1. Intracellulær Ca2 + måling for individuelle celler Kyse-150, en human esophageal pladecellecarcinom (ECSS) cellelinie dyrkes i 5% CO2-atmosfære ved 37 ° C i blandet RPMI 1640/Ham 's F-12 medium (1:1) indeholdende 5% føtalt bovint serum. Kyse-150-celler transficeret med plasmiderne enten indeholder shRNA specifikt mod Orai1 eller et kodet sekvens. Plasmiderne også et gen, der koder rødt fluorescerende protein (RFP) som en reporter, som drives af en separat promotor. Cellerne dyrkes i glas-bund retter (nr. 1,5 dækglas, Mattek, MA) i 48 timer. Fjernelse af mediet og skylles cellerne med en balanceret saltopløsning (BSS) (140 mM NaCl, 2,8 mM KCI, 2 mM CaCI 2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,2). Tilsæt 1 ml BSS indeholdende 2 uM Fura-2 acetoxymethylester (Molecular Probes) i skålen og pak hele skålen med folie til protect mod lys. Inkubér cellerne i 40 minutter ved 37 ° C og derefter lade dem i yderligere 15 min periode ved stuetemperatur for at tillade esterhydrolyse afsluttet. Vask cellerne med BSS to gange. Montere parabol på scenen af Nikon TE200 omvendt mikroskop, som er forbundet til PTI spektrofluorometer, med excitationsbølgelængder på 350 og 390 nm og emission ved 510 nm. De nøjagtige excitationsbølgelængder, der skal anvendes, kan variere lidt alt efter optik for hvert enkelt system. De to bølgelængder med bedste forhold dynamisk bestemmes ved ekscitationsspektret scanning af Fura-2-salt i opløsninger indeholdende Ca2 + i området fra 0 til 39,8 uM (eller højere koncentration, ved hvilken Fura-2-fluorescens er mættet). Etablere et tyngdekraft perfusionssystem med 4 forskellige opløsninger i BSS: Ca 2 + (2 mM), EGTA (0,5 mM), EGTA-TG (thapsigargin, 5 uM), Ca2 +-2-APB (en SOCE inhibitor, 75 uM). Computer-kontrollerede automatiseret perfusipå systemer kan også anvendes. Marker de celler, der udtrykker RFP i visualisering tilstand. Placere åbningen spidsen af perfusionssystemet til 10x forstørrelse indtil spidsen er lige over området af interesse i en 45 graders vinkel. Samtidig registrerer fluorescenssignaler F 350 nm og F 390 nm. Forholdet (F 350 nm / F 390 nm) er vist i det tredje vindue. Ændre perfusionsopløsninger i følgende rækkefølge: Ca2 +, EGTA; Ca2 +, EGTA-TG, Ca2 +, Ca2 +-2-APB. Den ovennævnte protokol kan modificeres til måling af intracellulær Ca2 + i cellesuspension system. Kultur Kyse-150 celler i en T25 kolbe med den samme kultur betingelser som ovenfor. Når cellerne når 90% konfluens, fjernes mediet og skylles cellerne med en BSS opløsning. Tilsættes 2,5 ml BSS indeholdende 2 uM Fura-2 AM og inkuberescellerne i 40 minutter ved 37 ° C efterfulgt af deesterificering. Fjerne BSS, tilsættes 2,5 ml trypsin i kolben og inkuber ved 37 ° C, indtil cellerne løsnes. Derefter tilsættes 2,5 ml dyrkningsmedium for at standse trypsinisering og høste cellerne ved centrifugering ved 800 rpm i 5 min. Vask cellerne med dyrkningsmedium en gang ved centrifugering og genopslæmmes cellernes pellet i BSS opløsning (uden tilsætning af 2 mM CaCl2, som indeholder um Ca2 +) og tælle celler nummeret med en hematometer. Tilsættes ~ 10 6 celler i en kvartskuvette (10 mm, Starna celler) og fylde volumenet op til 2 ml med BSS. Anbring kuvette (omrøring med en magnetisk stang) i spektrofluorometer. Samtidigt registrerer fluorescenssignaler F 340 nm og F 380 nm med emissionsbølgelængde på 510 nm. Driften protokol er: BSS, tilsætning af 0,5 pi EGTA (0,25 M stamopløsning), tilsætning af 1 pi thapsigargin(TG, 10 mM stamopløsning), tilsætning af 4 gl Ca2 + (1 M stamopløsning). 