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Biology

पता लगाने मेंढक शुक्राणु Chemoattraction के लिए दो Assays के प्रकार

doi: 10.3791/3407 Published: December 27, 2011

Summary

अंडे और अंडे के आसपास कोशिकी कोटिंग्स अक्सर पेप्टाइड्स, प्रोटीन और छोटे अणुओं जारी है कि शुक्राणु के साथ संवाद उन्हें अंडे जिससे निषेचन को बढ़ावा देने का मार्गदर्शन करने के लिए. मेंढक शुक्राणु का उपयोग हम वर्णन और शुक्राणु chemoattraction का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया assays के दो वर्गों की तुलना - शुक्राणु संचय assays और शुक्राणु ट्रैकिंग assays.

Protocol

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1. सामग्री और इस्तेमाल किया बफ़र्स

  1. Oocyte घंटी बफर (1.5 x OR2) 124 मिमी NaCl, 3.75 मिमी KCl, 1.5 मिमी 2 CaCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 1.5 मिमी ना 2 4 HPO, 10 मिमी Hepes होते हैं, 7.8 पीएच. निषेचन बफर (एफ 1) 41.25 मिमी NaCl, 1.25 मिमी KCl, .25 मिमी 2 CaCl, .06 मिमी MgCl 2, 0.5 मिमी ना 2 HPO 4, 2.5 मिमी Hepes, 7.8 पीएच शामिल हैं.
  2. Xenopus laevis अंडे पानी Sugiyama एट अल के अनुसार तैयार किया जाता है 4. . संक्षेप में वर्णित है, हौसले से पैदा जेली का सा मेंढक अंडे F-1 बफर के 30 मिनट और वातानुकूलित micropipette द्वारा हटा मध्यम के लिए एक छोटी मात्रा में swirled हैं. इस मध्यम, "अंडा पानी" करार दिया है, यह भी शुद्ध allurin, इस जेली निकालने में प्राथमिक chemoattractant तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. शुक्राणु वाणिज्यिक नस्ल Xenopus laevis या Xenopus tropicalis से प्राप्त कर रहे हैं.
  3. विशिष्ट टी में आवश्यक वस्तुओं के लिए सामग्री तालिका देखेंवह परख.

2. मेंढक शुक्राणु chemotaxis के लिए एक दो कक्ष परख

  1. 0.07% benzocaine युक्त पानी में विसर्जन के द्वारा मेंढक anesthetize, कारबरंडम धार कैंची की एक जोड़ी है, और डबल मज्जा का उपयोग करने के लिए इच्छामृत्यु सुनिश्चित सिर काटना. दूर पेट की मांसपेशियों बेनकाब त्वचा कट में. पेट की मांसपेशियों में midline और पार्श्व में कटौती करें और वापस लेना. धीरे से आंतों और सफेद, सेम के आकार testes प्रकट करने के लिए वसा को वापस लेना. दूर संयोजी ऊतक का उपयोग कर ठीक रक्त वाहिकाओं से बचने के लिए सावधान किया जा रहा कैंची छाँटो. वृषण निकालें, दूर किसी भी 1.5 x OR2 बफर का उपयोग रक्त धोने, तो फिल्टर पेपर पर वृषण रोल करने के लिए अतिरिक्त बफर और छोटे पक्षपाती रक्त वाहिकाओं को हटाने, और फिर एक प्लास्टिक Pitre डिश में 1.5 x OR2 बफर के 0.2 मिलीलीटर में वृषण जगह. 1.5 x OR2 बफर के 2 मिलीग्राम के साथ एक 5 मिलीलीटर सिरिंज भरें, धीरे से एक छोर पर सतह के सबसे अधिक वृषण में 10-20 छेद प्रहार, सुई विपरीत अंत में सम्मिलित और धीरे बफर इंजेक्षन करने के लिए शुक्राणु बाहर फ्लश. एक वैकल्पिक रूप से,बफर इंजेक्षन जबकि बाहर निकलें छेद poking शुक्राणु बाहर फ्लश कर सकते हैं. शुक्राणु एक microcentrifuge ट्यूब एक कट ऑफ (शुक्राणु के बाल काटना परहेज) बर्फ और टिप जगह के साथ एक micropipette का उपयोग निलंबन स्थानांतरण.
  2. मेंढक 1.5 या 2 एक्स में शुक्राणु 1:100 गिराए और मिश्रित शुक्राणु निलंबन की एक 20 μl नमूना लेने और hemocytometer और बड़े 1 मिमी 2 क्षेत्र का उपयोग कोशिकाओं की संख्या की गणना के द्वारा प्राप्त शुक्राणु की संख्या का अनुमान है. Hemocytometer गिनती और नमूने अनुपात का प्रयोग शुक्राणु घनत्व और काटा शुक्राणु की कुल संख्या की गणना. यह कुल आमतौर पर 2 - x 6 के बारे में 2 मिलीलीटर की मात्रा में 7 10 शुक्राणु जब दोनों testes उपयोग किया जाता है. 2 x 10 7 मिलीलीटर / शुक्राणु घनत्व प्राप्त करने के शेयर 1.5 x OR2 बफर के साथ शुक्राणु निलंबन पतला. तैयारी के 2 से 3 घंटे के भीतर परख के लिए शुक्राणु का उपयोग करें. F-1 बफर और visualizing आंदोलन चरण विपरीत प्रकाशिकी का उपयोग के साथ शुक्राणु 1:10 के 5 μl गिराए द्वारा शुक्राणु गतिशीलता का आकलन करें. शुक्राणु की कम से कम 40% से 50%चलता - फिरता जा चाहिए. यहां तक ​​कि उपयुक्त तैयारी immotile शुक्राणु की एक बड़ी संख्या है जिनमें से अधिकांश अपरिपक्व हैं शामिल होंगे.
  3. प्रत्येक कुएं में F1 बफर के 700 μl micropipetting द्वारा एक नया 24 अच्छी तरह से प्लास्टिक ऊतक संस्कृति की थाली तैयार करो. हर अच्छी तरह के बारे में 15 मिमी तल पर व्यास में होना चाहिए.
  4. F1 के बफर के 900 μl के साथ कमरे के तापमान पर शुक्राणु निलंबन के 100 μl गिराए (लगभग 21 से 23 डिग्री सेल्सियस) एक microcentrifuge ट्यूब में आसमाटिक सदमे से शुक्राणु गतिशीलता को सक्रिय करके assays की एक श्रृंखला शुरू करो. इस तरह से हर समय ताजा शुक्राणु सक्रिय है, शुक्राणु 1-2 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए.
  5. में एक 12 सुक्ष्ममापी porosity डालने (12 मिमी ओवर ड्राफ्ट) प्लेस एक बफर अच्छी तरह से भरा; डालने नियुक्ति एक तरफ एक जगह छोड़ने से केंद्र है सुनिश्चित करें. तुरंत अच्छी तरह से में एक कट ऑफ टिप होने micropipette द्वारा की गतिशीलता शुक्राणु सक्रिय 400 μl हस्तांतरण. फ़िल्टर डालने की दीवार के लिए शुक्राणु निलंबन लागू करें और यह नीचे फिल्टर पर वीं के नीचे चलाने के लिए अनुमति देते हैंई सम्मिलित; शुक्राणु निलंबन फिल्टर पर सीधे नहीं pipetted जाना चाहिए.
  6. और अच्छी तरह से बंद केंद्र फ़िल्टर डालने के बीच अंतरिक्ष में अच्छी तरह से में ध्यान micropipette 50 chemoattractant एजेंट के μl. एक ड्रॉप जहां पक्ष और अच्छी तरह से नीचे को पूरा करने और व्यवस्था करने के लिए कोई अशांति के साथ विंदुक निकालने जमा करने के लिए सावधान किया जाना चाहिए. विशेष रूप से, micropipette पर सवार केवल पहले बंद पूरी तरह से इतनी के रूप में नमूना लेकिन कोई हवाई बुलबुले बाहर फैंकना करने के लिए धक्का दिया जाना चाहिए.
  7. दोहराएँ 2.5 कदम और 2.6 ऊपर के रूप में कई assays शुरू के रूप में की जरूरत है, तो थाली सेते हैं जब तक पहली बार शुरू किया परख 50 मिनट incubated है. आमतौर पर, एक एक परख हर 45 से 60 सेकंड के शुरू कर सकते हैं. ध्यान दें कि परख एक अनुभवी व्यक्ति द्वारा या दो व्यक्तियों द्वारा एक साथ काम सुव्यवस्थित किया जा सकता है. इस मामले में, assays के एक या दो पंक्तियों गतिशील शुक्राणु का एक बड़ा स्टॉक है और तेजी से है कि शुक्राणु प्रदान pipetting के साथ शुरू किया जा सकता है है हमेशा के 1 से 2 मिनट के भीतर उपयोग किया जाता हैसक्रियण.
  8. बंद करो अनुक्रम में प्रत्येक परख शुरू कर दिया. सबसे पहले, ध्यान से स्थिर एक हाथ से और दूसरे के साथ फ़िल्टर डालने ध्यान सबसे हटाने या सभी micropipette या एक पाश्चर विंदुक के साथ चूषण द्वारा ऊपरी कक्ष में शुक्राणु निलंबन की. तत्काल, एक ठीक चिमटी का उपयोग कर, बाहर फ़िल्टर डालने खींच और त्यागें. केयर इस कदम पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए, कम से कम शेष शुक्राणु artifactually शुक्राणु पारित करने के लिए मूल्यों जुटाने फिल्टर के माध्यम से बह जाना.
  9. प्रत्येक थाली से अच्छी तरह से, एक microcentrifuge ट्यूब पूरे शुक्राणु निलंबन हस्तांतरण. यह अच्छी तरह से में वापसी से पहले शुक्राणु निलंबन के बाद से शुक्राणु के लिए नीचे के लिए व्यवस्थित करते हैं मिश्रण महत्वपूर्ण है. 0.5% v / वी के अंतिम एकाग्रता के लिए 25% formaldehyde के 15 μl जोड़ें और सर्द अगर शुक्राणु गिनती एक ही दिन नहीं कर रहे हैं.
  10. गोली एक व्यक्तिगत microcentrifuge 2000 की एक अधिकतम गति होने पर एक 10 सेकंड पुश बटन स्पिन का उपयोग कर प्रत्येक ट्यूब में शुक्राणु x जी लेकिन सभी supernat के 100 μl निकालेंप्रत्येक ट्यूब से चींटी, तो उस मात्रा में गोली resuspend. शुक्राणु निलंबन के 20 μl लो, आसुत जल के साथ 1:10 पतला है, और एक एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर एक 40x उद्देश्य का उपयोग hemocytometer पर शुक्राणु गिनती. मायने रखता है और कमजोर पड़ने कारकों का उपयोग करने के लिए शुक्राणु की कुल संख्या है कि प्रत्येक परख में फिल्टर के माध्यम से पारित की गणना करने के लिए.

