Summary
Spin-captura de la espectroscopía ESR fue utilizado para estudiar el efecto de la planta de antioxidantes licopeno, pycnogenol y el extracto de semilla de uva en la recolección de residuos en fase gaseosa radicales libres en el humo del cigarrillo.
Abstract
El consumo de cigarrillos está asociado con cánceres humanos. Se ha informado que la mayoría de las muertes por cáncer de pulmón son causados por fumar cigarrillos 5,6,7,12. A pesar de los alquitranes del tabaco y productos relacionados en la fase de partículas del humo del cigarrillo son las principales causas de enfermedades relacionadas con carcinógenos y mutágenos, humo de cigarrillo contiene cantidades significativas de los radicales libres que también se consideran como un importante grupo de carcinógenos 9,10. Los radicales libres atacan los componentes celulares de la estructura de proteínas dañinas, los lípidos y las secuencias de ADN y aumentar el riesgo de desarrollar varios tipos de cánceres. Los radicales se inhala produce aductos que contribuyen a muchos de los efectos negativos para la salud del humo del tabaco en el pulmón 3. Se han realizado estudios para reducir los radicales libres del humo del cigarrillo para disminuir los riesgos de los daños inducidos por el tabaco. Se ha informado de que la hemoglobina y hemo-compuestos que contienen en parte podría limpiar el óxido nítrico, reactivaoxidantes y cancerígenas nitrosocompuestos volátil de 4 humo del cigarrillo. Un "filtro biológico" consistió en la hemoglobina y el carbono activado se utiliza para limpiar los radicales libres y de eliminar hasta el 90% de los radicales libres del humo del cigarrillo 14. Sin embargo, debido a la falta de efectividad de costos, no se ha comercializado con éxito. Otro estudio mostró un buen rendimiento de barrido de shikonin, un componente de la medicina china a base de hierbas 8. En el presente estudio, se presenta un protocolo común para la introducción de extractos antioxidantes naturales en el filtro del cigarrillo para eliminar los radicales libres en fase gaseosa del humo del cigarrillo y la medición del efecto de barrido de los radicales libres en fase gaseosa del humo del cigarrillo convencional (MCS) con spin-captura resonancia de spin electrónico (ESR) Espectroscopia 1,2,14. Hemos demostrado gran capacidad de barrido de licopeno y extracto de semilla de uva que podría apuntar a su futura aplicación en los filtros de cigarrillos. Una ventaja importante de estos profesionalespectivos carroñeros es que se puede obtener en grandes cantidades a partir de subproductos de la industria del tomate o el vino, respectivamente, 11,13
Protocol
1. Materiales
Todos los disolventes utilizados en este trabajo fueron de grado reactivo. La trampa de la vuelta, incluyendo N-terc-butil-α-phenylnitrone (PBN) y la etiqueta de giro estándar de 2,2,6,6-tetrametil-1-piperinyoxyl (TEMPO) se obtuvieron de Sigma y se utilizaron tal como se suministra. Los antioxidantes de plantas se obtiene comercialmente a partir de Swanson EE.UU., Inc..
2. Preparación del humo del cigarrillo y el análisis de los radicales libres
- Para introducir antioxidantes en el filtro, el pycnogenol antioxidantes y extracto de semillas de uva fueron disueltos en etanol al 95%, mientras que el licopeno se disolvió en acetona. Los volúmenes de disolventes fueron diferentes dependiendo de la solubilidad antioxidante.
- La cantidad de antioxidantes de 0,4 mg / filtro se utilizó. Que se revistieron con 10 mg de carbón activado. Para ello el carbón activado se agitó durante ~ 12 horas con la solución antioxidante en condiciones anaeróbicas, se filtra y se seca al vacío. Los antioxidantes se introdujeron entonces en el filtro de acetato convencional (CA filtro). Para ello, el filtro se cortó en dos pedazos. La cubierta de plantas antioxidantes se inserta entre dos piezas del filtro y se envuelve con un trozo de cinta para formar un filtro - antioxidantes filtro sandwich (Fig. 1A). Este filtro combinado se unió posteriormente a las barras de cigarrillos que contengan tabaco. El control de filtro se realizó en la misma forma que el filtro antioxidante excepto que no se añadió antioxidante.
- Antes de la simulación de fumar, los cigarrillos de investigación fueron desempaquetado y se mantienen en un ambiente de humedad constante (20 ° C, 60% de humedad relativa) utilizando una solución saturada de NaBr por un mínimo de 2 días.
- Simulación de fumar para análisis de rutina se realizó a temperatura ambiente usando un dispositivo de fumar de un solo puerto que, como se muestra en la Fig. 1, consiste en un aspirador de agua o GAST DOA-P104-BN bomba de vacío / compresor de aire (Benton Harbor, Michigan) conectado con el giro que atrapanmontaje a través de un cruce con un extremo abierto. Bocanadas se llevaron a cabo conectando el extremo abierto que se mantuvo abierta entre calada y calada. El flujo de gas se comprobó mediante medidor de flujo y se fijó en ~ 2.2 SCFH = 17,5 ml / s mediante el ajuste de una válvula situada entre la bomba y el ano.
