Summary
Spin-trapping spettroscopia ESR è stato utilizzato per studiare l'effetto di antiossidanti vegetali licopene, picnogenolo ed estratto di semi d'uva su scavenging fase gassosa radicali liberi nel fumo di sigaretta.
Abstract
Il fumo di sigaretta è associato a tumori umani. E 'stato riportato che la maggior parte delle morti per cancro al polmone sono causati dal fumo di sigaretta 5,6,7,12. Anche se catrami tabacco e prodotti affini in fase di particelle di fumo di sigaretta sono le principali cause di malattie correlate cancerogene e mutagene, il fumo di sigaretta contiene significative quantità di radicali liberi che sono considerati un importante gruppo di agenti cancerogeni 9,10. I radicali liberi attaccano costituenti cellulari da danneggiare la struttura delle proteine, i lipidi e le sequenze di DNA e di aumentare il rischio di sviluppare diversi tipi di tumori. Inalati producono radicali addotti che contribuiscono a molti degli effetti negativi sulla salute del fumo di tabacco nei polmoni 3. Gli studi sono stati condotti per ridurre i radicali liberi nel fumo di sigaretta per diminuire i rischi del fumo danno indotto. E 'stato riportato che l'emoglobina e di eme composti contenenti potrebbe in parte pulire l'ossido nitrico, reattivaossidanti e cancerogene nitrosocompounds volatili di 4 fumo di sigaretta. A 'bio-filtro' costituito da carbonio emoglobina e attivato è stato utilizzato per pulire i radicali liberi e di rimuovere fino al 90% dei radicali liberi dal fumo di sigaretta 14. Tuttavia, a causa del costo-inefficacia, non è stato commercializzato con successo. Un altro studio ha mostrato una buona efficienza di lavaggio shikonin, un componente di erboristeria cinese 8. Nel presente studio, riportiamo un protocollo comune per l'introduzione di estratti antiossidanti naturali nel filtro delle sigarette per lo scavenging dei radicali liberi fase gas nel fumo di sigaretta e la misurazione degli effetti scavenge sui radicali liberi in fase gassosa nel fumo di sigaretta tradizionale (MCS) con spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spettroscopia 1,2,14. Abbiamo dimostrato elevata capacità di scavenging di licopene ed estratto di semi d'uva che potrebbe indicare la loro futura applicazione nei filtri delle sigarette. Un vantaggio importante di questi professionistispazzini pective è che possono essere ottenuti in grandi quantità da sottoprodotti dell'industria pomodoro o vino rispettivamente 11,13
Protocol
1. Materiale
Tutti i solventi utilizzati in questo lavoro è stata di grado reagente. La trappola di rotazione, tra cui N-ter-butil-α-phenylnitrone (PBN) e l'etichetta di rotazione standard di 2,2,6,6-tetrametil-1-piperinyoxyl (TEMPO) sono stati ottenuti da Sigma e sono stati utilizzati come fornito. Gli antiossidanti vegetali sono stati ottenuti commercialmente da Swanson, Inc. negli Stati Uniti.
2. Preparazione del fumo di sigaretta e l'analisi dei radicali liberi
- Per introdurre gli antiossidanti nel filtro, il picnogenolo antiossidanti e estratto di semi d'uva sono stati disciolti in etanolo al 95%, mentre il licopene è stato dissolto in acetone. I volumi di solventi sono stati diversi a seconda della solubilità antiossidante.
- La quantità di antiossidanti di 0,4 mg / filtro è stato usato. Sono stati poi ricoperto con 10 mg di carbone attivo. A questo scopo carbone attivo fu in agitazione per ~ 12 ore con la soluzione antiossidante in condizioni anaerobiche, filtrato e essiccato sotto vuoto. Gli antiossidanti sono stati poi introdotti nel filtro di acetato convenzionali (CA filtro). A tal fine, il filtro è stato tagliato in due pezzi. Il rivestimento antiossidanti vegetali sono stati inseriti tra due pezzi di filtro e avvolto con un pezzo di nastro per formare un filtro - filtro antiossidante-sandwich (fig. 1A). Questo filtro combinato è stata successivamente attaccati a canne di sigarette contenenti tabacco. Il controllo è stato fatto filtrare nello stesso modo come il filtro antiossidante tranne antiossidante non è stato aggiunto.
- Prima della simulazione fumo, le sigarette di ricerca sono stati spacchettati e conservato in un ambiente di umidità costante (20 ° C, umidità relativa 60%) con una soluzione satura NaBr per un minimo di 2 giorni.
