Twee Soorten Assays voor het detecteren van Kikker Sperma chemoattractie
Summary
Eieren en de extracellulaire coatings rond eieren vaak los peptiden, eiwitten en kleine moleculen die communiceren met sperma om hen te begeleiden naar het ei daarbij het bevorderen van de bevruchting. Met behulp van kikker sperma beschrijven we en vergelijking van twee klassen van assays gebruikt om sperma chemoattractie detecteren – sperma accumulatie assays en sperma tracking assays.
Abstract
Sperma chemoattractie in ongewervelden kan voldoende robuust dat men een pipet met de aantrekkelijke peptide in een zaadcel schorsing plaats en microscopisch visualiseren sperma ophoping rond de pipet 1. Sperma chemoattractie in gewervelde dieren zoals kikkers, knaagdieren en de mens is moeilijker op te sporen en vereist kwantitatieve bepalingen. Dergelijke tests zijn twee belangrijke soorten – testen die sperma beweging kwantificeren tot een bron van chemoattractant, de zogenaamde sperma accumulatie assays, en assays die daadwerkelijk volgen het zwemmen trajecten van individuele sperma.
Sperma accumulatie tests zijn relatief snel waardoor tientallen of honderden testen gedaan worden in een enkele dag, waardoor dosis-respons curves en tijd cursussen worden uitgevoerd relatief snel. Deze types van testen uitgebreid zijn gebruikt om vele gevestigde chemoattractie systemen karakteriseren – bijvoorbeeld neutrofielen chemotaxis naar bacriaal peptiden en sperma chemotaxis naar follikelvocht. Sperma tracking testen kunnen meer arbeidsintensief zijn, maar bieden aanvullende gegevens over hoe chemoattractancts daadwerkelijk veranderen het zwembad paden die sperma te nemen. Dit type test is nodig om de oriëntatie van het sperma beweging ten opzichte van de chemoattrractant gradiënt as te tonen en karakteristieke bochten of veranderingen in de oriëntatie die de zaadcellen dichter bij het ei te visualiseren.
Hier beschrijven we methoden die worden gebruikt voor elk van deze twee soorten testen. Het sperma gebruikte accumulatie assay is een zogenaamde "twee-kamer" assay. Amfibie sperma worden geplaatst in een weefselkweek bord plaatsen met een polycarbonaat filter vloer met 12 micrometer diameter poriën. Wisselplaten met sperma worden geplaatst in weefselkweek putjes met buffer en een chemoatttractant zorgvuldig gepipetteerd in de bodem goed waar de vloer voldoet aan de muur (zie afb. 1.). Na de incubatie, de top plaatst met daarin het sperma reservoir wordt zorgvuldig removed, en sperma in de onderste kamer die zijn gepasseerd door het membraan worden verwijderd, gepelletiseerd en vervolgens geteld door hemocytometer of flowcytometer.
Het sperma tracking test maakt gebruik van een Zigmond kamer oorspronkelijk ontwikkeld voor het waarnemen van neutrofielen chemotaxis en aangepast voor observatie van sperma door Giojalas en collega's 2,3. De kamer bestaat uit een dikke glazen dia in die twee verticale troggen zijn bewerkt. Deze worden gescheiden door een 1 mm brede observatie platform. Na het aanbrengen van een afdekglas, sperma worden geladen in een trog, de chemoattractant-agent in de andere en de beweging van de individuele sperma gevisualiseerd door video microscopie. Videomateriaal wordt vervolgens geanalyseerd met behulp van software voor het twee-dimensionale cel bewegingen in het xy-vlak als een functie van de tijd (xyt data sets) dat het traject van elk sperma vorm te identificeren.