- Los cigarrillos se fumaban la investigación bajo la condición de volumen bocanada de 35 ml con una duración de 2 segundos repite cada 60 segundos, similar a 1. Simulación de fumar para la estimación cuantitativa de los radicales libres en fase gaseosa se llevó a cabo en conjunción con el sistema de captura de giro como se muestra en la fig. 1.
- Diez inhalaciones intensas (35 ml / puff) fueron tomadas por cada cigarrillo. Fase gaseosa de los radicales libres fueron recogidos por pasar la MCS a través de una plataforma de Cambridge filtro y se introduce en la solución de captura de giro (0,05 M PBN en benceno, 2,0 ml).
- Después de la última dosis, la solución de captura de burbujas se reajustó a su volumen inicial (2,0 ml) con el benceno mismo. Una alícuota fue trasladado en un 25 ~0 mm de largo, 3 mm de diámetro del tubo de vidrio sellado en un extremo.
- La solución de captura fue desoxigenada mediante un procedimiento de congelación y descongelación de la bomba. Que se congeló en nitrógeno líquido, y el vacío fue aplicado. Luego fue descongelado en atmósfera de argón, lo que permite burbujas de gas se escape, y se congela de nuevo. Después de este ciclo se repitió tres veces, el tubo se llama sellado al vacío y se utiliza en más medidas de ESR. Este paso es necesario porque el oxígeno, que es muy soluble en benceno, amplía las líneas de ESR de radicales orgánicos. Desoxigenación mejora considerablemente la relación señal-ruido.
- X-Band ESR espectros se registraron en un espectrómetro Bruker EMX a una frecuencia de 9,34 GHz en condiciones normales. Los ajustes del espectrómetro utilizado en la mayoría de los experimentos fueron: el jardín central 3312.5G, escanear ancho 80G, la modulación de amplitud 0,5 G, la constante de tiempo 82 microsegundos, tiempo de exploración 40 seg.
- Los aductos trampa de giro son relativamente estables en las condiciones del experimento, que en algunos casos reqle pedirá otra vez 25 acumulaciones, que normalmente se ~ 20 min. Sin embargo, después de 12 horas la intensidad de las señales de ESR en una solución de benceno disminuye en un factor de ~ 5.
- Para cuantificar la concentración de la aducción de trampas, sus iniciales de la primera derivada del espectro de ESR se ha integrado. El espectro de absorción resultante muestra un fondo singlete amplio, muy probablemente debido a los productos de hollín / alquitrán contenidos en el humo.
Después de la sustracción de estos antecedentes, el trío separado del aducto de captura se ha integrado una vez más (Fig. 2).
3. Resultados representante
La mayoría de los radicales libres en la quema de cigarrillos de producción de humo (fase gas) son instantáneas e inestable. Con el fin de observar estos radicales una técnica trampa de spin se emplea. Captura fase gaseosa de los radicales libres por su transformación en un aducto de giro que es más estable y puede ser detectado por ESR (Fig. 1). En el presente estudio, la solución de spin-trampa de 0,05M PBN se utilizó para recoger el gas de humo fase de radicales libres, que son una mezcla de radicales de oxígeno, y se centra en carbono que son difíciles de separar 15. En nuestro caso, sin embargo, las constantes hiperfinos observa la división de un N = 13,7 g y 1,95 g H = son muy similares a los valores correspondientes para la captura de aductos de alcoxilo los radicales libres (Romanos) 2, lo que sugiere que son el producto principal. Hemos demostrado que las señales débiles ESR y reproducibilidad baja observada en nuestras mediciones iniciales (Fig. 2) se debieron a la humedad en el flujo de humo. Para resolver este problema, hemos añadido un nitrógeno líquido (LN2) trampa entre el filtro de Cambridge y la solución spin trampa. La LN 2 trampa elimina el agua del flujo de MCS de congelación rápida y la captura en la pared interior del tubo de vidrio. Esto mejoró las señales de ESR y ha permitido resultados altamente reproducibles (Fig. 3).
La cantidad de radicales libres atrapados se determinó utilizando unmuestra de referencia. Para las muestras de control sin antioxidantes, la concentración de benceno en el aducto típicas estimadas por comparación de su espectro integral doble con un espectro integral doble de concentración conocida de TEMPO fue de 1,24 M (Fig. 2). Dado que la cantidad de aire que pasa a través de cada cigarrillo se fuma fue de ~ 350 ml, lo que da una estimación de la concentración de radicales libres en la fase gaseosa de MCS de 7.1X10 ~ -9 M, y un número total de radicales atrapados de la fase gaseosa de un cigarrillo entero de 1.5x10 ~ 15. Una estimación de la cantidad total de los radicales libres en el humo de un cigarrillo entero, incluyendo tanto el gas y la fase de partículas, fue ~ 10 16 radicales libres 9.