3. मेंढक शुक्राणु ट्रैकिंग परख Zigmond कक्ष का उपयोग

  1. Videotaping के लिए उलटा माइक्रोस्कोप वर्कस्टेशन तैयार. हम एक Nikon Elipse TE300 औंधा या तो एक सोनी DXC 390 3 चिप रंग एनालॉग वीडियो कैमरा या एक हमामात्सू ORCA-03G मोनोक्रोम डिजिटल कैमरा के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. Zigmond चैम्बर स्लाइड मंच पर ऊपर नीचे की ओर मंच थाली में पर्याप्त खोलने के साथ आराम करने के लिए चाहिए एक 22x40 मिमी कवर कांच को समायोजित. तथ्य यह है कि मेंढक शुक्राणु गुरुत्वाकर्षण के खिलाफ तैरना करने में असमर्थ रहे हैं द्वारा यह व्यवस्था जरूरी है. अवलोकन दोनों के बीच चल रहा मंच पर फोकस या तो एक 4x या 10x उद्देश्य लेंसtroughs.
  2. टेस्ट को यकीन है कि कैमरा केंद्रित है और अवलोकन मंच पर केन्द्रित. यदि सोनी कैमरा प्रयोग किया जाता है, उत्पादन में एक वीडियो मॉनीटर और एक ए / डी कनवर्टर (फ्रेम धरनेवाला) वीडियो संकेत से 7 फ्रेम प्रति सेकंड अंकीयकरण के लिए सक्षम करने के लिए भेजा है. डिजिटल धारा 3 गीगा या अधिक से अधिक 4 जीबी या राम के अधिक के साथ अधिमानतः चल रहे कंप्यूटर का उपयोग करने के लिए कार्रवाई की है. हालांकि हम वंशज छवि (एनआईएच छवि की एक कस्टम Windows संस्करण) सॉफ्टवेयर एक वंशज तटरक्षक 7 फ्रेम धरनेवाला को नियंत्रित करने का उपयोग करें, इन उत्पादों अब उपलब्ध नहीं हैं. एक मौजूदा समाधान एनालॉग वीडियो कैमरे पर कब्जा करने के लिए एक VirtualDub प्लग में साथ छवि जम्मू सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए है. यदि हमामात्सू कैमरे का प्रयोग किया जाता है, अपने डिजिटल उत्पादन ओलिंप cellSens सॉफ्टवेयर द्वारा संसाधित है और कंप्यूटर मॉनीटर पर प्रदर्शित. दोनों ही मामलों में, डेटा या तो एक 8 बिट झगड़ा ढेर के रूप में एक आंतरिक या बाह्य हार्ड ड्राइव पर सहेजा है. वंशज छवि सॉफ्टवेयर के प्रयोग झगड़ा छवि अनुक्रम का एक ढेर का उपयोग कर छवि जे करने के लिए रूपांतरण की आवश्यकता है
  3. F1 के बफर में एक उपयुक्त एकाग्रता में chemoattractant तैयार करें. Xenopus laevis शुक्राणु तैयार के रूप में पहले वर्णित है और उपयोग करें जब तक बर्फ पर 1.5 x OR2 बफर में दुकान .
  4. Zigmond चैम्बर इकट्ठा. एक सूखी साफ कक्ष के साथ शुरू करो. एक micropipette से 5 मिमी और प्रत्येक गर्त के बाहरी छोर के लिए समानांतर जगह के बारे में सिलिकॉन तेल (4 μl) की एक पंक्ति का उपयोग करना. सिलिकॉन तेल समान रूप से प्रत्येक गर्त के बाहरी छोर के लिए प्रसार करने के लिए अनुमति चैम्बर पर एक 22x40 मिमी कवर कांच रखें. यदि प्रारंभिक प्रयोगों चलता है कि शुक्राणु चिपके एक समस्या है, एक nitrocellulose के साथ कवर कांच के कोट करने के लिए की आवश्यकता FABRO एट अल द्वारा सुझाव दिया के रूप में हो सकता है 3. Alternatively इस्तेमाल किया (जैसे 1% BSA) बफ़र्स में प्रोटीन का समावेश भी शुक्राणु चिपके को कम कर सकते हैं.
  5. चैम्बर और खुर्दबीन कि कवर गिलास संपर्क चरण के साथ नहीं कर सकता है सावधान किया जा रहा चरण में परिपत्र cutout पर जगह उलटें. इस औंधा विन्यास के मंच पर गर्त से Xenopus शुक्राणु लाने के लिए आवश्यक है . स्तनधारी शुक्राणु के विपरीत, Xenopus शुक्राणु मजबूत गुरुत्वाकर्षण के खिलाफ तैरने करने के लिए मंच तक पहुँचने के लिए पर्याप्त नहीं हैं.
  6. कमरे के तापमान पर F1 बफर के साथ मिश्रण 1:10 द्वारा 1.5 x OR2 बफर में Xenopus शुक्राणु की 20 μl सक्रिय करें . एक कटौती के टिप के साथ एक micropipette का प्रयोग, तुरंत गर्त में सक्रिय शुक्राणु गतिशीलता के 70 μl हस्तांतरण. यह एक कम कोण पर micropipette पकड़ और गर्त की ओर खोलने पर टिप रखने द्वारा हासिल की है. सेल निकली निलंबन गर्त और केशिका कार्रवाई द्वारा पुल भरता है. अगले ही एक chemoatttractant समाधान का उपयोग करने के तरीके में विपरीत गर्त भरें.
