Deux types de tests pour la chimio-attraction Frog sperme Détection
Summary
Les œufs et les revêtements extracellulaire autour des œufs fréquemment communiqué peptides, protéines et petites molécules qui communiquent avec le sperme pour les guider vers l'ovule favorisant ainsi la fécondation. En utilisant le sperme de grenouille nous décrire et comparer deux classes de tests utilisés pour détecter la chimio-attraction des spermatozoïdes – essais d'accumulation de sperme et des tests de suivi du sperme.
Abstract
Chimio-attraction du sperme chez les invertébrés peuvent être suffisamment robuste que l'on peut placer une pipette contenant le peptide attractifs en une suspension de spermatozoïdes et de l'accumulation de sperme au microscope de visualiser autour de la pipette de 1. Chimio-attraction du sperme chez les vertébrés comme les grenouilles, les rongeurs et les humains est plus difficile à détecter et nécessite des dosages quantitatifs. Ces essais sont de deux types principaux – des dosages qui quantifier le mouvement des spermatozoïdes à une source de chimiotactique, dits tests de l'accumulation de sperme, et des essais qui fait suivre les trajectoires individuelles de natation de sperme.
Dosages d'accumulation de sperme sont relativement rapides permettant des dizaines ou des centaines de tests à faire en une seule journée, permettant ainsi aux courbes dose-réponse et des cours de temps pour être réalisée relativement rapidement. Ces types de tests ont été largement utilisées pour caractériser les nombreux systèmes chimio-attraction bien établi – par exemple, chimiotaxie des neutrophiles au bacpeptides pièces et de sperme à la chimiotaxie liquide folliculaire. Dosages de suivi du sperme peut être plus de travail mais offrent des données supplémentaires sur la façon chemoattractancts vraiment altérer les chemins de natation que le sperme prendre. Ce type de test est nécessaire pour démontrer l'orientation du mouvement des spermatozoïdes par rapport à l'axe du gradient chemoattrractant et de visualiser tourne caractéristique ou les changements d'orientation qui mettent le sperme plus proche de l'œuf.
Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour chacune de ces deux types de tests. Le dosage de l'accumulation du sperme utilisé est appelé un "deux chambres" dosage. Le sperme d'amphibiens sont placés dans un insert plaque de culture de tissu avec un plancher de filtre en polycarbonate ayant des pores de diamètre 12 um. Inserts avec les spermatozoïdes sont placés dans des puits de culture de tissu plaque contenant du tampon et une chemoatttractant attentivement la pipette dans le fond du puits où le plancher et le mur (voir Fig. 1). Après incubation, l'insert supérieure contenant le réservoir de spermatozoïdes est soigneusement removed, et du sperme dans la chambre de fond qui ont traversé la membrane sont enlevées, granulés et ensuite comptés par hémocytomètre ou cytomètre en flux.
Le test de suivi du sperme utilise une chambre Zigmond initialement développé pour l'observation de la chimiotaxie des neutrophiles et modifiés pour l'observation de spermatozoïdes par Giojalas et collègues 2,3. La chambre se compose d'une lame de verre épais dans lequel deux auges verticaux ont été usinées. Ce sont séparées par une plate-forme d'observation de 1 mm de large. Après application d'un couvercle en verre, les spermatozoïdes sont chargés dans une auge, l'agent chimiotactique dans l'autre et le mouvement des spermatozoïdes individuels visualisées par microscopie vidéo. Des images vidéo sont ensuite analysées en utilisant le logiciel pour identifier les mouvements cellulaires à deux dimensions dans le plan xy en fonction du temps (XYT ensembles de données) qui forment la trajectoire de chaque spermatozoïde.
Protocol
Discussion
Chimiotactisme des cellules en mouvement par le mouvement soit amiboïde ou de flagelles alimenté par la natation se trouve dans de nombreux contextes biologiques et l'étude de ce phénomène requiert la disponibilité des tests pratiques et fiables. Quelques exemples de ce phénomène, comme l'attraction des spermatozoïdes à un œuf de l'oursin ou le ramassage des cellules moisissure visqueuse pour former un corps de fructification, ont un impact visuel immédiat. La quantification de ce phénomène a ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Laboratoire WM Keck Bioimaging pour l'utilisation de leur poste de travail vidéo microscopie. Cette étude a été soutenue par NSF Grant IBN-0615435.
Materials
| Name of Item | Company | Catalogue Number | Comments |
| 24-well plates | Becton-Dickenson | 35/1147 | |
| 12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane | Millipore | PIXP01250 | We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued |
| Zigmond chamber | Neuroprobe | Z02 | |
| Silicone oil | General Electric | SF1154 | Equivalent to Dow Corning 550 Fluid |
| Image J software | Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health | Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij |
Java program that runs on Windows, Linux and Mac |
| MtrackJ software | Erik Meijering/ Imagescience/ Biomedical Imaging Group, Erasmus MC – University Medical Center Rotterdam |
Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | Java program that runs on Windows, Linux and Mac |
| Virtual Dub software | GNU General Public Licensed software | Free download via http://www.virtualdub.org/index.html | Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only |
| cellSens software | Olympus | See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070 | Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability |
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