Summary
FRET-baserte journalister blir stadig mer brukt til å overvåke kinase og fosfatase aktiviteter i levende celler. Her beskriver vi en metode om hvordan du bruker FRET-baserte journalister å vurdere celle syklus-avhengige endringer i mål fosforylering.
Abstract
Förster resonans energi overføring (FRET)-baserte journalister en tillate vurdering av endogene kinase og fosfatase aktiviteter i levende celler. Slike prober typisk bestå av varianter av CFP og YFP, grepet av en phosphorylatable sekvens og en fosfor-bindende domene. Ved fosforylering, sonden endringene konformasjon, som resulterer i en endring av avstand eller retning mellom CFP og YFP, fører til en endring i FRET effektivitet (fig 1). Flere sonder har blitt publisert i løpet av det siste tiåret, overvåke aktiviteten balansen av flere kinaser og fosfataser, inkludert journalister på 2 PKA, 3 PKB, 4 PKC, 5 PKD, 6 ERK, 7 JNK, 18 CDK, Aurora B 9 og Plk1 9 . Gitt den modulære design, flere prober er sannsynlig å dukke opp i nær fremtid 10.
Progresjon gjennom cellesyklus er påvirket av stress signaling veier 11. Spesielt er cellesyklus reguleres annerledes under uforstyrret vekst i forhold til når cellene er utvinne fra stress 12. Time-lapse avbildning av celler gjennom cellesyklus krever derfor spesiell forsiktighet. Dette blir et problem spesielt ved ansettelse ratiometric imaging, siden to bilder med høyt signal til støyforhold er nødvendig for å tolke resultatene. Ratiometric FRET avbildning av cellesyklus avhengige endringer i kinase og fosfatase aktiviteter har hovedsakelig vært begrenset til sub-seksjoner av cellesyklus 8,9,13,14.
Her diskuterer vi en metode for å overvåke FRET-baserte sondene bruker ratiometric bildebehandling hele den menneskelige cellesyklus. Metoden baserer seg på utstyr som er tilgjengelig for mange forskere i life sciences og krever ikke ekspertkunnskap om mikroskopi eller bildebehandling.
Protocol
1. Introduserer sonden til celler
- Co-transfektere celler med en FRET-basert probe og en plasmid overdragelse motstand. Velg et transfeksjon metode som er effektiv i din celle-type av interesse. For U2OS celler, standard kalsiumfosfat transfeksjon metodene gir tilfredsstillende resultater 15.
- Merk cellene i riktig antibiotika i minst sju dager. Dette beriker mengden av celler uttrykker sonden og begrenser mengden av celler med giftige uttrykk nivåer, eller uttrykk nivåer som sterkt påvirker cellesyklus.
- (Valgfritt) Velg for stabil kloner.
- Ved hjelp av faste eller levende celler, må du kontrollere at både CFP og YFP er tilstede i alle celler på omtrent samme forholdet.
- I tilfelle noen celler inneholder kun CFP eller YFP har rekombinasjon sannsynlig oppstått. Rekombinasjon kan oppstå enten under bakteriell vekst eller etter transfeksjon av sonden, og kan i sistnevnte tilfelle avhenge plasmid kvalitet. Gjenta plasmid poppreisning og linearize plasmidet før transfeksjon hvis problemet vedvarer.
2. Overvåking ratiometric FRET
- Seed celler på glassbunn retter, eller dekkglass for montering i et kammer. Kontroller at tallerkner / dekkglass er ingen 1,5 (170 mikrometer tykk).
- Mount celler i vekst medium uten fenol rødt på en motorisert epifluorescence mikroskop med temperaturkontroll satt til 37 ° C. Sikre pH regulering av media, enten ved CO 2 eller ved å bruke CO 2-uavhengige medier som Liebowitz-15.
- Fokus på celler ved hjelp overført lys. Ikke se på celler ved hjelp av fluorescerende lys.
- Start med å kjøpe en 12 eller 16 bit bilde ved hjelp YFP eksitasjon (YFPex) og YFP utslipp (YFPem) filtre og en passende dichroic speil. Bruk maksimal Binning tilgjengelig som fortsatt tillater nødvendige subcellular oppløsning. Ved hjelp av en høy Binning å redusere eksponeringen tid eller intensitet er avgjørende for å unngå fototoksisitet.