  7. 3 मिनट के भीतर वीडियोटैपिंग शुरू (Xenopus शुक्राणु एक सीमित गतिशीलता जीवनकाल) और 5 मिनट के लिए जारी है. वीडियोटैपिंग के अंत में, कक्ष जुदा और पानी के दबाव स्ट्रीम और फिर एक धारा निकलना बोतल से इथेनॉल के साथ troughs और प्रेक्षण मंच धो लो. कागज सावधान किया जा रहा अवलोकन मंच और troughs नहीं दूषित पोंछे के साथ ऊपरी सतहों से सिलिकॉन तेल निकालें.
  8. यदि आवश्यक हो, एक झगड़ा छवि अनुक्रम या ढेर छवि जम्मू सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कब्जा कर लिया वीडियो डेटा परिवर्तित. फिर छवि जम्मू और पहले 21 तख्ते (3 सेकंड) फ़ाइल खोलने के 50 शुक्राणु के लिए चुनने के लिए पता लगाया जा. पूर्वाग्रह से बचने के अवलोकन क्षेत्र के सभी क्षेत्रों से शुक्राणु और उनके प्रक्षेपवक्र डेटा के ज्ञान के बिना चुना. समय (xyt डेटा सेट) के एक समारोह के रूप में xy विमान में दो आयामी सेल trajectories प्रत्येक शुक्राणु के लिए बिंदु द्वारा कैप्चर और माउस के क्लिक के मॉड्यूल में प्लग MtrackJ का उपयोग कर छवि जे कल्पना के लिए trajectories और प्रक्षेपवक्र गणनादूरी, अक्ष घटकों और MtrackJ भीतर वेग. वैकल्पिक रूप से, बाहर xyt डेटा आयात द्वारा इन आपरेशनों और आगे संख्यात्मक विश्लेषण (जैसे दिशात्मकता, chemotaxis मापदंडों और पैरामीटर histograms) ले Microsoft Excel में सेट है.
  9. Excel में प्रत्येक शुक्राणु के लिए रेखीय, वक्रीय, और परिपत्र के रूप में अच्छी तरह के रूप में पैटर्न बदल जाता है के रूप में ऐसी सुविधाओं सहित आंदोलन की समग्र पैटर्न का पता लगाने के लिए प्लॉट trajectories. और शाफ़्ट और उन्मुखीकरण यात्रा की औसत ढाल अक्ष के सापेक्ष कोण के रूप में इस तरह के मापदंडों - xyt डेटा का उपयोग औसत वक्रीय वेग एक्स के साथ शुद्ध यात्रा (ढाल) की गणना करने के लिए सेट.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

दो कक्ष परख में महत्वपूर्ण तकनीकी मानकों के आकार और कक्ष के आकार, झिल्ली के porosity, और ऊष्मायन की लंबाई हैं. ऊपरी कक्ष पकड़े शुक्राणु के आकार व्यास में इतनी बड़ी नहीं हो के रूप में (पूर्व शुक्राणु की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता चाहिएferably कम 0.5 या मिलीलीटर) और न ही ऊपरी सदन इतनी गहरी सेल निलंबन के एक उच्च स्तंभ (<1 सेमी) के रूप में बनाने के लिए होना चाहिए. निचले सदन ऊपरी सदन डालने के आसपास बफर की मात्रा वास्तव में इतनी के रूप में बनाने के लिए नहीं है कि artifactually झिल्ली के माध्यम से शुक्राणु को मजबूर कर देगी transmembrane हीड्रास्टाटिक दबाव डालने में सेल निलंबन के स्तर मैच चाहिए. तल में खाली डालने अच्छी तरह से पहले, एक प्रारंभिक ऊपर हीड्रास्टाटिक दबाव है कि लोड करने के दौरान झिल्ली के माध्यम से जा रहा से शुक्राणु को रोकता में शुक्राणु लोड हो रहा है परिणामों से बाद की नियुक्ति. झिल्ली रोमकूप आकार के विकल्प शुक्राणु के आकार, और झरझरा झिल्ली आवेषण के वाणिज्यिक उपलब्धता के द्वारा निर्धारित किया जाता है. हम पाते हैं कि मेंढक शुक्राणु के साथ assays या तो 8 या 12 सुक्ष्ममापी व्यास pores के उपयोग के लिए हालांकि 12 सुक्ष्ममापी ताकना शुक्राणु की उच्च संख्या अधिक सटीक गिनती की अनुमति के पारित करने के लिए प्रदान कर सकते हैं. 12 सुक्ष्ममापी की तुलना में अधिक से अधिक ध्यान में लीन होना आकार के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो दिखाई नहीं देते. ती का उपयोग करने के लिए एक विकल्पssue संस्कृति आवेषण Neuroprobe 96 अच्छी तरह प्लेटें में chemotaxis assays के लिए डिजाइन झिल्ली के उपयोग है. ये एक संभावित अधिक throughput और ताकना व्यास की एक व्यापक श्रेणी प्रदान करते हैं. हालांकि बड़े स्तनधारी शुक्राणु के लिए एक बड़ा ताकना व्यास की आवश्यकता प्रतीत होता है, हम सफलतापूर्वक माउस शुक्राणु 12 सुक्ष्ममापी है pores (बर्नेट, अप्रकाशित टिप्पणियों) के साथ आवेषण का उपयोग chemotaxis assayed है. इसके विपरीत, छोटे ताकना आकार छोटे शुक्राणु (जैसे समुद्री साही) के लिए पर्याप्त हो सकता है हालांकि हम अभी तक इस संभावना का परीक्षण नहीं किया है हो सकता है.

