlke Şekil. Manipülasyon ışının optik kuvveti eşleştirmek için, daha güçlü bir kalibrasyon demeti içinde sıkışmış bir mikroküre üzerine uyardığını eksenel deplasman ölçülür. Bu yer değiştirme, bir maksimum olduğu doğrusal bölgenin merkezinde yer almaktadır. Eksenel Pozisyon eğrisi vs Optik Kuvvetleri optik potansiyel bulmak için entegre edilebilir.

Şekil 5 Kuvvet Uzatma Eğrisi. Veriler rasgele 1298 bp ve 247 bp (inset) segmen için gösterilirdsDNA t eksenel optik cımbız tarafından gerilir. Veri noktaları denkleminin modifiye WLC modeli için uygun bulundular. 3 (katı çizgiler) ve 1298bp ve 247bp sırasıyla 34 nm ve 25 nm etkili sebat uzunlukları vermiştir.

Discussion

Konvansiyonel optik cımbız bir refraktil nesne üzerinde sabit bir kuvvet uygulamak için analog ya da bilgisayar kontrollü geribildirim güvenmek. Bu aktif geri besleme sistemleri, bir protein bağlama gelen DNA ya da bir filaman boyunca bir moleküler motorun hızlı bir atlama için, örneğin, zorluk numune bir uzantısı olarak ani değişiklikler meydana koşullar altında icra var. Sabit kuvvetlerinin uygulanması için çeşitli pasif yöntemler son zamanlarda geliştirilmiştir. Basepair çözünürlükte RNA polimeraz atlama çözmek için kullanılan böyle bir yöntem, bir Gauss lazer ışını ¹² optik potansiyelinin doğrusal bölgede çalışan içeriyordu. Biz sabit bir kuvvet eksenel optik cımbız oluşturarak kısa biyomoleküllerin manipülasyonu için bu yöntemi benimsediler.

Eksenel optik cımbız geleneksel optik yöntemlerle manipülasyon erişilemez DNA'nın kısa menziller incelemek için kullanılabilir. Onlar st için kullanılmıştırudy birkaç yüz baz çifti ⁸ kadar küçük ve protein-aracılı DNA üzerinde elastik gerilim etkisini araştırmak için kısa DNA moleküllerinin elastikiyet ^13,14 döngü oluşturur. Kısa bir boyda ölçeklerde, hidrojen bağlama enerjileri ve istif de farklılıklar ortaya çıkan sıralamaya bağlı etkileri, kuvvetle DNA elastik özelliklerine katkıda bulunabilir. Eksenel optik cımbız DNA elastikiyet ¹⁵ bu sıralamaya bağlı etkilerin ortaya çıkarılması için ideal bir araçtır. Ayrıca, eksenel optik cımbız bireysel histon çevresindeki DNA sarma okuyan ve herhangi bir hızla işleme moleküler motor aktivite tarama için hassas bir araç olacak ve tek-molekül araç değerli yeni bir teknik olduğu ispat edilecekti.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction C–fficient
For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10:
where the following shorthand has been introduced:
The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 where ε is the relative DNA extension.