Två typer av analyser för att upptäcka Frog spermier Chemoattraction
Summary
Ägg och den extracellulära beläggningar runt ägg släpper ofta peptider, proteiner och små molekyler som kommunicerar med sperma för att vägleda dem till ägget och därigenom främja befruktningen. Använda groda spermier vi beskriva och jämföra två klasser av test som används för att upptäcka sperma chemoattraction – spermier ackumulering analyser och spermier analyser spårning.
Abstract
Spermier chemoattraction i ryggradslösa djur kan vara tillräckligt robusta för att man kan placera en pipett som innehåller attraktiva peptid till en spermie fjädring och mikroskopiskt visualisera spermier ansamling runt pipetten 1. Spermier chemoattraction hos ryggradsdjur som grodor, gnagare och människa är svårare att upptäcka och kräver kvantitativa analyser. Sådana analyser är av två huvudtyper – analyser att kvantifiera spermiernas rörelse till en källa chemoattractant, sk spermier analyser ackumulering och analyser som faktiskt spåra simning banor av enskilda spermier.
Spermier ackumulering analyser är relativt snabb så att tiotals eller hundratals analyser göras på en enda dag, vilket möjliggör dos respons kurvor och kurser tid för att genomföras relativt snabbt. Dessa typer av analyser har använts i stor utsträckning att karaktärisera många väletablerade chemoattraction system – till exempel neutrofila chemotaxis till BACrial peptider och kemotaxi spermier att follikelvätskan. Spermier spårning analyser kan vara mer arbetskrävande men ger ytterligare uppgifter om hur chemoattractancts faktiskt förändra simning vägar att spermier tar. Denna typ av analys behövs för att visa riktningen för spermiernas rörelse i förhållande till chemoattrractant lutning axeln och att visualisera karakteristiska svängar eller förändrade inriktning som för spermierna närmare ägget.
Här beskriver vi metoder som används för var och en av dessa två typer av analyser. Spermierna ackumulering analysen används kallas för en "två-kammare"-analysen. Amfibie spermier placeras i en vävnadsodling platta insatsen med en polykarbonatfilter golvet ha 12 porer ìm diameter. Skär med spermier placeras i plattan vävnadsodling brunnar som innehåller buffert och en chemoatttractant försiktigt pipetteras i botten och där golvet möter väggen (se bild. 1). Efter inkubation, är den översta sätter innehåller spermier behållaren försiktigt removed och spermier i botten kammaren som har passerat genom membranet tas bort, pelleterad och sedan räknas av hemocytometer eller flödescytometer.
Spermierna spårning analysen utnyttjas en Zigmond kammare som ursprungligen utvecklades för att observera neutrofila kemotaxi och modifierats för observation av sperma genom Giojalas och medarbetare 2,3. Kammaren består av en tjock glasskiva där två vertikala dalar har bearbetas. Dessa skiljs åt av en 1 mm bred observation plattform. Efter tillämpning av ett skyddsglas, spermier laddas in ett tråg, visualiseras de chemoattractant agenten i den andra och förflyttning av enskilda spermier via video mikroskopi. Videofilmer analyseras sedan med hjälp av programvara för att identifiera tvådimensionella cell rörelser i XY-planet som funktion av tiden (xyt datamängder) som utgör banan för varje spermier.
Protocol
Discussion
Chemotaxis av celler rör sig antingen amöboid rörelse eller flageller-drivna simning finns i många biologiska sammanhang och undersöka detta fenomen kräver tillgång till praktiska och tillförlitliga analyser. Några exempel på fenomen, såsom dragning av spermier för att en sjöborre ägg eller insamling av cellerna slime mögel att bilda en fruktkropp kropp, få omedelbar visuell påverkan. Kvantifiering av detta fenomen har gjorts i en mängd olika sätt som beskrivs av Eisenbach 18. Dessa analyse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar WM Keck Bioimaging laboratorium för användning av deras video mikroskopi arbetsstation. Denna studie stöddes av NSF bevilja Ibn-0.615.435.
Materials
| Name of Item | Company | Catalogue Number | Comments |
| 24-well plates | Becton-Dickenson | 35/1147 | |
| 12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane | Millipore | PIXP01250 | We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued |
| Zigmond chamber | Neuroprobe | Z02 | |
| Silicone oil | General Electric | SF1154 | Equivalent to Dow Corning 550 Fluid |
| Image J software | Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health | Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij |
Java program that runs on Windows, Linux and Mac |
| MtrackJ software | Erik Meijering/ Imagescience/ Biomedical Imaging Group, Erasmus MC – University Medical Center Rotterdam |
Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | Java program that runs on Windows, Linux and Mac |
| Virtual Dub software | GNU General Public Licensed software | Free download via http://www.virtualdub.org/index.html | Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only |
| cellSens software | Olympus | See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070 | Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability |
References
- Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).
- Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C. Increased velocity and induction of chemotactic response in mouse spermatozoa by follicular and oviductal fluids. J. Reprod. Fertil. 115, 23-27 (1999).
- Fabro, G., Rovasio, R. A., Civalero, S., Frenkel, A., Caplan, S. R., Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Chemotaxis of capacitated rabbit spermatozoa to follicular fluid revealed by a novel directionality-based assay. Biol. Reprod. 67, 1565-1571 (2002).
- Sugiyama, H., Burnett, L., Xiang, X., Olson, J., Willis, S., Miao, A., Akema, T., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Purification and multimer formation of allurin, a sperm chemoattractant from Xenopus laevis egg jelly. Mol. Reprod. Dev. 76, 527-536 (2009).
- Al-Anzi, B., Chandler, D. Xenopus laevis egg jelly releases a sperm chemoattractant during spawning. Dev. Biol. 198, 366-375 (1998).
