To typer af assays til påvisning af Frog Sperm Chemoattraction
Summary
Æg og det ekstracellulære belægninger omkring æg ofte release peptider, proteiner og små molekyler, der kommunikerer med sædceller til at guide dem til ægget derved at fremme befrugtningen. Brug af frøen sædceller vi beskrive og sammenligne to klasser af assays anvendes til at påvise sædceller chemoattraction – sperm ophobning analyser og sperm sporing assays.
Abstract
Sperm chemoattraction i invertebrater kan være tilstrækkeligt robust, at man kan placere en pipette, som indeholder den attraktive peptid ind i en sædcelle suspension og mikroskopisk visualisere sæd ophobning omkring pipette 1. Sperm chemoattraction hos hvirveldyr såsom frøer, gnavere og mennesker er sværere at opdage og kræver kvantitative assays. Sådanne analyser er af to hovedtyper – analyser, at kvantificere sæd bevægelse til en kilde til chemoattractant, såkaldte sædceller akkumulation assays, og assays, der rent faktisk spore svømme baner af individuelle sædceller.
Sperm ophobning analyser er relativt hurtige tillader snesevis eller hundredvis af assays, der skal gøres på en enkelt dag, således at dosis-respons kurver og tid kurser, der skal gennemføres relativt hurtigt. Disse typer af analyser er blevet brugt i udstrakt grad til at karakterisere mange veletablerede chemoattraction systemer – for eksempel, neutrofile chemotaxis til Bacteriale peptider og sæd chemotaxis til follikulært væske. Sædceller sporing analyser kan være mere arbejdskrævende, men giver yderligere oplysninger om, hvordan chemoattractancts faktisk ændrer svømning stier, som sæd tage. Denne type analyse er nødvendig for at demonstrere orientering af sæd bevægelse i forhold til chemoattrractant gradient aksen og at visualisere karakteristiske sving eller ændringer i retning at bringe sæd tættere på ægget.
Her beskriver vi metoder, der anvendes for hver af disse to typer af analyser. Sæden ophobning udnyttet analysen kaldes en "to-kammer" analyse. Padde sæd er placeret i en vævskultur plade indsats med polycarbonat filter etage har 12 μm diameter porer. Indstik med sæd er placeret i vævskultur plade brønde indeholder buffer og en chemoatttractant forsigtigt pipetteret i bunden godt, hvor gulvet møder væggen (se fig. 1). Efter inkubation, er den øverste indsætte indeholder sædceller reservoiret omhyggeligt removed, og sæd i bunden kammeret, der har passeret gennem membranen fjernes, pelleteret og derefter tælles med hemocytometer eller flowcytometer.
Sæden sporing analysen anvender en Zigmond kammer oprindeligt udviklet til at observere neutrofil chemotaxis og modificeret til observation af sædceller ved Giojalas og kolleger 2,3. Kammeret består af en tyk glasplade, hvori to lodrette trug er blevet bearbejdet. Disse er adskilt af en 1 mm bred observation platform. Efter påføring af et dække glas, sæd er indlæst i et trug, de chemoattractant agent i den anden og flytning af de enkelte sædceller visualiseret ved hjælp af video mikroskopi. Video-optagelser er derefter analyseret ved hjælp af software til at identificere to-dimensionelle celle bevægelser i xy planet som en funktion af tiden (xyt datasæt), der udgør bane hver sædceller.
Protocol
Discussion
Chemotaxis af celler bevæger sig ved enten amoeboid bevægelse eller flageller-drevne svømning findes i mange biologiske sammenhænge og undersøgelse af dette fænomen kræver, at tilgængeligheden af praktiske og pålidelige assays. Nogle eksempler på fænomenet, såsom tiltrækning af sæd til et søpindsvin æg eller indsamling af slim mug celler til at danne en frugtsætning krop, har umiddelbar visuel effekt. Kvantificering af dette fænomen er blevet foretaget i en række forskellige måder, som beskreve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker WM Keck Bioimaging Laboratorium for brug af deres video mikroskopi arbejdsplads. Denne undersøgelse blev støttet af NSF tilskud IBN-0615435.