दो कक्ष में वर्णित परख का एक नुकसान यह है कि शुक्राणु के ऊपर इस प्रकार अनिवार्य रूप से गंभीरता से कुछ शुक्राणु बीतने में जिसके परिणामस्वरूप कक्ष में रखा जाता है, इस प्रकार पृष्ठभूमि अनुपात करने के लिए संकेत कम. यह तथ्य है कि Xenopus शुक्राणु उनकी गतिशीलता में काफी जोरदार गुरुत्वाकर्षण के खिलाफ तैरने के रूप में स्तनधारी शुक्राणु नहीं कर रहे हैं के द्वारा जरूरी है. Xenopus शुक्राणु परख करने की क्रिया में एक और कठिनाई तथ्य यह है कि उनकी गतिशीलता मैंसक्रियकरण के बाद 5 से 15 मिनट - ife समय कम है. यह प्रतिबंध हर 2 से 3 मिनट शुक्राणु जब एकाधिक assays ले जाने के एक नए बैच को सक्रिय करने की ज़रूरत के लिए आधार है. एक परिणाम के रूप में, समय बेशक अध्ययनों से पता चला है कि सबसे शुक्राणु बीतने 5 परख के पहले 20 मिनट के भीतर होता है . यद्यपि हम एक 50 मिनट ऊष्मायन अवधि का उपयोग करें, इस अवधि की संभावना 20 या 30 मिनट के लिए shorted किया जा सकता है. इसके विपरीत, जो घंटे के लिए चलता - फिरता रहना माउस शुक्राणु के लिए, हम अच्छे परिणाम (बर्नेट, अप्रकाशित टिप्पणियों) के साथ एक परख की 2 घंटे की अवधि के लिए इस्तेमाल किया है.

दो कक्ष मेंढक शुक्राणु का उपयोग परख में, झरझरा झिल्ली के माध्यम से गुजर शुक्राणु की कुल संख्या आम तौर पर हजार 10 से 20 या ऊपरी सदन डालने में रखा शुक्राणु के बारे में 1 से 2%. निचले सदन में एक chemoattractant ढाल की उपस्थिति 4 से 10 गुना के रूप में ज्यादा के रूप में शुक्राणु बीतने बढ़ा सकते हैं. चित्रा 2 एक ठेठ खुराक प्रतिक्रिया इस परख के साथ प्रदर्शन वक्र दिखाता है. एक extrअधिनियम के Xenopus अंडे जेली ("अंडा पानी") ज्ञात chemoattractant प्रोटीन allurin (लाल हलकों) युक्त, dilutions की एक श्रृंखला पर नीचे कक्ष में रखा गया था. कुल अंडे पानी प्रत्येक परख में निहित प्रोटीन micrograms / परख में दिया जाता है - मूल 50 μl मात्रा में राशि वितरित. चूंकि दिया प्रोटीन प्रसार ढाल के रूप में होगा, प्रोटीन की वास्तविक एकाग्रता रेंज है कि शुक्राणु का जवाब ज्ञात नहीं बल्कि दिया बूंद के प्रोटीन एकाग्रता से कम 5 से 10 गुना होने का अनुमान किया जा सकता है है. इस कारण से, हम प्रोटीन की मात्रा शुरू की एकाग्रता नहीं, निरूपित. आमतौर पर हम प्रत्येक खुराक और परिणाम के औसत के लिए डुप्लिकेट या तीन प्रतियों assays के प्रदर्शन, हम तो पूरे प्रयोग 3 या 4 बार प्रत्येक प्रयोग में विभिन्न पुरुषों से शुक्राणु का उपयोग करने को दोहराने. मतलब का मतलब और मानक त्रुटि की मानक त्रुटि के साथ प्रत्येक खुराक के लिए गणना की है आम तौर पर मतलब है की 5 से 10% जा रहा मतलब है. Kno के बिना है कि प्रोटीन नोटwn chemoattractant गतिविधि गोजातीय सीरम albumin (खुला हलकों, चित्र 2) के रूप में एक निम्न स्तर, झिल्ली के माध्यम से गैर विशिष्ट शुक्राणु के पारित होने में वृद्धि का उत्पादन हो सकता है. एक दिलचस्प अवलोकन है कि अंडे पानी के लिए खुराक प्रतिक्रिया वक्र multiphasic है - एक बढ़ती चरण और एक कम चरण है. Multiphasic रिश्ते का इस प्रकार शुक्राणु chemoattractants के लिए आम है, मानव शुक्राणु के कूपिक तरल पदार्थ के लिए प्रतिक्रिया एक समान biphasic संबंध 6 कि सोचा है कि एक अंडे के आसपास के क्षेत्र में पाया chemoattractant के उच्च सांद्रता में उपयोगी हो करने के लिए आगे खोज प्रतिक्रियाओं को कम करने में सेवा कर सकता है दिखाता है शुक्राणु की ओर से.

कभी कभी हम पाते हैं कि इस परख के लिए नियंत्रण मूल्यों सामान्य से अधिक कर रहे हैं, इस तरह गुना वृद्धि chemoattractant द्वारा उत्पादित को कम करने. आमतौर पर, इस परख के दौरान फ़िल्टर डालने के यांत्रिक व्यवधान करने के लिए पता लगाया जा सकता है. इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि आवेषण जबकि शुक्राणु या चे लोड हो रहा परेशान नहीं कर रहे हैंmoattractant परख ऊष्मायन के दौरान या जब डालने निकाल दिया जाता है. विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि शुक्राणु जलाशय में डालने से पहले अच्छी तरह से बाहर डालने उठाने micropipette या चूषण द्वारा हटा दिया जाता है. यह सुनिश्चित करता है कि शुक्राणु नीचे चेंबर में झरझरा झिल्ली के माध्यम से बह नहीं है के रूप में सम्मिलित निकाल दिया जाता है.