- Ralt, D., Goldenberg, M., Fetterolf, P., Thompson, D., Dor, J., Mashiach, S., Garbers, D. L., Eisenbach, M. Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2840-2844 (1991).
- Gakamsky, A., Schechtman, E., Caplan, S. R., Eisenbach, M. Analysis of chemotaxis when the fraction of responsive cells is small–application to mammalian sperm guidance. Int. J. Dev. Biol. 52, 481-487 (2008).
- Böhmer, M., Van, Q., Weyand, I., Hagen, V., Beyermann, M., Matsumoto, M., Hoshi, M., Hildebrand, E., Kaupp, U. B. Ca2+ spikes in the flagellum control chemotactic behavior of sperm. EMBO J. 24, 2741-2752 (2005).
- Shiba, K., Baba, S. A., Inoue, T., Yoshida, M. Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and trigger sperm chemotactic response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19312-19317 (2008).
- Burnett, L. A., Sugiyama, H., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Egg jelly proteins stimulate directed motility in Xenopus laevis sperm. Mol. Reprod. Dev. 78, 450-462 (2011).
- Abaigar, T., Barbero, J., Holt, W. V. Trajectory variance and autocorrelations within single sperm tracks as population level descriptors of sperm track complexity, predictability and energy generating ability. J. Androl. , (2011).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A., Mortimer, D. Fractal analysis of capacitating human spermatozoa. Hum. Reprod. 11, 1049-1054 (1996).
- Guerrero, A., Carneiro, J., Pimentel, A., Wood, C. D., Corkidi, G., Darszon, A. Strategies for locating the female gamete: the importance of measuring sperm trajectories in three spatial dimensions. Mol. Hum. Reprod. 17, 511-523 (2011).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17, 457-465 (2011).
- Spehr, M., Schwane, K., Riffell, J. A., Zimmer, R. K., Hatt, H. Odorant receptors and olfactory-like signaling mechanisms in mammalian sperm.Mol. Cell. Endocrinol. 250, 128-136 (2006).
- Veitinger, T., Riffell, J. R., Veitinger, S., Nascimento, J. M., Triller, A., Chandsawangbhuwana, C., Schwane, K., Geerts, A., Wunder, F., Berns, M. W., Neuhaus, E. M., Zimmer, R. K., Spehr, M., Hatt, H. Chemosensory Ca2+ dynamics correlate with diverse behavioral phenotypes in human sperm. J. Biol. Chem. 286, 17311-17325 (2011).
- Tholl, N., Naqvi, S., McLaughlin, E., Boyles, S., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Swimming of Xenopus laevis sperm exhibits multiple gears and its duration is extended by egg jelly constituents. Biol. Bull. 220, 174-185 (2011).
- Eisenbach, M. Sperm chemotaxis. Rev. Reprod. 4, 56-66 (1999).
- Riffell, J. A., Zimmer, R. K. Sex and flow: the consequences of fluid shear for sperm-egg interactions. J. Exp. Biol. 210, 3644-3660 (2007).
- Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. Tracking sperm in three-dimensions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 373, 125-129 (2008).
- Himes, J. E., Riffell, J. A., Zimmer, C. A., Zimmer, R. K. Sperm chemotaxis as revealed with live and synthetic eggs. Biol Bull. 220, 1-5 (2011).
- Sun, F., Giojolas, L. C., Rovasio, R. A., Tur-Kaspa, I., Sanchez, R., Eisenbach, M. Lack of species-specificity in mammalian sperm chemotaxis. Dev. Biol. 255, 423-427 (2003).
- Guidobaldi, H. A., Teves, M. E., Uñates, D. R., Anastasía, A., Giojalas, L. C. Progesterone from the cumulus cells is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte cumulus complex. PLoS One. 3, e3040-e3040 (2008).
- Oren-Benaroya, R., Orvieto, R., Gakamsky, A., Pinchasov, M., Eisenbach, M. The sperm chemoattractant secreted from human cumulus cells is progesterone. Hum. Reprod. 23, 2339-2345 (2008).
- Teves, M. E., Guidobaldi, H. A., Uñates, D. R., Sanchez, R., Miska, W., Publicover, S. J., Morales Garcia, A. A., Giojalas, L. C. Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by progesterone. PLoS One. 4, 8211-82 (2009).
- Blengini, C. S., Teves, M. E., Uñates, D. R., Guidobaldi, H. A., Gatica, L. V., Giojalas, L. C. Human sperm pattern of movement during chemotactic re-orientation towards a progesterone source. Asian J. Androl. 13, 769-773 (2011).
- Strünker, T., Goodwin, N., Brenker, C., Kashikar, N. D., Weyand, I., Seifert, R., Kaupp, U. B. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, 382-386 (2011).
- Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, 387-391 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-465 (1962).
- Zigmond, S. H., Lauffenburger, D. A. Assays of leukocyte chemotaxis. Annu. Rev. Med. 37, 149-155 (1986).
- Villanueva-Diaz, C., Vadillo-Ortega, F., Kably-Ambe, A., Diaz-Pérez, M. A., Krivitzky, S. K. Evidence that human follicular fluid contains a chemoattractant for spermatozoa. Fertil. Steril. 54, 1180-1182 (1990).
- Villanueva-Diaz, C., Arizs-Martinez, J., Bermejo-Martinez, L., Vadillo-Ortega, F. Progesterone induces human sperm chemotaxis. Fertil. Steril. 64, 1183-1188 (1995).
- Olson, J., Xiang, X., Ziegert, T., Kittleson, A., Rawls, A., Bieber, A., Chandler, D. E. A. l. l. u. r. i. n. a 21 kD sperm chemoattractant from Xenopus egg jelly, is homologous to mammalian sperm-binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11205-11210 (2001).