- Measure eller anslå bakgrunnen intensitet og omtrentlig støy ved å måle eller estimere grove gjennomsnitt, minimum og maksimum pixel verdier i et område blottet for celler. Endre eksponeringstid og nøytral tetthet filter slik at gjennomsnittlig signal i cellen er ca bakgrunnen intensiteten pluss fem til ti ganger forskjellen mellom max og min bakgrunn intensiteter.
- Kontroller at bildene ikke er nær å bli mettet. Den maksimale intensitet i bildet skal være mindre enn halvparten av det dynamiske området (f.eks max 2000 i en 12-bits bilde) for å muliggjøre intensitet forskjeller når celler inn mitose.
- Gjenta steg 2.4 til 2.6 ved hjelp av CFP eksitasjon og YFP utslipp filtre og en passende dichroic speil.
- Velg flere regioner med transfektert celler, unntatt områdene som brukes for punkt 2.4 til 2.7, og sikre at maksimal intensitet er mindre enn halvparten av det dynamiske området i alle celler.
- Start en time-lapse eksperiment anskaffe to bilder hver 4.5 min med YFPex - YFPem og CFPex - YFPem filter sett.
3. Kontrollere og optimalisere forholdene
- Åpne kjøpte bildene og overvåke cellesyklus tid fra mitose til mitose for celler som uttrykker transfektert probe.
- Sammenlign den målte cellesyklus tid til publiserte data for cellen som brukes. Alternativt untransfected film celler ved å kjøpe ett bilde av overført lys bare (f.eks DIC eller fase-kontrast) hver time for å få henvisning celle syklustider.
- I tilfelle tiden fra mitose til mitose tilsvarer referanse cellesyklus tidsberegninger, fortsett til trinn 4. Alternativt, re-skaffe bilder ved hjelp hardere eksponering, mer tid-poeng eller flere z-nivåer og gjenta trinn 3.
- I tilfelle tiden fra mitose til mitose ikke svarer til referanse cellesyklus timing, transfektert film celler ved å kjøpe ett bilde av overført lys bare (f.eks DIC eller fase-kontrast) hver time etterfulgt av et bilde på sluttenav forsøket for å identifisere transfektert celler.
- Hvis transfektert cellene fortsatt vise lengre cellesyklus ganger, gjenta trinn 1, men transfektere mindre sonde eller velg for stabil kloner som inneholder svært lave mengder probe.
- Hvis transfektert cellene viser normal celle syklus ganger i fravær av fluorescerende lys, gjentar du trinn 2, men lavere eksponering ved å endre Binning, nøytral tetthet filter, eksponeringstid, og tid mellom bildene.
Fire. Analyse FRET
- Analysen kan utføres av de fleste software dedikert til mikroskopi. Her vil vi beskrive hvordan å utføre analyse ved hjelp av freeware ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij ) utnytte plugin Ratio Plus ( http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . html ).
- Åpne bildene i ImageJ. I ditt tilfelle bildene er i format av en flerfarget stack (f.eks Deltavision), skiller de enkelte kanalene ved først å konvertere dem til et hyperstack: Image-hyperstack-stack til hyperstack og deretter dele dem å enkelt kanal stabler med: Bilde-hyperstack-reduserer dimensjonalitet
- Multipliser YFPex - YFPem stabel med 3 bruk: Process-Math-Multipliser Dette trinnet er valgfritt, så det er bare ment å øke visuell klarhet i bildene ved å sikre at forholdstall ikke er i området mellom 0 og 1.
- I YFPex - YFPem stack, tegne en region av interesse (ROI) i et område som er blottet for celler, men det er nært til en celle som skal måles. Forskjellige celler i det samme bildet kan kreve ulike regioner, både som bakgrunn og signal intensitet vanligvis er sterkest i sentrum av et bilde.
- Legg til ROI til ROI manageren: Analyser-verktøy-ROI manager.
- Mål middels intensitet av ROI i både YFPex - YFPem og CFPex - YFPem stack: Analyser-Mål
- Repeter på flere tidspunkter og kontrollere at bakgrunnen intensiteter nær cellen av interesse er lik gjennom hele filmen.
- Still målinger for å inkludere minimal intensitet: Analyser-Set målinger-Min og Max grått verdi.
- Tegn en region av interesse dekker det meste av en celle og måle minimal intensitet i både YFPex - YFPem og CFPex - YFPem stack. Ta forskjellen mellom målt minimal intensitet og bakgrunnen intensitet fra 4,6 og dele det med to. Dette gir et utgangspunkt estimat for et utklipp verdi.