Materials
| Name of Item | Company | Catalogue Number | Comments |
| 24-well plates | Becton-Dickenson | 35/1147 | |
| 12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane | Millipore | PIXP01250 | We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued |
| Zigmond chamber | Neuroprobe | Z02 | |
| Silicone oil | General Electric | SF1154 | Equivalent to Dow Corning 550 Fluid |
| Image J software | Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health | Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij |
Java program that runs on Windows, Linux and Mac |
| MtrackJ software | Erik Meijering/ Imagescience/ Biomedical Imaging Group, Erasmus MC – University Medical Center Rotterdam |
Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | Java program that runs on Windows, Linux and Mac |
| Virtual Dub software | GNU General Public Licensed software | Free download via http://www.virtualdub.org/index.html | Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only |
| cellSens software | Olympus | See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070 | Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability |
References
- Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).
- Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C. Increased velocity and induction of chemotactic response in mouse spermatozoa by follicular and oviductal fluids. J. Reprod. Fertil. 115, 23-27 (1999).
- Fabro, G., Rovasio, R. A., Civalero, S., Frenkel, A., Caplan, S. R., Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Chemotaxis of capacitated rabbit spermatozoa to follicular fluid revealed by a novel directionality-based assay. Biol. Reprod. 67, 1565-1571 (2002).
- Sugiyama, H., Burnett, L., Xiang, X., Olson, J., Willis, S., Miao, A., Akema, T., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Purification and multimer formation of allurin, a sperm chemoattractant from Xenopus laevis egg jelly. Mol. Reprod. Dev. 76, 527-536 (2009).
- Al-Anzi, B., Chandler, D. Xenopus laevis egg jelly releases a sperm chemoattractant during spawning. Dev. Biol. 198, 366-375 (1998).
- Ralt, D., Goldenberg, M., Fetterolf, P., Thompson, D., Dor, J., Mashiach, S., Garbers, D. L., Eisenbach, M. Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2840-2844 (1991).
- Gakamsky, A., Schechtman, E., Caplan, S. R., Eisenbach, M. Analysis of chemotaxis when the fraction of responsive cells is small–application to mammalian sperm guidance. Int. J. Dev. Biol. 52, 481-487 (2008).
- Böhmer, M., Van, Q., Weyand, I., Hagen, V., Beyermann, M., Matsumoto, M., Hoshi, M., Hildebrand, E., Kaupp, U. B. Ca2+ spikes in the flagellum control chemotactic behavior of sperm. EMBO J. 24, 2741-2752 (2005).
- Shiba, K., Baba, S. A., Inoue, T., Yoshida, M. Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and trigger sperm chemotactic response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19312-19317 (2008).
- Burnett, L. A., Sugiyama, H., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Egg jelly proteins stimulate directed motility in Xenopus laevis sperm. Mol. Reprod. Dev. 78, 450-462 (2011).
- Abaigar, T., Barbero, J., Holt, W. V. Trajectory variance and autocorrelations within single sperm tracks as population level descriptors of sperm track complexity, predictability and energy generating ability. J. Androl. , (2011).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A., Mortimer, D. Fractal analysis of capacitating human spermatozoa. Hum. Reprod. 11, 1049-1054 (1996).
- Guerrero, A., Carneiro, J., Pimentel, A., Wood, C. D., Corkidi, G., Darszon, A. Strategies for locating the female gamete: the importance of measuring sperm trajectories in three spatial dimensions. Mol. Hum. Reprod. 17, 511-523 (2011).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17, 457-465 (2011).
- Spehr, M., Schwane, K., Riffell, J. A., Zimmer, R. K., Hatt, H. Odorant receptors and olfactory-like signaling mechanisms in mammalian sperm.Mol. Cell. Endocrinol. 250, 128-136 (2006).