2. Mn quenching assayet i dyrkede celler Udføre excitationsbølgelængden scanning af Fura-2 i opløsninger indeholdende forskellige Ca 2 +-koncentration i området fra 0 til 39,8 uM at bestemme Ca uafhængig af koncentrationen bølgelængde som det isosbestiske punkt. Sædvanligvis det isosbestiske punkt er ved eller omkring 360 nm. Kyse-150-celler dyrkes i glas-bund skåle og fyldt med Fura-2 AM. Opsætte perfusionssystem med 5 forskellige BSS opløsninger: Ca2 + (2 mM), EGTA / TG (0,5 mM og 5 uM, henholdsvis), Mn2 + (0,5 mM, uden tilsætning af EGTA eller Ca 2 +, som indeholder fri Ca2 + i um), Mn2 + / 2-APB (75 uM), EGTA / Triton X-100 (0,1%). Montere parabol på scenen af mikroskopet og vælg "Excitation Ratio" mode med excitationsbølgelængder på 360 nm og 390 nm og emission ved 510nm. Samtidig registrerer fluorescenssignaler F 360 nm og F 390 nm med Ratio (F 360 nm / F 390 nm), der vises i det tredje vindue. Driften protokol er: Ca2 + i 1 minut for at stabilisere fluorescens, Mn2 + i 30 sek, EGTA / TG i 10 minutter, Mn2 + i 2 min, EGTA-Triton X-100 (0,1%) i 1 min til opnåelse af baggrunden aflæsning. Mn2 + / 2-APB-opløsning kan anvendes i stedet for Mn2 + for at undersøge afskaffet fluorescensundertrykkelse, hvilket indikerer, at Mn2 + indgang gennem SOCE pathway. 3. Mn quenching assayet i muskelceller C2C12, en muse myogene cellelinie, der dyrkes på glas-bund retter i 5% CO2-atmosfære ved 37 ° C i DMEM-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum, 10% hesteserum. Efter at cellerne når konfluens, er dyrkningsmediet skiftet til differentiering medium (fjern føtalt bovint serum og reduktione hesteserum til 2,5%). De C2C12 myoblaster vil differentiere til myotuber efter 4 dage. Indlæse C2C12 myorør med en endelig koncentration på 5 uM Fura-2 AM som beskrevet i 1,4-1,6. Tilføje en slutkoncentration på 20 uM N-benzyl-p-toluen-sulfonamid (BTS) til at inhibere muskelsammentrækninger og bevægelsen artefakter forårsaget af dem og tillade 15 min før initiering af forsøget. Montere parabol på scenen af mikroskopet er forbundet til PTI enheden og indlæse følgende BSS løsninger i perfusionen systemet: 2 Ca 2 + (2 mM), 0 Ca 2 +, Mn 2 + (0,5 mM), Mn 2 + / TG (0,5 mM, 20 pM, henholdsvis). Oprettet perfusionssystem som beskrevet ovenfor. Samtidig registrerer fluorescenssignaler F 360 nm og F 390 nm med Ratio (F 360 nm / F 390 nm), der vises i det tredje vindue. Driften protokol er: 2 Ca2 + i 1 min, 0 Ca2 + i 1 min til flUSH væk Ca2 +, Mn2 + i 0,5 min, Mn2 + / TG i 10 minutter, og Mn2 + / EGTA-Triton X-100 (0,1%). 