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Biology

감지 개구리 정자 Chemoattraction에 대한 Assays 두 종류의

Published: December 27, 2011
doi:
10.3791/3407
, ,
1Department of Animal Sciences,University of Illinois, Urbana-Champaign, 2School of Life Sciences,Arizona State University

Summary

달걀 주위에 계란과 세포외 코팅 자주 정자와 통신이이를 수정을 홍보 계란 그들을 안내하는 것을 펩티드, 단백질, 작은 분자를 놓습니다. 정자의 누적 assays와 정자 추적 assays – 우리가 정자 chemoattraction를 감지하는 데 사용되는 assays 두 가지 클래스를 설명하고 비교 개구리 정자를 사용하여.

Abstract

무척추 동물의 정자 chemoattraction 하나는 정자 서스펜션에 매력적인 펩티드를 포함하는 피펫을 배치하고 미세 피펫 1 시경 정자 축적을 시각화 수있는 충분한 강력한하실 수 있습니다. 같은 개구리, 설치류 동물과 인간과 같은 척추 동물의 정자 chemoattraction 감지하기가 더 어렵습하고 양적 assays가 필요합니다. chemoattractant의 소스, 이른바 정자의 누적 assays, 실제로 개별적인 정자의 수영 궤도를 추적 assays하기 위해 정자의 움직임을 quantitate assays – 이러한 assays는 크게 두 가지 유형의 수 있습니다.

정자의 누적 assays하므로 선량 반응 곡선 및 시간 코스가 상대적으로 빠르게 진행 될 수 있도록 비교적 빠른 있도록 수십 또는 하루에 할 수 assays 수백 있습니다. assays 이러한 종류의 많은 잘 설립 chemoattraction 시스템을 특성화하기 위해 광범위하게 사용되었습니다 – BAC에 예를 들어, 호중구은 chemotaxisfollicular 유체에 terial 펩티드와 정자의 chemotaxis. 정자 추적 assays 집중보다 노동 수 있지만 chemoattractancts 실제로 정자가 들어있는 수영장 경로를 변경 방법에 대한 자세한 데이터를 제공할 수 있습니다. 분석의이 유형은 chemoattrractant 그라데이션 축에 비해 정자 운동의 방향을 설명하고 특성을 전환하거나 달걀에 가깝게 정자를 가지고 방향의 변화를 시각화하기 위해 필요합니다.

여기 assays 이러한 두 가지 유형의 각각의 사용 방법을 설명합니다. 활용 정자 축적 분석은 "두 챔버"분석이라고합니다. 수륙 양용의 정자는 12 μm의 직경의 모공을 가진 폴리 카보 네이트 필터 층과 조직 문화 플레이트 삽입에 배치됩니다. 정자와 삽입물은 버퍼와 신중하게 바닥이 벽을 (그림을 참조하십시오. 1) '요건을 충족하고 잘 하단에 pipetted chemoatttractant를 포함하는 조직 문화 판 우물에 게재됩니다. 부화 후, 정자 저수지를 포함하는 상위 삽입은 신중하게 r이된다막 통과가 아래쪽 챔버에 emoved, 그리고 정자가 제거 pelleted 후 hemocytometer 또는 흐름 cytometer로 계산됩니다.

정자 추적 분석은 원래 호중구의 chemotaxis을 준수를위한 개발 Giojalas 동료 2,3에 의해 정자의 관찰에 대한 수정 Zigmond 챔버를 사용합니다. 챔버는 두 세로 골짜기가 가공되어이있는에 두꺼운 유리 슬라이드로 구성되어 있습니다. 이들은 1mm 폭 전망대로 구분됩니다. 커버 유리, 정자의 응용 프로그램을 하나의 구유에로드되고 나면, 개별 정자의 다른과 운동으로 chemoattractant 에이전트 비디오 현미경에 의해 시각. 비디오 영상은 다음 각 정자의 궤도를 형성 시간 (xyt 데이터 세트)의 함수로 XY 평면에 2 차원 세포 움직임을 파악하는 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.