Zigmond कक्ष परख में महत्वपूर्ण तकनीकी मानकों coverglass और प्रेक्षण मंच, वीडियो अवलोकन के आवर्धन के बीच की दूरी, इस्तेमाल किया प्रकाशिकी के प्रकार, और फ्रेम दर शामिल हैं. अवलोकन मंच के बीच दूरी आम तौर पर 10 से 15 सुक्ष्ममापी हालांकि यह दूरी कवर ग्लास और चैम्बर स्लाइड के बीच इंटरफेस करने के लिए इस्तेमाल किया सिलिकॉन तेल की राशि से अलग किया जा सकता है - अधिक तेल, अधिक से अधिक दूरी. तरल पदार्थ की एक पतली विमान फार्म के लिए ढाल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक बार का गठन ढाल की लंबी उम्र के लिए की जरूरत समय की राशि बढ़ जाती है. तरल पदार्थ का एक मोटा विमान एक और अधिक तेजी से छ अनुमति देता हैradient गठन लेकिन ढाल के एक छोटे जीवनकाल और कम स्थिरता है. ढाल गठन की गतिशीलता को अच्छी तरह से chemoattractant में एक फ्लोरोसेंट रंजक या एक फ्लोरोसेंट dextran का उपयोग माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति का उपयोग करने के लिए गतिशीलता को देखने के द्वारा visualized किया जा सकता है. परीक्षण अभिकर्मक आणविक वजन में इस्तेमाल किया जा रहा है chemoattractant और गतिशीलता न्यायाधीश कितने मिनट ढाल और शुक्राणु आंदोलनों के गठन की रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति दी जानी चाहिए करने के लिए इस्तेमाल किया निर्धारित करने के लिए मिलान किया जाना चाहिए.

प्रयोग किया जाता बढ़ाई कम समग्र (4x या 10x उद्देश्य) हो सकता है अगर पूरे अवलोकन मंच परख शर्तों हम वर्णित है के रूप में visualized किया जा चाहिए. दूसरी ओर, उच्च आवर्धन (40x या 63x उद्देश्य) उपयोगी हो सकता है अगर एक अपेक्षाकृत कम प्रक्षेपवक्र क्षेत्रों या इच्छाओं की निगरानी कशाभ गतियों को हल करना चाहता है हो सकता है. ट्रैकिंग बाहर किया जा सकता है या तो अर्द्ध मैनुअल तरीके से इस पत्र में या स्वचालित ट्रैकिंग द्वारा वर्णित के रूप में के रूप में अधिक शराबी में अभ्यासhisticated MetaMorph या Imaris ट्रैक जैसे सॉफ्टवेयर संकुल. या तो मामले में, पर नज़र रखने में आसानी छवि के विपरीत चाहे वह ऑपरेटर द्वारा या सॉफ्टवेयर की सहायता वस्तु मान्यता द्वारा पर बहुत निर्भर है. हालांकि उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाशिकी कुछ मामलों में इस्तेमाल किया जा सकता है, चरण विपरीत प्रकाशिकी का उपयोग करें या darkfield प्रकाशिकी आमतौर पर आवश्यक है. अंत में, फ्रेम दर समय पर नज़र रखने में वांछित संकल्प पर निर्भर करता है. 4 से 8 फ्रेम प्रति सेकंड - यदि अर्द्ध मैनुअल तरीके के रूप में हमारे प्रक्रिया में उपयोग किया जाता है, शायद एक अपेक्षाकृत कम फ्रेम दर के लिए सीमित रिकॉर्डिंग डेटा के श्रम गहन प्रकृति के कारण है. दूसरी ओर, वीडियो दर टिप्पणियों कशाभ लहर रूपों जैसे तेजी से प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हो सकता है. अकसर प्रयोगात्मक लक्ष्यों सबसे अच्छा धीमी फ्रेम दर प्रयोगों और तेजी से फ्रेम दर प्रयोगों अलग कर के बाद से एक भी बढ़ाई, प्रकाशिकी, या डिजिटल इमेज प्रोसेसिंग जैसे अन्य मानकों को बदलने की इच्छा से कार्य कर रहे हैं.

Zigm के लिए विशिष्ट परिणामदूसरी चैम्बर ट्रैकिंग परख 1 मूवी की वीडियो क्लिप में पचास मेंढक शुक्राणु के लिए देखा उन लोगों की तरह trajectories के एक सेट से मिलकर बनता है. अवलोकन मंच की एक छवि के खिलाफ है, व्यक्ति के शुक्राणु के trajectories लाल रंग में एक नियंत्रण प्रयोग (कोई chemoattractant ढाल वर्तमान) के लिए पता लगाया जाता है. प्रत्येक शुक्राणु के लिए समय के एक समारोह के रूप में xy विमान में दो आयामी सेल trajectories और प्लॉट MtrackJ द्वारा लॉग इन और Microsoft Excel में आयात किया जा सकता है. प्रक्षेपवक्र विश्लेषण के लिए, हम chemoattractant ढाल अक्ष को X-अक्ष और orthogonal धुरी के रूप में Y-अक्ष के रूप में नामित मूल FABRO एट अल द्वारा विकसित सम्मेलन के साथ संगत 3.. चित्रा 3 के चित्र में दिखाया गया है, वास्तविक लिया प्रक्षेपवक्र कदम से बना है, का योग है जिसकी लंबाई वक्रीय प्रक्षेपवक्र (नीला / सोने तीर) में कूच दूरी के बराबर होती है. शुद्ध दूरी और यात्रा के प्रत्येक शुक्राणु से उन्मुखीकरण एक प्रक्षेपवक्र की पहली और आखिरी बिंदु (लाल विकर्ण तीर) को जोड़ने वेक्टर है.शुद्ध यात्रा उसके घटक X-अक्ष और Y-अक्ष घटक में अलग किया जा सकता है (लाल डैश्ड तीर भी शुद्ध डेल्टा एक्स और शुद्ध डेल्टा वाई, क्रमशः करार दिया).