Los diferentes niveles del efecto de barrido de la planta de antioxidantes sobre los radicales libres en fase gaseosa del humo del cigarrillo corriente principal se observaron. Sus tasas de recolección de residuos se presentan en la figura. 4. Licopeno y extracto de semilla de uva mostraron las tasas más altas mientras que los bajoser tasa se observó para el Pycnogenol (Fig. 4).
Figura 1. Un diagrama de un mejor diseño de simulación de fumar para la recogida de fase gas-radicales libres en el humo del cigarrillo convencional (MCS) con trampa de spin. MCS fue dibujado por un aspirador de agua a través de CA filtro, filtro de Cambridge (filtro amarillo) y pasa a través de una trampa de nitrógeno líquido para eliminar el H 2 O. Los productos en fase gaseosa, finalmente fue a girar trampa y burbujea a través de la solución trampa giro. Antioxidantes planta fue colocada entre dos piezas de filtros de acetato convencional (ampliada en el círculo A) conectado a los cigarrillos para eliminar los radicales libres en el MCS.
Figura 2. Una estimación cuantitativa de la concentración de aducto spin-captura en benceno requiere restar una señal de fondo amplio de la primera integraciónl espectro. Los parámetros de interacción hiperfina para el aducto spin-trampas son una H = 1,95 g, un N = 13,7 g.
Figura 3. Pasando a través de LN2 trampa mejora sustancialmente la calidad de las señales de ESR obtenidos por spin-captura de MCS.
Figura 4. Efecto de los antioxidantes naturales de la concentración de radicales libres en el MCS. La intensidad relativa de la señal son: control - 100%, el Pycnogenol - 55%, extracto de semilla de uva - 12%, el licopeno - un 10%.
Discussion
Una estimación fiable del efecto de diferentes de radicales libres en el humo del tabaco requiere de una técnica reproducible para la detección cuantitativa de los radicales libres. Previamente 1, se ha demostrado que pequeñas cantidades de soluciones de mayor concentración de la trampa de espín en solventes no polares son más eficaces para atrapar los radicales libres del humo del tabaco. El humo del cigarrillo siempre contiene vapor de agua de la combustión de compuestos orgánicos y la humedad residual en tabaco, que pueden terminar en la captura de disolventes. Esta mezcla de agua en la solución trampa PBN giro disminuye sustancialmente el tiempo de vida de los aductos de giro de captura y la intensidad de sus señales de ESR. La eliminación de esta humedad por simple MCS pasa a través de un tubo en forma de U enfriado con nitrógeno líquido mejorado dramáticamente la calidad de los espectros de ESR en nuestros experimentos, a pesar de que alguna fracción de los radicales en fase gaseosa también podría ser atrapado en la superficie congelada.
Con tsu técnica se comparó la eficacia relativa de los diferentes radicales de barrido compuestos naturales introducidos en los filtros de cigarrillos. Encontramos que el licopeno y extracto de semilla de uva inmediatamente después de la incorporación en los filtros de cigarrillos son capaces de recoger hasta el 90% de los radicales libres del MSC en fase gaseosa. Como de alta capacidad de barrido filas de estos compuestos naturales barata disponible entre las más eficientes informó protectores de los radicales libres como la hemoglobina y shikonine 8,14. Sin embargo, en nuestros filtros de cigarrillos cargados con experimentos estudiaron los antioxidantes naturales perdido una parte notable de su capacidad de recolección de residuos después de una semana de almacenamiento a temperatura ambiente. La solución de este problema se puede estimular la futura aplicación de licopeno y extracto de semilla de uva en los filtros de cigarrillos comerciales.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud, la concesión N º NIH / CNRR P41-RR 016 292 (para ACERT).
References
- Baum, S. L., Anderson, I. G. M., Baker, R. R., Murphy, D. M., Rowlands, C. C. Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure. Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).
- Bluhm, A. L., Weinstein, J., Sousa, J. A. Free radicals in tobacco smoke. Nature. 229, 500-500 (1971).
- Church, D. F., Pryor, W. A. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).
- Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J. C. Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents. Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).
- Hecht, S. S. Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).
- Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., Akimoto, H. Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer. Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).
- Nair, A. K., Brandt, E. N. Effects of smoking on health care costs. Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).
- Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., Niwano, Y. Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment. Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).
- Pryor, W. A. Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis. Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).
- Pryor, W. A. Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity. Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).
- Rozzi, N. I., Singh, R. K., Vierling, R. A., Watkins, B. A. Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts. J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).
- Shopland, D. R. Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking. Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).
- Shrikhandle, A. J. Wine products with health benefits. Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).
- Valavanidis, A., Haralambous, E. A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'. Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K. Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).