Protocol

1. 재료 및 사용된 버퍼 Oocyte에 울리는의 버퍼 (1.5 X OR2)는 124 MM NaCl, 3.75 MM KCl, 1.5 MM CaCl 2, MgCl 2 1.5 MM 1.5 MM 나 2 HPO 4, 10 MM Hepes를 포함 산도 7.8. 수정 버퍼 (F – 1)은 41.25 MM NaCl, 1.25 MM KCl, 0.25 MM CaCl 2, 0.06 MM MgCl 2, 0.5 MM 나 2 HPO 4, 2.5 MM Hepes, 산도 7.8이 포함되어 있습니다. Xenopus laevis 계란 물을 스기야마 ?…

Discussion

amoeboid 운동이나 flagella 구동 수영에 의해 움직이는 세포의 Chemotaxis은 많은 생물 학적 문맥에서 발견하고이 현상의 연구는 실용적이고 안정적​​인 assays의 가용성을해야합니다. 이러한 성게 계란이나 fruiting기구를 형성 점액 금형 세포의 모임에 정자의 매력으로 현상의 몇 가지 예입니다, 즉각적인 시각적 영향을 미칠. 이러한 현상의 Quantitation는 Eisenbach 18에서 설명한대로 다양한 방법으…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 그들의 비디오 현미경 작업 스테이션의 사용을 위해 WM 중사님의 Bioimaging 연구소 주셔서 감사합니다. 이 연구는 NSF 부여 이븐 – 0,615,435에 의해 지원되었다.

Materials

Name of Item Company Catalogue Number Comments
24-well plates Becton-Dickenson 35/1147  
12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane Millipore PIXP01250 We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued
Zigmond chamber Neuroprobe Z02  
Silicone oil General Electric SF1154 Equivalent to Dow Corning 550 Fluid
Image J software Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health Free download at
http://rsbweb.nih.gov/ij		 Java program that runs on Windows, Linux and Mac
MtrackJ software Erik Meijering/
Imagescience/
Biomedical Imaging Group, Erasmus MC – University Medical Center Rotterdam		 Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ Java program that runs on Windows, Linux and Mac
Virtual Dub software GNU General Public Licensed software Free download via http://www.virtualdub.org/index.html Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only
cellSens software Olympus See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070 Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability
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References