क्योंकि हड्डीवाला शुक्राणु में chemotaxis यात्रा की दिशा में अपेक्षाकृत सूक्ष्म पाली शामिल कर सकते हैं, शुक्राणु की एक बड़ी संख्या (100 300), बेतरतीब ढंग से चुनी, आमतौर पर प्रत्येक अक्सर 4 से 6 स्वतंत्र प्रयोगों से pooled डेटा की आवश्यकता हालत के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. उदाहरण के प्रयोजनों के लिए, तथापि, हम केवल पचास मेंढक शुक्राणु से डेटा का उपयोग करेंगे. तालिका 1 आम शुक्राणु यात्रा में परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया पैरामीटर दिखाता है. X-अक्ष के साथ मतलब शुद्ध यात्रा में काफी वृद्धि अगर chemoattractant की उपस्थिति में, एक पूरे के रूप में शुक्राणु की जनसंख्या trajectories है कि और अधिक बारीकी से ढाल के साथ तालमेल के बाद होगा. हमारे उदाहरण में, मतलब शुद्ध यात्रा X-अक्ष अंडे पानी की उपस्थिति में तीन गुना से अधिक वृद्धि हुई है. एक भी शुक्राणु आबादी है जो लाभ के लिए शुद्ध यात्रा X-अक्ष के एक हिस्टोग्राम साजिश कर सकते हैं tage कि उत्तरदायी शुक्राणु के छोटे subpopulations पता लगाया जा सकता है. FABRO एट अल 3. द्वारा विकसित दो मापदंडों भी ऐसी आबादी का पता लगाने में मदद कर सकते हैं. सकारात्मक निवल यात्रा X-अक्ष (% ΔX> 0) दिखा शुक्राणु के दोनों प्रतिशत और शुद्ध रैखिक यात्रा दिखा शुक्राणु की प्रतिशतता नहीं ढाल (% ΔX / | ΔY |> 1) अक्ष से 45 डिग्री से अधिक नाटकीय रूप से वृद्धि कर सकते हैं अगर पूरे शुक्राणु जनसंख्या या छोटे, लेकिन अभी भी महत्वपूर्ण मात्रा द्वारा chemoattractant के प्रति संवेदनशील है अगर शुक्राणु की subpopulations संवेदनशील होते हैं. तालिका 1 में हमारे उदाहरण के पचास मेंढक एक अंडे पानी ढाल उजागर करने के लिए शुक्राणु के लिए दोनों मानकों में वृद्धि से पता चलता है. ध्यान दें कि गैर उन्मुख यादृच्छिक आंदोलन 50% के इन मानकों के दोनों और 25% क्रमशः के लिए गैर शून्य मान दे देंगे, नियंत्रण मानों (जैसे तालिका 1 में उन) की तुलना में उच्च के कारण या तो एक कम नमूना नंबर या पृष्ठभूमि का प्रतिनिधित्व प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए विशेष रूप से शुक्राणु अभिविन्यास में एक पूर्वाग्रह के लिए.

> chemoattractant एजेंटों के लिए प्रतिक्रिया में शुक्राणु यात्रा की दिशात्मकता सामग्री "सीधे थीटा, प्रत्येक शुक्राणु और ढाल (एक्स) अक्ष के लिए शुद्ध यात्रा के वेक्टर के बीच कोण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. हमारे उदाहरण में तालिका 1 से पता चलता है कि मतलब थीटा की कमी हुई एक अंडा पानी का संकेत है कि किसी जनसंख्या के रूप में शुक्राणु trajectories बेहतर ढाल के साथ गठबंधन शुद्ध यात्रा X-अक्ष (ऊपर देखें) के लिए इसी प्रकार के थे. ढाल में शुक्राणु तैराकी के लिए, शुक्राणु की आबादी के लिए thetas एक वितरण के रूप में व्यक्त किया जा सकता है, एक दृष्टिकोण भी संवेदनशील उत्तरदायी शुक्राणु और एक है कि हाल ही में Gakamsky एट अल 7 द्वारा अध्ययन किया गया था subpopulations के लिए.

अंत में, व्यक्ति के शुक्राणु के लिए वक्रीय और तात्कालिक वेग भी समय के एक समारोह के रूप में xy विमान में दो आयामी सेल trajectories का वर्णन डेटा से निकाला जा सकता है. एक कि वहाँ वेग में वृद्धि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से यात्रा के अभिविन्यास में एक बदलाव है मिल जाए, इस प्रकार chemokinetic के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रतिक्रिया का सुझाव हो सकता हैएक chemotactic प्रतिक्रिया.

इन आंकड़ों शुक्राणु trajectories के विश्लेषण के लिए एक प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करते हैं. Bohmer एट अल के रूप में द्वारा किए गए एक पल पल के आधार पर आगे के विश्लेषण प्रक्षेपवक्र linearity और वक्रता माप 8 और 9 Shiba एट अल, के स्वचालित पता लगाने के रूप में बदल जाता बर्नेट एट अल द्वारा बाहर किए गए. 10, और nonlinearity के रूप में शामिल हैं. सकता भग्न 11,12 विश्लेषण द्वारा लगाया. बशर्ते कि इन trajectories तैराकी शुक्राणु उच्च बढ़ाई निगरानी कर रहे हैं, एक भी छवि कशाभ गतियों और वास्तविक समय कैल्शियम संकेतों के रूप में कई प्रयोगशालाओं 8,9,13,14,15,16 द्वारा में किए गए. इस तरह के अध्ययन दिखा दिया है कि दोनों invertebrate और स्तनधारी शुक्राणु chemoattractant स्रोत की ओर ढाल ऊपर शुक्राणु के तेजी से बदल जाता द्वारा chemoattractants का जवाब. ये बदल जाता है कशाभ झुकता है कि एक पतवार के रूप में ज्यादा शुक्राणु ओरिएंटेशन बदल के साथ कर रहे हैं, झुकता दिखाई परिभाषित, लहर ली द्वारा शुरूके कैल्शियम संकेतों कशाभिका के माध्यम से प्रचार. इस प्रकार, शुक्राणु ट्रैकिंग का अंतिम लक्ष्य कशाभ प्रणोदन में परिवर्तन है कि एक chemotactic ढाल में शुक्राणु उन्मुखीकरण के आधार के रूप में सेवा के साथ सिस्टम गतिशीलता संकेत सहसंबंधी है. अभी तक इन लक्ष्यों Xenopus शुक्राणु है जो एक चक्करदार गति में 17 यात्रा में पहुँचा जा, अपने 10 trajectories में कम वक्रता एक्ज़िबिट, और कैल्शियम जिसका संकेतों अभी तक नजर रखी जा.

हालांकि हम यहाँ परख तरीकों हम Xenopus laevis शुक्राणु के लिए उपयोग का विवरण, दोनों दो शुक्राणु चैम्बर संचय परख और Zigmond चैम्बर ट्रैकिंग परख स्तनधारी शुक्राणु के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर कुछ संशोधनों बना रहे हैं पर ध्यान केंद्रित किया है. दोनों assays 37 पर बाहर किया जा सकता डिग्री सेल्सियस अगर वांछित है, और एक गर्म स्लाइड के उपयोग से Zigmond कक्ष परख, एक खुर्दबीन मंच गरम में. आमतौर पर, स्तनधारी शुक्राणु अलग - थलग हो जाएगा capacitated और उचित स्तनधारी buffers का उपयोग कर एक incubatedघ chemoattractants, लेकिन डेटा विश्लेषण यहाँ क्या उभयचर प्रजाति के लिए वर्णित है समान हो जाएगा. एक और अंतर यह है कि Zigmond चैम्बर आम तौर पर एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के मंच पर सीधा रखा स्तनधारी शुक्राणु के बाद से, Xenopus शुक्राणु के विपरीत, अवलोकन मंच पर तैर कर सकते हैं. अभी तक untested के रूप में, इन दो assays के आवेदन भविष्य के काम में प्रजातियों में से एक नंबर के शुक्राणु के लिए देख सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 दो कक्ष परख के योजनाबद्ध आरेख. शुक्राणु एक डालने के नीचे जो 12 सुक्ष्ममापी pores के साथ एक polycarbonate फ़िल्टर में रखा जाता है. एक chemoattractant समाधान ध्यान से अच्छी तरह से में pipetted है एक एकाग्रता ढाल के गठन आरंभ.

