Zwei Arten von Assays zum Nachweis von Frog Sperm Chemotaxis
Summary
Eier und der extrazellulären Beschichtungen um Eier häufig Release Peptiden, Proteinen und kleinen Molekülen, die Kommunikation mit Spermien, um sie an das Ei fördert damit die Befruchtung führen. Mit Frosch Spermien wir beschreiben und vergleichen zwei Klassen von Assays verwendet, um Spermien Chemoattraktion erkennen – Sperma Anhäufung Assays und Spermien-Tracking-Tests.
Abstract
Sperm Chemotaxis bei Wirbellosen kann ausreichend robust, dass man eine Pipette mit dem attraktiven Peptid in eine Spermiensuspension Ort und mikroskopisch sichtbar Spermien Ansammlung rund um die Pipette 1. Sperm Chemotaxis bei Wirbeltieren wie Fröschen, Nagern und Menschen ist schwieriger zu erkennen und erfordert quantitative Assays. Solche Tests sind zwei Haupttypen – Tests, die Spermien Bewegung zu quantifizieren, um eine Quelle der Lockstoff, sogenannte Spermien Anhäufung Assays und Assays, die tatsächlich verfolgen den Swimming Flugbahnen der einzelnen Spermien.
Sperm Anhäufung Assays sind relativ schnell was Dutzende oder Hunderte von Tests in einem einzigen Tag durchgeführt werden, wodurch Dosis-Wirkungs-Kurven und Zeit Kurse relativ schnell durchgeführt werden. Diese Arten von Assays wurden ausgiebig zu vielen etablierten Chemoattraktion Systeme zu charakterisieren – zum Beispiel, Chemotaxis neutrophiler zu bacterial Peptide und Spermien-Chemotaxis zu Follikelflüssigkeit. Sperma-Tracking-Tests können arbeitsintensiver werden, bieten aber zusätzliche Daten, wie chemoattractancts tatsächlich verändern Schwimmen Wege, die Spermien zu nehmen. Diese Art von Test ist notwendig, um die Orientierung der Spermien Bewegung relativ zur chemoattrractant Farbverlaufsachse zu demonstrieren und zu charakteristischen Windungen oder Änderungen in der Ausrichtung, dass die Spermien näher an das Ei zu visualisieren.
Hier beschreiben wir Methoden für jede dieser beiden Arten von Tests verwendet. Die Spermien Anhäufung Test verwendet wird als "Zwei-Kammer"-Test. Amphibien-Spermien sind in einem Gewebekulturplatte Einsatz mit einem Polycarbonat-Filter Etage mit 12 Mikrometer Durchmesser Poren gelegt. Inserts mit Spermien werden in Gewebekulturplatte Vertiefungen mit Puffer und ein chemoatttractant vorsichtig in den Boden gut, wo der Boden erfüllt die Wand (siehe Abb. 1). Pipettiert platziert. Nach der Inkubation wird die oben einfügen, welche die Spermien-Reservoir sorgfältig rentfernt hat, und Spermien in die untere Kammer, die durch die Membran passiert haben, werden entfernt, pelletiert und dann von Hämozytometer oder Durchflusszytometer gezählt.
Die Spermien-Tracking-Test verwendet eine Zigmond Kammer ursprünglich zur Beobachtung Neutrophilen-Chemotaxis entwickelt und modifiziert für die Beobachtung von Spermien durch Giojalas und Mitarbeiter 2,3. Die Kammer besteht aus einer dicken Glasplatte, in die zwei senkrechte Rinnen bearbeitet worden sind. Diese werden durch eine 1 mm breite Aussichtsplattform getrennt. Nach der Anwendung eines Deckglases, Spermien in eine Mulde geladen sind, visualisiert die Lockstoff-Agent in die andere und die Bewegung der einzelnen Spermien durch Video-Mikroskopie. Video footage wird dann analysiert mit Hilfe von Software zweidimensionalen Zelle Bewegungen in der xy-Ebene als Funktion der Zeit (xyt Datensätze), dass die Flugbahn jedes Spermium Form zu identifizieren.
Protocol
Discussion
Chemotaxis von Zellen bewegen entweder durch amöboide Bewegung oder Flagellen-powered Schwimmen ist in vielen biologischen Zusammenhängen gefunden und Erforschung dieses Phänomens erfordert die Verfügbarkeit von praktischen und zuverlässigen Tests. Einige Beispiele für das Phänomen, wie Anziehung von Spermien einer Seeigel-Ei oder das Sammeln von Schleimpilz-Zellen zu einem Fruchtkörper zu bilden, haben unmittelbare visuelle Wirkung. Die Quantifizierung dieses Phänomens ist in eine Vielzahl von Möglichkeiten, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der WM Keck Bioimaging Laboratory für die Nutzung ihrer Video-Mikroskopie Arbeitsplatz. Diese Studie wurde von der NSF gewähren IBN-0615435 gefördert.
Materials
| Name of Item | Company | Catalogue Number | Comments |
| 24-well plates | Becton-Dickenson | 35/1147 | |
| 12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane | Millipore | PIXP01250 | We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued |
| Zigmond chamber | Neuroprobe | Z02 | |
| Silicone oil | General Electric | SF1154 | Equivalent to Dow Corning 550 Fluid |
| Image J software | Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health | Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij |
Java program that runs on Windows, Linux and Mac |
| MtrackJ software | Erik Meijering/ Imagescience/ Biomedical Imaging Group, Erasmus MC – University Medical Center Rotterdam |
Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | Java program that runs on Windows, Linux and Mac |
| Virtual Dub software | GNU General Public Licensed software | Free download via http://www.virtualdub.org/index.html | Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only |
| cellSens software | Olympus | See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070 | Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability |
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