  1. Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).
  2. Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C. Increased velocity and induction of chemotactic response in mouse spermatozoa by follicular and oviductal fluids. J. Reprod. Fertil. 115, 23-27 (1999).
  3. Fabro, G., Rovasio, R. A., Civalero, S., Frenkel, A., Caplan, S. R., Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Chemotaxis of capacitated rabbit spermatozoa to follicular fluid revealed by a novel directionality-based assay. Biol. Reprod. 67, 1565-1571 (2002).
  4. Sugiyama, H., Burnett, L., Xiang, X., Olson, J., Willis, S., Miao, A., Akema, T., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Purification and multimer formation of allurin, a sperm chemoattractant from Xenopus laevis egg jelly. Mol. Reprod. Dev. 76, 527-536 (2009).
  5. Al-Anzi, B., Chandler, D. Xenopus laevis egg jelly releases a sperm chemoattractant during spawning. Dev. Biol. 198, 366-375 (1998).
  6. Ralt, D., Goldenberg, M., Fetterolf, P., Thompson, D., Dor, J., Mashiach, S., Garbers, D. L., Eisenbach, M. Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2840-2844 (1991).
  7. Gakamsky, A., Schechtman, E., Caplan, S. R., Eisenbach, M. Analysis of chemotaxis when the fraction of responsive cells is small–application to mammalian sperm guidance. Int. J. Dev. Biol. 52, 481-487 (2008).
  8. Böhmer, M., Van, Q., Weyand, I., Hagen, V., Beyermann, M., Matsumoto, M., Hoshi, M., Hildebrand, E., Kaupp, U. B. Ca2+ spikes in the flagellum control chemotactic behavior of sperm. EMBO J. 24, 2741-2752 (2005).
  9. Shiba, K., Baba, S. A., Inoue, T., Yoshida, M. Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and trigger sperm chemotactic response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19312-19317 (2008).
  10. Burnett, L. A., Sugiyama, H., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Egg jelly proteins stimulate directed motility in Xenopus laevis sperm. Mol. Reprod. Dev. 78, 450-462 (2011).
  11. Abaigar, T., Barbero, J., Holt, W. V. Trajectory variance and autocorrelations within single sperm tracks as population level descriptors of sperm track complexity, predictability and energy generating ability. J. Androl. , (2011).
  12. Mortimer, S. T., Swan, M. A., Mortimer, D. Fractal analysis of capacitating human spermatozoa. Hum. Reprod. 11, 1049-1054 (1996).
  13. Guerrero, A., Carneiro, J., Pimentel, A., Wood, C. D., Corkidi, G., Darszon, A. Strategies for locating the female gamete: the importance of measuring sperm trajectories in three spatial dimensions. Mol. Hum. Reprod. 17, 511-523 (2011).
  14. Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17, 457-465 (2011).
  15. Spehr, M., Schwane, K., Riffell, J. A., Zimmer, R. K., Hatt, H. Odorant receptors and olfactory-like signaling mechanisms in mammalian sperm.Mol. Cell. Endocrinol. 250, 128-136 (2006).
  16. Veitinger, T., Riffell, J. R., Veitinger, S., Nascimento, J. M., Triller, A., Chandsawangbhuwana, C., Schwane, K., Geerts, A., Wunder, F., Berns, M. W., Neuhaus, E. M., Zimmer, R. K., Spehr, M., Hatt, H. Chemosensory Ca2+ dynamics correlate with diverse behavioral phenotypes in human sperm. J. Biol. Chem. 286, 17311-17325 (2011).
  17. Tholl, N., Naqvi, S., McLaughlin, E., Boyles, S., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Swimming of Xenopus laevis sperm exhibits multiple gears and its duration is extended by egg jelly constituents. Biol. Bull. 220, 174-185 (2011).
  18. Eisenbach, M. Sperm chemotaxis. Rev. Reprod. 4, 56-66 (1999).
  19. Riffell, J. A., Zimmer, R. K. Sex and flow: the consequences of fluid shear for sperm-egg interactions. J. Exp. Biol. 210, 3644-3660 (2007).
  20. Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. Tracking sperm in three-dimensions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 373, 125-129 (2008).
  21. Himes, J. E., Riffell, J. A., Zimmer, C. A., Zimmer, R. K. Sperm chemotaxis as revealed with live and synthetic eggs. Biol Bull. 220, 1-5 (2011).
  22. Sun, F., Giojolas, L. C., Rovasio, R. A., Tur-Kaspa, I., Sanchez, R., Eisenbach, M. Lack of species-specificity in mammalian sperm chemotaxis. Dev. Biol. 255, 423-427 (2003).
  23. Guidobaldi, H. A., Teves, M. E., Uñates, D. R., Anastasía, A., Giojalas, L. C. Progesterone from the cumulus cells is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte cumulus complex. PLoS One. 3, e3040-e3040 (2008).
  24. Oren-Benaroya, R., Orvieto, R., Gakamsky, A., Pinchasov, M., Eisenbach, M. The sperm chemoattractant secreted from human cumulus cells is progesterone. Hum. Reprod. 23, 2339-2345 (2008).
  25. Teves, M. E., Guidobaldi, H. A., Uñates, D. R., Sanchez, R., Miska, W., Publicover, S. J., Morales Garcia, A. A., Giojalas, L. C. Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by progesterone. PLoS One. 4, 8211-82 (2009).
  26. Blengini, C. S., Teves, M. E., Uñates, D. R., Guidobaldi, H. A., Gatica, L. V., Giojalas, L. C. Human sperm pattern of movement during chemotactic re-orientation towards a progesterone source. Asian J. Androl. 13, 769-773 (2011).
  27. Strünker, T., Goodwin, N., Brenker, C., Kashikar, N. D., Weyand, I., Seifert, R., Kaupp, U. B. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, 382-386 (2011).
  28. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, 387-391 (2011).
  29. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-465 (1962).
  30. Zigmond, S. H., Lauffenburger, D. A. Assays of leukocyte chemotaxis. Annu. Rev. Med. 37, 149-155 (1986).
  31. Villanueva-Diaz, C., Vadillo-Ortega, F., Kably-Ambe, A., Diaz-Pérez, M. A., Krivitzky, S. K. Evidence that human follicular fluid contains a chemoattractant for spermatozoa. Fertil. Steril. 54, 1180-1182 (1990).
  32. Villanueva-Diaz, C., Arizs-Martinez, J., Bermejo-Martinez, L., Vadillo-Ortega, F. Progesterone induces human sperm chemotaxis. Fertil. Steril. 64, 1183-1188 (1995).
  33. Olson, J., Xiang, X., Ziegert, T., Kittleson, A., Rawls, A., Bieber, A., Chandler, D. E. A. l. l. u. r. i. n. a 21 kD sperm chemoattractant from Xenopus egg jelly, is homologous to mammalian sperm-binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11205-11210 (2001).

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Burnett, L. A., Tholl, N., Chandler, D. E. Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction. J. Vis. Exp. (58), e3407, doi:10.3791/3407 (2011).
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