- Åpne Ratio Plus. Velg YFPex - YFPem og CFPex - YFPem stack. For FRET ratio velger CFPex - YFPem som stack 1, for invertert FRET ratio visualisere prober der FRET effektiviteten reduseres ved fosforylering, velg YFPex - YFPem som stack 1.
- Sett målte bakgrunnen intensiteter og klipping verdier.
- Sett skalering av den resulterende forholdet stack og bruke en passende utseende up table (LUT) for å visualisere ratio endringer.
5. Representant Resultater
Plk1 aktiviteten er først synlig i kjernen i G2 fase og topper under mitose. Figur 3 viser et eksperiment ved hjelp minimal fototoksisitet innstillinger som beskrevet i seksjon 2. Vær oppmerksom på at dette er et representativt innledende resultat, og at eksponering forhold eller tid mellom bilder kan bli endret for å øke signal til støyforhold eller temporal oppløsning. Figur 3D viser at et flertall av cellene uttrykker sonden spre seg med en celle syklus tid på mellom 20 og 25 timer, noe som indikerer at bildebehandling forhold og uttrykk nivåer av sonden ikke påvirker cellesyklus timings. Selv om det er betydelig støy, utviklingen av Plk1 aktiviteten øker i G2 og topp i mitose 14 er tydelig (fig 3A). Behandling av rådata, her ved gjennomsnittlig filtrering presentert som en kymograph (fig 3B), eller kvantifisering av gjennomsnittlig invertert ra Tio (fig 3C) kan forbedre klarhet.
Figur 1. Prinsippet om et FRET-basert probe å overvåke kinase og fosfatase aktiviteter. To fluorophores, typisk CFP (blå) og YFP (grønn), er forbundet med en fosfor-bindende domene (orange) og en phosphorylatable sekvens (gul). Fosforylering (rød) formidler binding til fosfor-bindende domene, og dermed indusere en konformasjonsendring i sonden. Den konformasjonsendring resulterer i en forskjell i avstand eller retning mellom de to fluorophores, som påvirker FRET effektivitet mellom CFP og YFP. FRET kan visualiseres med spennende CFP og overvåking YFP utslipp (stiplede linjer).
Figur 2. Skjematisk oversikt over den eksperimentelle prosedyren.
p_upload/3410/3410fig3.jpg "/>
Figur 3. Plk1 aktiviteten er først synlig i kjernen i G2 fase og topper under mitose. U2OS celler uttrykker en FRET-basert probe overvåking Plk1 aktivitet 9,14 ble filmet i 60 timer ved hjelp av en Deltavision Spectris Imaging system utstyrt med et 20x NA 0,7 luft mål og en kvikksølv lampe. Imaging forholdene var valgt for å gi minimal fototoksisitet, som beskrevet i § 2, med 4x Binning og nøytral tetthet filtre som blokkerer 99% av det innkommende lyset. A, falske farger representasjon av inverterte FRET-ratio etter en celle gjennom fire divisjoner. B, kymograph av cellen som vises i A etter at en gjennomsnittlig filter. C, kvantifisering av inverterte FRET forholdet cellen som vises i A. D, kumulative mitotisk oppføring av 50 FRET-probe uttrykker cellene, inkludert divisjoner av datteren celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overvåking FRET gjennom cellesyklus krever hensyn som er mindre avgjørende ved vurderingen av kortsiktig respons på ytre stimuli. Først er cellesyklus progresjon lett opprørt av stress-signalering, som krever at fototoksisitet holdes til et minimum. Sekund, kan alle reportere potensielt påvirke cellulære prosesser ved titrering ut kinaser, fosfataser eller interaksjon domener. Den sannsynligvis enkleste måten å vurdere om den eksperimentelle forholdene er tilstrekkelige, er å måle cellen syklus lengde fra mitose til mitose og sammenligne den med eksperimenter uavhengig av fluorescens bildebehandling og uttrykk av en sonde.
En avgjørende faktor i overvåkingen FRET forholdstall gjennom hele cellesyklus er å motstå fristelsen til å tilegne seg vakre bilder med høy oppløsning. Selv om den eksakte innstillingene avhenger følsomheten av mikroskopet systemet og uttrykk nivå og arten av den aktuelle sonde, er det viktig å brukeet nivå av Binning som tilsvarer det som er absolutt nødvendig å se. Selv om tiden mellom CFPex - YFPem og YFPex - YFPem bildene må være kort for å unngå endringer i celle morfologi, i våre hender er det bedre å holde eksponering ganger på mer enn 0,1 sekunder og redusere intensiteten av fluorescerende lys ved nøytral tetthet filter .
