İki Kurbağa Sperm Chemoattraction saptamak için Tahliller Türleri
Summary
Yumurta ve yumurta etrafında ekstrasellüler kaplamaları sık sık böylece döllenme teşvik yumurta sperm ile iletişim kurmak için onlara rehberlik etmek, peptidler, proteinler ve küçük moleküllerin bırakın. Kurbağa sperm sperm birikimi testleri ve sperm izleme testleri – sperm chemoattraction algılamak için kullanılan iki sınıf testleri tanımlamak ve karşılaştırmak.
Abstract
Sperm chemoattraction omurgasızlarda bir sperm süspansiyonu içine çekici peptid içeren bir pipet yerleştirmek ve mikroskobik pipet yaklaşık 1 sperm birikimi imgeleyebileceğiniz kadar güçlü olabilir. Kurbağa, kemirgenler ve insanlar gibi omurgalıların Sperm chemoattraction tespit etmek daha zordur ve kantitatif testleri gerektirir. – Bu tür testlerin başlıca iki tip bir kemoatraktan kaynağı, sözde sperm birikimi deneyleri, aslında bireysel sperm yüzme yörüngeleri takip deneyleri, spermin hareket Asitli deneyleri.
Sperm birikimi deneyleri böylece doz yanıt eğrileri ve zaman içerisinde nispeten hızlı bir şekilde yapılmasını sağlayan, nispeten hızlı bir şekilde sağlayan onlarca veya yüzlerce tek bir gün içinde yapılması gereken testleri. Bu tür testlerin çok iyi kurulmuş chemoattraction sistemleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bac örneğin, nötrofil kemotaksisiniterial peptitler ve foliküler sıvı sperm kemotaksis. Sperm izleme testleri yoğun emek, ancak chemoattractancts aslında sperm almasını yüzme yolları nasıl değiştirdiğini ek veri sunabilir. Bu tip testin chemoattrractant degrade eksenine göre sperm hareket yönünü göstermek ve karakteristik açar veya yumurta yakın sperm getirmek yönde değişiklikler görselleştirmek için gereklidir.
Burada bu iki tip testlerinin her biri için kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. Yararlanılan sperm birikimi testi "iki odacıklı" tahlil denir. Amfibi sperm polikarbonat bir filtre zemin ile 12 mikron çapında gözenekleri olan bir doku kültürü tabak eklemek yerleştirilir. Sperm ile ekler içeren doku kültürü, zemin, duvar (bkz. Şekil 1). Karşılar dibine dikkatlice pipetle bir chemoatttractant tampon ve plaka kuyu içine yerleştirilir. Inkübasyondan sonra, sperm rezervuar içeren üst eklemek dikkatle removed ve sperm zarından geçti alt odasında kaldırıldı pelet ve sonra hemasitometre veya akış sitometresinin sayılır.
Sperm izleme testi aslında nötrofil kemotaksisini gözlemlemek için 2,3 Giojalas ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve sperm gözlem için modifiye bir Zigmond odası kullanır. Haznesi iki dikey olukları işlenmiş içine kalın bir cam slayt oluşur. Bu bir 1 mm genişliğinde bir gözlem platformu tarafından ayrılır. Bir çukur içine bir kapak cam, sperm uygulama yüklendikten sonra, diğer bireysel sperm ve hareket içine kemoatraktan ajan video mikroskobu ile görüntülendi. Video görüntüleri daha sonra yazılımı kullanarak her sperm yörünge süresi (xyt veri setleri) bir fonksiyonu olarak xy düzleminde iki boyutlu hücre hareketlerini belirlemek için analiz edilir.