चित्रा 2
चित्रा 2 मेंढक शुक्राणु के लिए प्रतिनिधि डेटा का उपयोग कर दो कक्ष शुक्राणु chemotaxiपरख. अंडे पानी एक्स से तैयार laevis अंडे अवस्थायाँ वक्र खुराक गतिविधि है कि शुक्राणु chemoattractants की विशेषता है दर्शाती है . गोजातीय सीरम albumin बढ़ जाती है शुक्राणु केवल थोड़ा बीतने - प्रोटीन का एक nonspecific प्रभाव है. चित्रा अल Anzi और चांडलर 5 से संशोधित.

मूवी 1. मेंढक शुक्राणु trajectories दिखा एक वीडियो क्लिप में एक Zigmond चैम्बर के अवलोकन मंच पर लाल रंग में प्लॉट किए जाते हैं . मंच की चौड़ाई 1 मिमी है. लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो क्लिप देखने.

चित्रा 3
चित्रा 3. ऐक्सिस सम्मेलनों, एक शुक्राणु वक्रीय और शुद्ध रैखिक यात्रा के लिए एक वेक्टर प्रक्षेपवक्र Zigmond कक्ष अवलोकन मंच पर प्लॉट किए जाते हैं. प्राप्त आंकड़ों के तीन प्रकार के हैं. सबसे पहले, शुक्राणु खुद trajectories (/ नीले सोने तीर) विशेष पैटर्न र प्रकट कर सकते हैंहलकों और बदल जाता है (तारांकनों) के रूप में चर्चा. वक्रीय दूरी और वक्रीय वेग प्रक्षेपवक्र पथ के लिए मापा जा सकता है है. दूसरा, शुद्ध रेखीय दूरी पूरे प्रक्षेपवक्र, शुद्ध एक्स (ढाल) यात्रा की धुरी घटक पर कूच, यात्रा का शुद्ध वाई अक्ष घटक और एक्स अक्ष और शुद्ध यात्रा के वेक्टर के बीच कोण थीटा प्रत्येक प्रक्षेपवक्र के लिए गणना की जा सकती और सभी ट्रैक किए गए शुक्राणु अधिक वितरण के रूप में की तुलना में. तीसरा, वेग और व्यक्तिगत trajectories के भीतर वर्गों के लिए यात्रा की दिशा में तात्कालिक परिवर्तन या तो व्यक्तिगत रूप से या किसी जनसंख्या के रूप में अध्ययन किया जा सकता है. ऊपर, चैम्बर के एक पक्ष को देखने के एक चित्र में प्रस्तुत किया है.

तालिका 1.
1 टेबल पैरामीटर Zigmond कक्ष से डेटा का विश्लेषण करने में अक्सर इस्तेमाल किया .

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Discussion

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या तो अमीबीय आंदोलन या flagella संचालित तैराकी से बढ़ कोशिकाओं की chemotaxis कई जैविक संदर्भों में पाया जाता है और इस घटना के अध्ययन के व्यावहारिक और विश्वसनीय assays की उपलब्धता की आवश्यकता है. घटना के कुछ उदाहरणों में, समुद्री साही अंडा या कीचड़ ढालना कोशिकाओं की सभा के लिए एक फलने शरीर फार्म करने के लिए शुक्राणु के आकर्षण के रूप में तत्काल दृश्य प्रभाव है. इस घटना के quantitation 18 Eisenbach द्वारा वर्णित के रूप में तरीकों की एक किस्म में किया गया है. इन assays capillaries के शुक्राणु को आकर्षित करने के लिए, capillaries का उपयोग जलाशयों में शामिल होने के लिए और एक Makler कक्ष शुक्राणु और chemoattractant के लिए होने के कुओं की ढाल उपयोग बनाने के लिए भरा chemoattractant का उपयोग शामिल है. यह कागज दो "दूसरी पीढ़ी" assays कि अब अधिक बार उपयोग किया जाता है वर्णन करता है. हालांकि इन assays के लिए एक ढाल वे कई नई सुविधाओं को शामिल बनाने की आवश्यकता पर अभी भी भरोसा है. सबसे पहले, दो कक्ष परख फायदा है कि कई झिल्ली samp pores केले शुक्राणु बीतने ढाल भर में एक केशिका खोलने के बजाय अधिक शुक्राणु की अनुमति के लिए एक एकल परख में ढाल परीक्षण.

निर्देशित सेल आंदोलन के पैटर्न chemotaxis में एक प्रमुख विशेषता है और यह स्वाभाविक है कि कोशिकाओं पर नज़र रखने के लिए नए स्वरूप विकसित किया गया है. एक नया स्वरूप, शुक्राणु trajectories के तीन आयामी स्कैनिंग के रूप में वे एक अंडा दृष्टिकोण. शुक्राणु पदों का पता लगाने इन्फ़रा लाल प्रकाश की एक चलती विमान का प्रयोग, Zimmer और उनके सहयोगियों ने अंडे केंद्रित के साथ एक कक्ष में शुक्राणु प्रक्षेपवक्र डेटा प्रदान की है - एक युक्ति है कि प्राकृतिक chemoattractant स्रोत का उपयोग करता है और अपेक्षाकृत दूर दीवारों कि अन्यथा प्राकृतिक शुक्राणु आंदोलन को बाधित सकता है 19. वैकल्पिक रूप से, Corkidi एट अल. एक उच्च फ्रेम दर के साथ एक लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्य के तेजी से आंदोलनों के संयोजन के तीन आयामी trajectories 20 पर कब्जा प्रणाली विकसित की है. हाल ही में इस तरह के उपकरणों में शुक्राणु गतियों का विश्लेषण ध्रुवीय coordina के उपयोग के द्वारा सुविधा किया गया है है21 tes और ग्युरेरो एट अल. हाल ही में भविष्य के 13 अध्ययन में शुक्राणु chemotaxis के तीन आयामी टिप्पणियों के लिए की जरूरत पर बल दिया.

इसके विपरीत, कार्तीय निर्देशांक का उपयोग Zigmond कक्ष, एक युक्ति है कि सैली Zigmond द्वारा न्युट्रोफिल अभिविन्यास और chemotaxis अध्ययन और पहले Giojalas और 2,3 सहकर्मियों द्वारा शुक्राणु chemotaxis के अध्ययन में उपयोगी हो सकता है दिखाया के लिए विकसित किया गया था द्वारा सुविधा है . Chemoattractant की एक रैखिक गर्त के बजाय chemoattractant के एक बिंदु स्रोत का प्रयोग एक रासायनिक ढाल एक रेडियल समन्वय प्रणाली के बजाय एक XY समन्वय प्रणाली में स्थापित करने के लिए अनुमति देता है. Giojalas मनुष्य, चूहों, खरगोश और steers के शुक्राणु में chemotaxis का अध्ययन करने के लिए इस परख आवेदन किया है और लग रहा है कि डिम्बग्रंथि के रोम से तरल पदार्थ chemoattractant 2,3,22 शामिल है की पुष्टि की . हाल ही में, Giojalas और Eisenbach कि मेघपुंज अंडे भी चारों ओर की कोशिकाओं से उतर दिया प्रोजेस्टेरोन का प्रदर्शन किया हैएक शुक्राणु chemoattractant 23-26 के रूप में कार्य करता है. दरअसल, हाल ही में प्रोजेस्टेरोन शुक्राणु में Catsper चैनलों के उद्घाटन ट्रिगर करने के लिए कैल्शियम संकेतों का आरंभ है दिखाया गया है शुक्राणु झुकने कशाभ और जिससे शुक्राणु 27,28 तैराकी की दिशा को संशोधित करने के लिए सोचा.