Protocol
Discussion
Chemotaxis van cellen verplaatsen door een van beide amoeboid beweging of flagella-powered zwemmen is te vinden in vele biologische contexten en de studie van dit fenomeen vereist de beschikbaarheid van praktische en betrouwbare testen. Enkele voorbeelden van het fenomeen, zoals de aantrekkingskracht van sperma naar een zee-egel ei of het verzamelen van de slijmzwam cellen aan een vruchtlichaam vormen, hebben directe visuele impact. Kwantificering van dit fenomeen is uitgevoerd in een verschillende manieren, zoals besch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de WM Keck BioImaging Laboratorium voor gebruik van hun video-microscopie werkplek. Dit onderzoek werd ondersteund door NSF subsidie IBN-0615435.
Materials
| Name of Item | Company | Catalogue Number | Comments |
| 24-well plates | Becton-Dickenson | 35/1147 | |
| 12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane | Millipore | PIXP01250 | We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued |
| Zigmond chamber | Neuroprobe | Z02 | |
| Silicone oil | General Electric | SF1154 | Equivalent to Dow Corning 550 Fluid |
| Image J software | Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health | Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij |
Java program that runs on Windows, Linux and Mac |
| MtrackJ software | Erik Meijering/ Imagescience/ Biomedical Imaging Group, Erasmus MC – University Medical Center Rotterdam |
Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | Java program that runs on Windows, Linux and Mac |
| Virtual Dub software | GNU General Public Licensed software | Free download via http://www.virtualdub.org/index.html | Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only |
| cellSens software | Olympus | See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070 | Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability |
References
- Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).
- Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C. Increased velocity and induction of chemotactic response in mouse spermatozoa by follicular and oviductal fluids. J. Reprod. Fertil. 115, 23-27 (1999).
- Fabro, G., Rovasio, R. A., Civalero, S., Frenkel, A., Caplan, S. R., Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Chemotaxis of capacitated rabbit spermatozoa to follicular fluid revealed by a novel directionality-based assay. Biol. Reprod. 67, 1565-1571 (2002).
- Sugiyama, H., Burnett, L., Xiang, X., Olson, J., Willis, S., Miao, A., Akema, T., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Purification and multimer formation of allurin, a sperm chemoattractant from Xenopus laevis egg jelly. Mol. Reprod. Dev. 76, 527-536 (2009).
- Al-Anzi, B., Chandler, D. Xenopus laevis egg jelly releases a sperm chemoattractant during spawning. Dev. Biol. 198, 366-375 (1998).
- Ralt, D., Goldenberg, M., Fetterolf, P., Thompson, D., Dor, J., Mashiach, S., Garbers, D. L., Eisenbach, M. Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2840-2844 (1991).
- Gakamsky, A., Schechtman, E., Caplan, S. R., Eisenbach, M. Analysis of chemotaxis when the fraction of responsive cells is small–application to mammalian sperm guidance. Int. J. Dev. Biol. 52, 481-487 (2008).
- Böhmer, M., Van, Q., Weyand, I., Hagen, V., Beyermann, M., Matsumoto, M., Hoshi, M., Hildebrand, E., Kaupp, U. B. Ca2+ spikes in the flagellum control chemotactic behavior of sperm. EMBO J. 24, 2741-2752 (2005).
- Shiba, K., Baba, S. A., Inoue, T., Yoshida, M. Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and trigger sperm chemotactic response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19312-19317 (2008).
- Burnett, L. A., Sugiyama, H., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Egg jelly proteins stimulate directed motility in Xenopus laevis sperm. Mol. Reprod. Dev. 78, 450-462 (2011).
- Abaigar, T., Barbero, J., Holt, W. V. Trajectory variance and autocorrelations within single sperm tracks as population level descriptors of sperm track complexity, predictability and energy generating ability. J. Androl. , (2011).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A., Mortimer, D. Fractal analysis of capacitating human spermatozoa. Hum. Reprod. 11, 1049-1054 (1996).
- Guerrero, A., Carneiro, J., Pimentel, A., Wood, C. D., Corkidi, G., Darszon, A. Strategies for locating the female gamete: the importance of measuring sperm trajectories in three spatial dimensions. Mol. Hum. Reprod. 17, 511-523 (2011).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17, 457-465 (2011).