4. Rumligt og tidsligt løst SOCE i flået muskelfibre Forbered følgende løsninger. Isotonisk Tyrode-puffer: 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, pH 7,2, 290 mOsm Dyrkningsmedium: DMEM med 2% hesteserum og 1% penicillin og streptomycin Vaskeopløsning # 1: 109,6 mM K-glutamat, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM creatinphosphat (CP), 20 mM N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsyrepuffer syre (BES)-KOH, pH 7,0 Vaskeopløsning # 2: 140 mM K-glutamat, 5 mM EGTA-KOH, 6,5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7,0 Flåning opløsning: 140 mM K-glutamat, 6,5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7,0 TT-loadingOpløsningen: 90,6 mM K-glutamat, 18 mM Na-glutamat, 0,55 mM CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 mM MgCl2, 5,4 mM ATP, 15 mM CP, 0,0025 mg / ml kreatinkinase (CK), 20 mM BES-KOH, 5 uM carbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), pH 7,0, PCA 7,0 SR belastning opløsning: 107,8 mM K-glutamat, 0,98 mM CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6,6 mM MgCl2, 5,4 mM ATP, 15 mM CP, 0,0025 mg / ml CK, 20 mM BES-KOH, 5 uM FCCP, pH 7,0, PCA 6,6 SR nedbrydende opløsning: 100 mM K-glutamat, 40 mM Na-glutamat, 10 mM EGTA-KOH, 10 mM 1,2-bis (o-aminophenoxy) ethan-N, N, N ', N'-tetraeddikesyre (BAPTA ), 0,35 mM MgCl2, 0,5 mM ATP, 1 mM CP, 20 mM BES-KOH, 5 uM FCCP, pH 7,0. 25 mM caffeine/20 uM thapsigargin (TG) tilsættes før eksperimenterne. At dissekere den extensor digitorum longus (EDL) muskel, først fastlægge de mus og arrangere benet på lateral position, så fjern skindet fra anklen området op til knæet, skæresde overfladiske muskel lag af væv for at blotlægge EDL, og afskære både de øvre og nedre sener at frigøre den intakte EDL muskler, er det vigtigt at holde sener så længe som muligt. EDL overføres til en Tyrode-opløsning indeholdende 0 Ca2 + og 0,1 mM EGTA for at undgå kontraktioner. Under et stereomikroskop, skal du bruge to pincet til at holde lavere indsættelse sener og dele EDL muskel i to bundter. Gentag processen for at opnå 4 og derefter 8 bundter. Det er kritisk, sener forbliver for hver af de 8 bundter ved slutningen af processen. Hvis de bliver tabt fra nogle bundter, kassere dem. Under et stereomikroskop, hver EDL bundt strimmel griped på både sener og omhyggeligt strakte sig indtil 3 ~ 4 adskilte enkelte muskelfibre står tilbage intakt med sener på begge sider. Put 1 dråbe af Ca 2 + Tyrode buffer i midten af glasset bund fad, fastsætter EDL strimler lige på fadet, hurtigt at fjerne så meget som muligt afløsning, så tape ned på begge sener med vandafvisende tape, og sørg for båndet er stramt. Vaskes fiberen først med 0 Ca2 +-opløsning og derefter med en 2,5 mM Ca2 + opløsningen 2 gange. Hvis fiberen hyper-kontrakter, og skaden er bemærket, kasseres fiber. Hvis det er nødvendigt, kan fiberen dyrkes i op til 96 timer, hvilket giver genetiske manipulationer. Vask fiberen 3 gange med komplet dyrkningsmedium, og der tilsættes 2 ml medium i skålen, sted i 5% CO2 og 37 ° C inkubator. Før hvert forsøg, undersøger muskelfibre, og smid dem uden klare striation eller med tegn på forurening, eller med tegn på skader såsom kontraktur af sarcolemmal membranen. Gode fibre reagere KCI, elektrisk stimulering, og koffein stimulering. Enkelte muskelfibre vaskes 3 gange med vaskeopløsningen # 1 og badet i intracellulær-lignende afhudning opløsning med 500 pM Rhod-5N og 0,5 mM Ca2 + i 5 minutter. <li> Ved hjælp af en Wolfram nål fastgjort til en stift holder, mekanisk huden fiber under et stereomikroskop, så tværgående tubuli (TT) til automatisk reseal og at fange den Rhod-5N konjugeret med Ca 2 + i TT, vaske de flåede fibrene to gange med vask løsning # 2. Den