Zigmond चैम्बर दोनों फायदे और नुकसान है. एक लाभ यह है कि शुक्राणु में ऑप्टिकल सादगी रहे हैं एक सेट फोकल हवाई जहाज़ में बनाए रखा और जेड आयाम का कोई स्कैनिंग आवश्यक है. एक और लाभ यह है कि ज्यादातर जांचकर्ताओं को और अधिक परिचित हैं और नए अपेक्षाकृत आम गणित के साथ तैयार मानकों के परीक्षण को प्रोत्साहित कार्तीय निर्देशांक का उपयोग है. दूसरी ओर, Zigmond कक्ष एक स्थिति है कि विपरीत प्रकृति में पाया बनाता है. शुक्राणु के लिए करीब रेंज में दो दीवारों के बीच तैर बना रहे हैं कि संभावना कशाभ लहर रूपों के अपने प्रदर्शनों की सूची के रूप में के रूप में अच्छी तरह परिणामस्वरूप बलों के परिणाम को प्रभावित. इसी तरह, chemoattractant इस्तेमाल आमतौर पर रासायनिकछितरी हुई है और अलग से एक अंडे से घटित होता है. अंत में, दीवारों से चिपके हुए शुक्राणु एक संभावित समस्या यह है कि एक तीन आयामी कक्ष में मौजूद नहीं होगा.

जबकि कुछ जांचकर्ताओं का सुझाव है कि शुक्राणु ट्रैकिंग शुक्राणु chemotaxis अध्ययन करने के लिए केवल विश्वसनीय तरीका है, इन दोनों प्रयोगात्मक और डेटा विश्लेषण चरणों में assays श्रम गहन अगर अर्द्ध मैनुअल बजाय स्वचालित तरीकों का इस्तेमाल किया जाता है हो सकता है. इस कारण के लिए, दो कक्ष परख तरह assays यहाँ वर्णित है मात्रात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा कि chemotaxis के लिए सबूत प्रदान कर सकते हैं देने के लिए इस्तेमाल किया गया है. परख के इस प्रकार Boyden कक्ष, जिसमें एक न्युट्रोफिल निलंबन एक झरझरा फ़िल्टर 29 बाधा की सतह के साथ संपर्क में रखा गया था के साथ जन्म लिया है. एक chemoattractant समाधान एक रासायनिक ढाल फिल्टर के भीतर फार्म खुद को अनुमति देता है फिल्टर के विपरीत पक्ष के साथ संपर्क में रखा गया था. फिल्टर मैट्रिक्स में प्रवेश कक्ष या तो हो सकता है और दाग सकता है मीटर गिनाicroscopically या यदि radioactively लेबल, एक जगमगाहट काउंटर में गिना. यह दृष्टिकोण आगे बड़े ताकना polycarbonate फिल्टर के उपयोग के द्वारा विकसित किया गया था, जिसके माध्यम से chemotaxing कोशिकाओं को वास्तव में दो कक्ष परख में यहाँ 5 वर्णित के रूप में पारित सकता है.

पहले हम मेंढक शुक्राणु chemotaxis के एक उपाय के रूप में दो कक्ष परख पुष्टि की है. सबसे पहले, attractant के रूप में अंडे पानी का उपयोग, हम पता चला है कि शुक्राणु के पारित होने के फिल्टर के माध्यम से उत्तेजना की आवश्यकता है कि एक एकाग्रता ढाल नीचे कक्ष में एक chemoattractant की एक बूंद के बयान से बनाया जा. यदि chemoattractant मिश्रण से नीचे कक्ष बफर भर में छितरी हुई है, शुक्राणु आंदोलन 5 प्रेरित नहीं है . शीर्ष कक्ष में chemoattractant के अलावा दूसरा, एक "रिवर्स ढाल" के निर्माण के शुक्राणु के पारित होने को प्रोत्साहित नहीं करता है. अंत में, हम पाते हैं कि शुक्राणु ट्रैकिंग प्रयोगों Zigmond कक्ष में, शुक्राणु गतिशीलता और वेग में हैकम शुक्राणु ढाल करने के लिए सापेक्ष यात्रा (बर्नेट, अप्रकाशित टिप्पणियों) की दिशा की परवाह किए बिना या नहीं बदला. यह पिछले अवलोकन महत्वपूर्ण है क्योंकि यह बताया गया है कि शुक्राणु गतिशीलता के inhibitors वास्तव में धीमा सकता है या रासायनिक इस प्रकार कि chemotaxis 18 के रूप में गलत हो सकता है शुक्राणु की एक artifactual संचय पेश स्रोत के पास शुक्राणु रोक.

इन निरंतर बावजूद, शुक्राणु संचय ऐसे दो कक्ष परख assays के लिए अत्यंत उपयोगी श्रम की बचत उपकरण है कि बैक्टीरियल 29,30 पेप्टाइड्स के लिए न्युट्रोफिल chemotaxis निस्र्पक में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, स्तनधारी शुक्राणु chemoattraction की आरंभिक खोज में कूपिक तरल पदार्थ और progesterone साबित हुई है 6,31,32, और शुद्धि और मेंढक शुक्राणु chemoattractant allurin 4,5,33 के लक्षण वर्णन में है .

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम अपने वीडियो माइक्रोस्कोपी काम स्टेशन के उपयोग के लिए WM उबकना Bioimaging प्रयोगशाला धन्यवाद. इस अध्ययन NSF आईबीएन 0615435 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates BD Biosciences 35/1147
12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane EMD Millipore PIXP01250 We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued
Zigmond chamber Neuroprobe Z02
Silicone oil GE Healthcare SF1154 Equivalent to Dow Corning 550 Fluid
Image J software Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij Java program that runs on Windows, Linux and Mac
MtrackJ software Biomedical Imaging Group Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ Java program that runs on Windows, Linux and Mac
Virtual Dub software GNU General Public Licensed Free download via http://www.virtualdub.org/index.html Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only
cellSens software Olympus Corporation See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070 Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability

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पता लगाने मेंढक शुक्राणु Chemoattraction के लिए दो Assays के प्रकार
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Burnett, L. A., Tholl, N., Chandler, D. E. Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction. J. Vis. Exp. (58), e3407, doi:10.3791/3407 (2011).More

Burnett, L. A., Tholl, N., Chandler, D. E. Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction. J. Vis. Exp. (58), e3407, doi:10.3791/3407 (2011).

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