Protocol
Discussion
Amoeboid hareketi veya kamçı ile çalışan yüzme ya da hareket eden hücreler Kemotaksis birçok biyolojik bağlamlarda bulundu ve bu fenomenin çalışma, pratik ve güvenilir testlerin kullanılmasını gerektirir. Fenomen, bir deniz kestanesi yumurta veya bir meyve gövdesini oluşturan balçık kalıp hücreleri toplama sperm cazibe gibi bazı örnekler, derhal görsel etkisi var. Bu fenomenin kantitasyonu Eisenbach 18 tarafından açıklandığı gibi çeşitli şekillerde yapılmış. Bu testlerin, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
WM Keck bio-Laboratuvar video mikroskopi iş istasyonu kullanımı için teşekkür ederim. Bu çalışmada, NSF hibe IBN-0615435 tarafından desteklenen oldu.
Materials
| Name of Item | Company | Catalogue Number | Comments |
| 24-well plates | Becton-Dickenson | 35/1147 | |
| 12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane | Millipore | PIXP01250 | We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued |
| Zigmond chamber | Neuroprobe | Z02 | |
| Silicone oil | General Electric | SF1154 | Equivalent to Dow Corning 550 Fluid |
| Image J software | Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health | Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij |
Java program that runs on Windows, Linux and Mac |
| MtrackJ software | Erik Meijering/ Imagescience/ Biomedical Imaging Group, Erasmus MC – University Medical Center Rotterdam |
Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | Java program that runs on Windows, Linux and Mac |
| Virtual Dub software | GNU General Public Licensed software | Free download via http://www.virtualdub.org/index.html | Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only |
| cellSens software | Olympus | See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070 | Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability |
References
- Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).
- Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C. Increased velocity and induction of chemotactic response in mouse spermatozoa by follicular and oviductal fluids. J. Reprod. Fertil. 115, 23-27 (1999).
- Fabro, G., Rovasio, R. A., Civalero, S., Frenkel, A., Caplan, S. R., Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Chemotaxis of capacitated rabbit spermatozoa to follicular fluid revealed by a novel directionality-based assay. Biol. Reprod. 67, 1565-1571 (2002).
- Sugiyama, H., Burnett, L., Xiang, X., Olson, J., Willis, S., Miao, A., Akema, T., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Purification and multimer formation of allurin, a sperm chemoattractant from Xenopus laevis egg jelly. Mol. Reprod. Dev. 76, 527-536 (2009).
- Al-Anzi, B., Chandler, D. Xenopus laevis egg jelly releases a sperm chemoattractant during spawning. Dev. Biol. 198, 366-375 (1998).
- Ralt, D., Goldenberg, M., Fetterolf, P., Thompson, D., Dor, J., Mashiach, S., Garbers, D. L., Eisenbach, M. Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2840-2844 (1991).
- Gakamsky, A., Schechtman, E., Caplan, S. R., Eisenbach, M. Analysis of chemotaxis when the fraction of responsive cells is small–application to mammalian sperm guidance. Int. J. Dev. Biol. 52, 481-487 (2008).
- Böhmer, M., Van, Q., Weyand, I., Hagen, V., Beyermann, M., Matsumoto, M., Hoshi, M., Hildebrand, E., Kaupp, U. B. Ca2+ spikes in the flagellum control chemotactic behavior of sperm. EMBO J. 24, 2741-2752 (2005).
- Shiba, K., Baba, S. A., Inoue, T., Yoshida, M. Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and trigger sperm chemotactic response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19312-19317 (2008).
- Burnett, L. A., Sugiyama, H., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Egg jelly proteins stimulate directed motility in Xenopus laevis sperm. Mol. Reprod. Dev. 78, 450-462 (2011).
- Abaigar, T., Barbero, J., Holt, W. V. Trajectory variance and autocorrelations within single sperm tracks as population level descriptors of sperm track complexity, predictability and energy generating ability. J. Androl. , (2011).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A., Mortimer, D. Fractal analysis of capacitating human spermatozoa. Hum. Reprod. 11, 1049-1054 (1996).
- Guerrero, A., Carneiro, J., Pimentel, A., Wood, C. D., Corkidi, G., Darszon, A. Strategies for locating the female gamete: the importance of measuring sperm trajectories in three spatial dimensions. Mol. Hum. Reprod. 17, 511-523 (2011).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17, 457-465 (2011).