- Simulazione di fumo per analisi di routine è stato eseguito a temperatura ambiente utilizzando una singola porta del dispositivo fumo che, come mostrato in Fig.1, è costituito da un aspiratore d'acqua o GAST DOA-P104-BN Pompa a vuoto / compressore d'aria (Benton Harbor, Mich) collegato allo spin-trappingmontaggio attraverso un incrocio a T con una estremità aperta. Sbuffi sono state effettuate inserendo l'estremità aperta che è rimasto aperto tra sbuffi. Il flusso di gas è stato controllato da misuratore di portata e cala alle ~ 2.2 SCFH = 17.5 mL / s, regolando una valvola posta tra la pompa e lo sfiato.
- Le sigarette fumate di ricerca sono stati sotto la condizione del volume sfoglia di 35 ml per una durata di 2 secondi ripetuti ogni 60 secondi, simile a 1. Simulazione di fumo per la stima quantitativa della fase gassosa radicali liberi è stata effettuata in collaborazione con il sistema di spin trapping come mostrato in fig. 1.
- Dieci sbuffi intenso (35 mL / puff) sono stati prelevati per ogni sigaretta. In fase gassosa radicali liberi sono stati raccolti facendo passare la MCS attraverso un filtro di Cambridge pad e poi introdotto nella soluzione di spin trapping (0,05 M PBN in benzene, 2,0 ml).
- Dopo l'ultima boccata, la soluzione cattura bolle è stata rimaneggiata al suo volume iniziale (2,0 ml) con il benzene stesso. Un'aliquota è stato trasferito in un ~ 250 millimetri di lunghezza, 3 ID mm di vetro del tubo chiuso ad una estremità.
- La soluzione è stata deossigenato cattura utilizzando un freeze-pump-disgelo procedura. E 'stato congelato sotto azoto liquido, e il vuoto è stato applicato. Poi è stato scongelato in atmosfera di argon, permettendo bolle di gas intrappolate di fuggire, e ricongelato. Dopo questo ciclo è stato ripetuto tre volte, il tubo era fiamma sigillato sotto vuoto ed utilizzati in altre misure ESR. Questo passaggio è necessario perché l'ossigeno, che è ben solubile in benzene, amplia le linee ESR di radicali organici. Deossigenazione migliora notevolmente il rapporto segnale-rumore.
- X-Band ESR spettri sono stati registrati su uno spettrometro Bruker EMX ad una frequenza di 9,34 GHz in condizioni standard. Le impostazioni spettrometro utilizzato in maggior parte degli esperimenti sono stati: centro campo 3312.5G, scansione larghezza 80G, modulazione di ampiezza 0.5G, costante di tempo di 82 microsecondi, il tempo di scansione 40 sec.
- Il addotti rotazione trappola sono relativamente stabili alle condizioni esperimento, che in alcuni casi required 25 accumuli, che in genere si ~ 20 min. Tuttavia, dopo 12 ore l'intensità dei segnali ESR in soluzione benzene è diminuito di un fattore ~ 5.
- Per quantificare la concentrazione del addotto cattura, la sua iniziale del primo derivato spettro ESR è stato integrato. Lo spettro di assorbimento risultante mostra un ampio background singoletto, molto probabilmente a causa della fuliggine / catrame prodotti contenuti nel fumo.
Dopo la sottrazione di questo sfondo la tripletta separato del addotto cattura è stato integrato ancora una volta (Fig. 2).
3. Rappresentante Risultati
La maggior parte dei radicali liberi a bruciare sigarette prodotte in fumo (fase gas) sono istantanei e instabili. Per osservare questi radicali una tecnica trappola giro è impiegato. Cattura in fase gassosa i radicali liberi, trasformandoli in un addotto rotazione che è più stabile e può essere rilevato da ESR (Fig.1). Nel presente studio, lo spin-trappola soluzione di 0,05M PBN è stato utilizzato per la raccolta di gas fumo fase di radicali liberi, che sono una miscela di radicali di ossigeno e carbonio-centrata che sono difficili da separare 15. Nel nostro caso, tuttavia, osservato costanti splitting iperfine a N = 13.7G e H = 1.95g sono molto simili ai corrispondenti valori di cattura addotti di alcossi radicali liberi (RO.) 2, suggerendo che essi sono il prodotto principale. Abbiamo dimostrato che i segnali deboli a bassa ESR e riproducibilità osservate nelle nostre misurazioni iniziali (Fig. 2) sono stati a causa dell'umidità nel flusso di fumo. Per risolvere questo problema, abbiamo aggiunto un azoto liquido (LN2) trappola tra il filtro di Cambridge e la soluzione trappola di spin. La LN 2 trappola rimosso l'acqua dal flusso MCS da congelamento rapido e catturarlo sulla parete interna del tubo di vetro. Questo migliorato notevolmente i segnali ESR e ha permesso di risultati altamente riproducibili (Fig. 3).