- Spehr, M., Schwane, K., Riffell, J. A., Zimmer, R. K., Hatt, H. Odorant receptors and olfactory-like signaling mechanisms in mammalian sperm.Mol. Cell. Endocrinol. 250, 128-136 (2006).
- Veitinger, T., Riffell, J. R., Veitinger, S., Nascimento, J. M., Triller, A., Chandsawangbhuwana, C., Schwane, K., Geerts, A., Wunder, F., Berns, M. W., Neuhaus, E. M., Zimmer, R. K., Spehr, M., Hatt, H. Chemosensory Ca2+ dynamics correlate with diverse behavioral phenotypes in human sperm. J. Biol. Chem. 286, 17311-17325 (2011).
- Tholl, N., Naqvi, S., McLaughlin, E., Boyles, S., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Swimming of Xenopus laevis sperm exhibits multiple gears and its duration is extended by egg jelly constituents. Biol. Bull. 220, 174-185 (2011).
- Eisenbach, M. Sperm chemotaxis. Rev. Reprod. 4, 56-66 (1999).
- Riffell, J. A., Zimmer, R. K. Sex and flow: the consequences of fluid shear for sperm-egg interactions. J. Exp. Biol. 210, 3644-3660 (2007).
- Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. Tracking sperm in three-dimensions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 373, 125-129 (2008).
- Himes, J. E., Riffell, J. A., Zimmer, C. A., Zimmer, R. K. Sperm chemotaxis as revealed with live and synthetic eggs. Biol Bull. 220, 1-5 (2011).
- Sun, F., Giojolas, L. C., Rovasio, R. A., Tur-Kaspa, I., Sanchez, R., Eisenbach, M. Lack of species-specificity in mammalian sperm chemotaxis. Dev. Biol. 255, 423-427 (2003).
- Guidobaldi, H. A., Teves, M. E., Uñates, D. R., Anastasía, A., Giojalas, L. C. Progesterone from the cumulus cells is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte cumulus complex. PLoS One. 3, e3040-e3040 (2008).
- Oren-Benaroya, R., Orvieto, R., Gakamsky, A., Pinchasov, M., Eisenbach, M. The sperm chemoattractant secreted from human cumulus cells is progesterone. Hum. Reprod. 23, 2339-2345 (2008).
- Teves, M. E., Guidobaldi, H. A., Uñates, D. R., Sanchez, R., Miska, W., Publicover, S. J., Morales Garcia, A. A., Giojalas, L. C. Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by progesterone. PLoS One. 4, 8211-82 (2009).
- Blengini, C. S., Teves, M. E., Uñates, D. R., Guidobaldi, H. A., Gatica, L. V., Giojalas, L. C. Human sperm pattern of movement during chemotactic re-orientation towards a progesterone source. Asian J. Androl. 13, 769-773 (2011).
- Strünker, T., Goodwin, N., Brenker, C., Kashikar, N. D., Weyand, I., Seifert, R., Kaupp, U. B. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, 382-386 (2011).
- Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, 387-391 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-465 (1962).
- Zigmond, S. H., Lauffenburger, D. A. Assays of leukocyte chemotaxis. Annu. Rev. Med. 37, 149-155 (1986).
- Villanueva-Diaz, C., Vadillo-Ortega, F., Kably-Ambe, A., Diaz-Pérez, M. A., Krivitzky, S. K. Evidence that human follicular fluid contains a chemoattractant for spermatozoa. Fertil. Steril. 54, 1180-1182 (1990).
- Villanueva-Diaz, C., Arizs-Martinez, J., Bermejo-Martinez, L., Vadillo-Ortega, F. Progesterone induces human sperm chemotaxis. Fertil. Steril. 64, 1183-1188 (1995).
- Olson, J., Xiang, X., Ziegert, T., Kittleson, A., Rawls, A., Bieber, A., Chandler, D. E. A. l. l. u. r. i. n. a 21 kD sperm chemoattractant from Xenopus egg jelly, is homologous to mammalian sperm-binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11205-11210 (2001).