- Veitinger, T., Riffell, J. R., Veitinger, S., Nascimento, J. M., Triller, A., Chandsawangbhuwana, C., Schwane, K., Geerts, A., Wunder, F., Berns, M. W., Neuhaus, E. M., Zimmer, R. K., Spehr, M., Hatt, H. Chemosensory Ca2+ dynamics correlate with diverse behavioral phenotypes in human sperm. J. Biol. Chem. 286, 17311-17325 (2011).
- Tholl, N., Naqvi, S., McLaughlin, E., Boyles, S., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Swimming of Xenopus laevis sperm exhibits multiple gears and its duration is extended by egg jelly constituents. Biol. Bull. 220, 174-185 (2011).
- Eisenbach, M. Sperm chemotaxis. Rev. Reprod. 4, 56-66 (1999).
- Riffell, J. A., Zimmer, R. K. Sex and flow: the consequences of fluid shear for sperm-egg interactions. J. Exp. Biol. 210, 3644-3660 (2007).
- Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. Tracking sperm in three-dimensions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 373, 125-129 (2008).
- Himes, J. E., Riffell, J. A., Zimmer, C. A., Zimmer, R. K. Sperm chemotaxis as revealed with live and synthetic eggs. Biol Bull. 220, 1-5 (2011).
- Sun, F., Giojolas, L. C., Rovasio, R. A., Tur-Kaspa, I., Sanchez, R., Eisenbach, M. Lack of species-specificity in mammalian sperm chemotaxis. Dev. Biol. 255, 423-427 (2003).
- Guidobaldi, H. A., Teves, M. E., Uñates, D. R., Anastasía, A., Giojalas, L. C. Progesterone from the cumulus cells is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte cumulus complex. PLoS One. 3, e3040-e3040 (2008).
- Oren-Benaroya, R., Orvieto, R., Gakamsky, A., Pinchasov, M., Eisenbach, M. The sperm chemoattractant secreted from human cumulus cells is progesterone. Hum. Reprod. 23, 2339-2345 (2008).
- Teves, M. E., Guidobaldi, H. A., Uñates, D. R., Sanchez, R., Miska, W., Publicover, S. J., Morales Garcia, A. A., Giojalas, L. C. Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by progesterone. PLoS One. 4, 8211-82 (2009).
- Blengini, C. S., Teves, M. E., Uñates, D. R., Guidobaldi, H. A., Gatica, L. V., Giojalas, L. C. Human sperm pattern of movement during chemotactic re-orientation towards a progesterone source. Asian J. Androl. 13, 769-773 (2011).
- Strünker, T., Goodwin, N., Brenker, C., Kashikar, N. D., Weyand, I., Seifert, R., Kaupp, U. B. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, 382-386 (2011).
- Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, 387-391 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-465 (1962).
- Zigmond, S. H., Lauffenburger, D. A. Assays of leukocyte chemotaxis. Annu. Rev. Med. 37, 149-155 (1986).
- Villanueva-Diaz, C., Vadillo-Ortega, F., Kably-Ambe, A., Diaz-Pérez, M. A., Krivitzky, S. K. Evidence that human follicular fluid contains a chemoattractant for spermatozoa. Fertil. Steril. 54, 1180-1182 (1990).
- Villanueva-Diaz, C., Arizs-Martinez, J., Bermejo-Martinez, L., Vadillo-Ortega, F. Progesterone induces human sperm chemotaxis. Fertil. Steril. 64, 1183-1188 (1995).
- Olson, J., Xiang, X., Ziegert, T., Kittleson, A., Rawls, A., Bieber, A., Chandler, D. E. A. l. l. u. r. i. n. a 21 kD sperm chemoattractant from Xenopus egg jelly, is homologous to mammalian sperm-binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11205-11210 (2001).