La quantità di radicali liberi, intrappolati è stato determinato utilizzando uncampione di riferimento. Per i campioni di controllo, senza antiossidanti, la concentrazione addotto tipico benzene stimato dal confronto del suo spettro doppio integrale con uno spettro doppio integrale per concentrazione nota di TEMPO di 1,24 mM (Fig.2). Dal momento che la quantità di aria passa attraverso ogni sigaretta durante il fumo è stato ~ 350 ml, questo dà una stima per la concentrazione di radicali liberi in fase gassosa di MCS di ~ 7.1X10 -9 m, e un numero totale di radicali intrappolati dalla fase gassosa di una sigaretta intera ~ 1.5X10 15. Una stima per l'importo totale di radicali liberi nel fumo di una sigaretta intera, sia di gas e particolato fase, è stata ~ 10 16 radicali liberi 9.
Diversi livelli di effetto scavenging di antiossidanti vegetali in fase gassosa radicali liberi nel fumo di sigaretta principale flusso è stato osservato. I loro tassi di evacuazione sono stati presentati in fig. 4. Licopene e estratto di semi d'uva hanno mostrato i tassi più alti, mentre bassitasso di ER è stato osservato per picnogenolo (Fig.4).
Figura 1. Un diagramma di design migliorato la simulazione di fumare per la raccolta fase gassosa radicali liberi nel fumo di sigaretta tradizionale (MCS) con trappola di spin. MCS è stato redatto da un aspiratore acqua attraverso CA filtro, poi a Cambridge filtro (filtro giallo) e passato attraverso una trappola di azoto liquido per rimuovere H 2 O. La fase gassosa prodotti alla fine è andato a girare trappola e gorgogliare attraverso la soluzione trappola di spin. Antiossidante impianto è stato collocato tra due pezzi di filtri acetato convenzionali (Ampliata nel cerchio A) allegata alla sigaretta per combattere i radicali liberi nella MCS.
Figura 2. Una stima quantitativa per lo spin-trapping concentrazione di benzene richiede addotto a sottrarre un segnale ampio sfondo da l'integrazione primal spettro. I parametri di splitting iperfine per lo spin-trapping addotti sono a = 1,95 H G, una N = 13.7G.
Figura 3. Passando per LN2 trappola migliora sostanzialmente la qualità dei segnali ESR ottenuto da spin-trapping di MCS.
Figura 4. Effetto di antiossidanti naturali sulla concentrazione di radicali liberi nella MCS. Le intensità dei relativi segnali sono: controllo - 100%, picnogenolo - 55%, estratto di semi d'uva - 12%, licopene - 10%.
Discussion
Una stima attendibile degli effetti di diversi spazzini dei radicali liberi nel fumo di tabacco richiede una tecnica riproducibile per la rilevazione quantitativa dei radicali liberi. In precedenza 1, è stato dimostrato che piccole quantità di soluzioni di rotazione più elevati trappola concentrazione in solventi non polari sono più efficaci di intrappolare i radicali liberi dal fumo di tabacco. Il fumo di sigaretta contiene sempre vapore acqueo dalla combustione di composti organici e l'umidità residua nel tabacco che possono finire nel solvente cattura. Questa mescolanza di acqua nella soluzione trappola rotazione PBN diminuisce sensibilmente la durata di addotti lo spin trapping e l'intensità dei loro segnali ESR. La rimozione di questo umidità semplice MCS passando attraverso un tubo a U raffreddati con azoto liquido notevolmente migliorato la qualità degli spettri ESR nei nostri esperimenti, anche se alcune frazioni di fase gassosa potrebbe essere anche radicali intrappolati sulla superficie ghiacciata.
Usando tla sua tecnica abbiamo confrontato l'efficienza relativa dei diversi radical-scavenging composti naturali introdotto i filtri di sigarette. Abbiamo scoperto che il licopene estratto di semi d'uva e subito dopo l'integrazione nel filtri delle sigarette sono in grado di pulire fino al 90% dei radicali liberi dalla MSC fase gassosa. Tale elevata capacità di scavenging ranghi questi composti facilmente reperibili a buon mercato naturale tra i più efficienti riportato protettori dei radicali liberi come l'emoglobina e shikonine 8,14. Eppure, nei nostri filtri per sigarette esperimenti carichi di antiossidanti naturali studiato perso una parte notevole della loro capacità di scavenging dopo una settimana di conservazione a temperatura ambiente. Risolvere questo problema può stimolare futura applicazione di licopene ed estratto di semi d'uva nei filtri delle sigarette commerciali.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health, concedere No. NIH / NCRR P41-RR 016.292 (per ACERT).
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