Hvordan fototoksisitet påvirker cellesyklus i stor grad avhengig uttrykk nivåer og lokalisering av sonden. En probe som er lokalisert til kromatin, for eksempel ved fusjon med en histone, gjør cellene mer følsomme for fluorescerende lys, trolig fordi fototoksisk biprodukter er opprettet i nærheten av DNA. Det er derfor viktig å overvåke celler som uttrykker relativt lave nivåer av journalister og re-sjekk celle-syklus timings hvis lokalisere sonden til forskjellige subcellular strukturer.
Flere kontrollere forsøk er nødvendig for å verifisere at FRET er tilstede ieksperimentelle oppsett og at forholdet endringene gjenspeiler faktiske fosforylering av en sonde. Bortsett funksjonelle kontroller, for eksempel hemming eller uttømming av en kinase, er det tilrådelig å utføre biokjemiske eksperimenter for å bekrefte at sonden er fosforylert, mutasjon av forventet fosfor-akseptor nettsted innenfor sonden til en ikke-phosphorylatable rester, og akseptor fotobleking til bevise forekomst av FRET. For et eksempel på en omfattende validering, se supplerende figur 3 i ref 14.
Selv om det er teoretisk foretrekke å vurdere FRET endringer ved å overvåke både CFP og YFP utslipp, er slike oppsett svært følsomme for fokus endringer og lys forhold og kan lett føre til artefakter. Følsomhet å fokusere endringene skyldes kromatisk aberrasjon, hvor CFP og YFP utslipp ikke fokusere på samme punkt. Illumination endringer avhenger i stor grad på ulike justering av lyset banen. Dette er spesielt fremtredende ved bruk av filter kuber som inneholderen dichroic speil. Fokus og belysning endring kan reduseres ved hjelp korrigeres mål og nøye justert filter kuber. Men i vår erfaring, holde utslippet filteret konstant gir overlegne resultater, fortrinnsvis ved hjelp av en setup med separat styring av eksitasjon og emisjon filtre.
Omfanget av den observerte FRET-change er redusert med bleedthrough fra CFP fluorescens til YFP utslipp filter. I tilfelle bleedthrough er betydelig, en ekstra CFPex - CFPem bilde kan være kjøpt for å korrigere bleedthrough i CFPex - YFPem bilde. Men slike korrigeringer er svært sensitive til å fokusere forskjeller og kan introdusere artefakter. I tillegg krever de en ekstra bilde, som kan produsere fototoksisitet.
Selv mindre av et problem når det bare overvåkning YFP utslipp, holde cellene i fokus gjennom en 24 + time-lapse eksperiment kan være utfordrende. For å unngå fokus fonner, sørg for at mikroskopetog parabolen er forvarmet og at temperaturen i rommet svinger ikke. Alternativt kan du bruke en autofokussystem som ikke er basert på avbildning av transfektert probe.
Valget som mål å bruke, avhenger av den enkelte søknad. En oljebasert høy NA objektiv samler mer lys og gir økt oppløsning, men er mer følsomme for fokus endringer og er upraktisk i high-innhold oppsett. Vi foretrekker å bruke en luft objektiv med en relativt høy NA å studere cytoplasmatiske eller kjernefysisk FRET-prosenter, og bruke høy NA olje mål bare når høyere subcellular oppløsning er nødvendig.
Artikkelen diskuterer en grei metode for å filme FRET-baserte sondene gjennom cellesyklus som bruker utstyr som er lettest tilgjengelig for mange life science forskere og krever bare en basal kunnskap om mikroskopi og bildebehandling. Mer spesialiserte alternativer inkluderer bruk av strålen-splittere, fluorescens Lifetime Microscopy (flim) 1 og programvare for å automatisere objekt segmentering 16 og beregning av FRET ratio 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er støttet av det svenske forskningsrådet, den svenske Stiftelsen for strategisk forskning, den svenske kreft samfunnet, svenske barn Kreftforeningen, Åke Wibergs fundament og Jeanssons fundament.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15, no phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 21083-027 | |
| DMEM+Glutamax-I | GIBCO, by Life Technologies | 31966 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SV30160.03 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Hyclone | SH30236.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14287 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 |
References
- Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
- Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
- Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
- Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
- Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
- Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
- Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
- Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 Forthcoming.
- Morgan, D. O. The cell cycle : principles of control. , New Science Press, in association with Oxford University Press. (2007).
- Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
- Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
- van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).