- Spehr, M., Schwane, K., Riffell, J. A., Zimmer, R. K., Hatt, H. Odorant receptors and olfactory-like signaling mechanisms in mammalian sperm.Mol. Cell. Endocrinol. 250, 128-136 (2006).
- Veitinger, T., Riffell, J. R., Veitinger, S., Nascimento, J. M., Triller, A., Chandsawangbhuwana, C., Schwane, K., Geerts, A., Wunder, F., Berns, M. W., Neuhaus, E. M., Zimmer, R. K., Spehr, M., Hatt, H. Chemosensory Ca2+ dynamics correlate with diverse behavioral phenotypes in human sperm. J. Biol. Chem. 286, 17311-17325 (2011).
- Tholl, N., Naqvi, S., McLaughlin, E., Boyles, S., Bieber, A. L., Chandler, D. E. Swimming of Xenopus laevis sperm exhibits multiple gears and its duration is extended by egg jelly constituents. Biol. Bull. 220, 174-185 (2011).
- Eisenbach, M. Sperm chemotaxis. Rev. Reprod. 4, 56-66 (1999).
- Riffell, J. A., Zimmer, R. K. Sex and flow: the consequences of fluid shear for sperm-egg interactions. J. Exp. Biol. 210, 3644-3660 (2007).
- Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. Tracking sperm in three-dimensions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 373, 125-129 (2008).
- Himes, J. E., Riffell, J. A., Zimmer, C. A., Zimmer, R. K. Sperm chemotaxis as revealed with live and synthetic eggs. Biol Bull. 220, 1-5 (2011).
- Sun, F., Giojolas, L. C., Rovasio, R. A., Tur-Kaspa, I., Sanchez, R., Eisenbach, M. Lack of species-specificity in mammalian sperm chemotaxis. Dev. Biol. 255, 423-427 (2003).
- Guidobaldi, H. A., Teves, M. E., Uñates, D. R., Anastasía, A., Giojalas, L. C. Progesterone from the cumulus cells is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte cumulus complex. PLoS One. 3, e3040-e3040 (2008).
- Oren-Benaroya, R., Orvieto, R., Gakamsky, A., Pinchasov, M., Eisenbach, M. The sperm chemoattractant secreted from human cumulus cells is progesterone. Hum. Reprod. 23, 2339-2345 (2008).
- Teves, M. E., Guidobaldi, H. A., Uñates, D. R., Sanchez, R., Miska, W., Publicover, S. J., Morales Garcia, A. A., Giojalas, L. C. Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by progesterone. PLoS One. 4, 8211-82 (2009).
- Blengini, C. S., Teves, M. E., Uñates, D. R., Guidobaldi, H. A., Gatica, L. V., Giojalas, L. C. Human sperm pattern of movement during chemotactic re-orientation towards a progesterone source. Asian J. Androl. 13, 769-773 (2011).
- Strünker, T., Goodwin, N., Brenker, C., Kashikar, N. D., Weyand, I., Seifert, R., Kaupp, U. B. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, 382-386 (2011).
- Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, 387-391 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-465 (1962).
- Zigmond, S. H., Lauffenburger, D. A. Assays of leukocyte chemotaxis. Annu. Rev. Med. 37, 149-155 (1986).
- Villanueva-Diaz, C., Vadillo-Ortega, F., Kably-Ambe, A., Diaz-Pérez, M. A., Krivitzky, S. K. Evidence that human follicular fluid contains a chemoattractant for spermatozoa. Fertil. Steril. 54, 1180-1182 (1990).
- Villanueva-Diaz, C., Arizs-Martinez, J., Bermejo-Martinez, L., Vadillo-Ortega, F. Progesterone induces human sperm chemotaxis. Fertil. Steril. 64, 1183-1188 (1995).
- Olson, J., Xiang, X., Ziegert, T., Kittleson, A., Rawls, A., Bieber, A., Chandler, D. E. A. l. l. u. r. i. n. a 21 kD sperm chemoattractant from Xenopus egg jelly, is homologous to mammalian sperm-binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11205-11210 (2001).