mekaniske flåningen proces er optimal, når mindre end 25% af cellens bredde fjernes under flåningen processen. At indlæse SR er isolerede fibre inkuberes med flåning opløsning indeholdende 20 pM Fluo-5N AM i 1 time ved stuetemperatur, efterfulgt af omfattende vask med vaskeopløsningen # 2, og inkuberes i yderligere 30 minutter for at tillade fuldstændig de-esterificering af farvestoffet. Efter 30 minutter er isolerede fibre visualiseret under 60X formål konfokalt mikroskop. Fluorescensbilleder erhverves ved bølgelængder i de tilsvarende farvestoffer (excitation ved 543 nm og emission længere end 570 nm for Rhod-5N, excitation ved 488 nm og emission ved 530-560 nm for Fluo-5N). Regions af interesse (ROIs) er valgt for hvert farvestof belastede områder. Den eksperimentelle protokol er som følger: TT-loading opløsning til 120 s, SR-loading opløsning til 120 s, SR-depletion opløsning 400-750 s til nedbryder SR Ca2 +-lagre. Under denne proces, er ændringer i Rhod-5N intensitet (TT Ca2 +) og Fluo-5N intensitet (SR Ca2 +) registreres, hvilket skaber et tidsforløb bestemmelse af relative fluorescens ændringer i TT og SR. Middelværdierne for fluorescensintensitet fra multiple fibre analyseres yderligere. Den maksimale belastning intensitet ved udgangen af TT / SR-lastning normaliseres til 100%. 5. Repræsentative resultater Vi undersøgte SOCE aktivitet Kyse-150-celler under anvendelse intracellulær Ca2 +-måling (figur 2).. Anvendelse RFP som reporter, kan man vælge de individuelle celler transficeret med plasmid indeholdende specifikke shRNA mod orai1, et gen kodende for SOCE channel. Sammenlignet med celler transficeret med plasmider indeholdende scramble shRNA (sort spor) er vælte af Orai1 protein resulterer i nedsat SOCE aktivitet (rød spor). SOCE i Kyse-150-celler blev også bekræftet med Mn2 + quenching assayet (figur 3).. Excitationsbølgelængden 360 nm rapporterer det isosbestiske punkt af Fura-2, hvor fluorescens er uafhængig af Ca2 +-koncentration. Efter TG fuldstændigt udtømt ER Ca2 + butikker, perfusionen af Mn2 + resulterede i en signifikant fluorescens fald. Den samlede SOCE aktivitet kan måles ved et fald på Fura-2 fluorescensintensitet med en stejlere hældning indikerer en mere aktiv SOCE, mens en fladere hældning betydning en mindre aktiv SOCE. Hældningen af fluorescens fald i 2-APB behandlede celler viste sig at være meget fladere, hvilket indikerede, at SOCE aktivitet blev blokeret af denne forbindelse. Mn2 + quenching satser blev bestemt ud fra registreringen af de første 10 sekunder, hvor quenching var stadig i lineære område uden mætning. En lignende Mn2 + quenching assayet blev udført i musklen (figur 4).. I dette tilfælde Mn2 + blev anvendt sammen med TG. Mens TG blev nedbryder SR Ca2 + butikkerne, fluorescensstandsning hældningen gradvist ændret sig, indtil det nåede sin maksimale hastighed. Den sigmoidal kurve angiver det graduerede aktivering af SOCE under disse eksperimentelle betingelser. Sund og intakt enkelte muskelfibre i kultur viste klar og ensartet striation, ingen tegn på forureninger, og ingen tegn på nedgang-induceret skade. Disse fibre var i stand til at trække sig som reaktion på elektrisk stimulation eller depolariserende løsninger. Under konfokal billeddannelse viste flået fiber indfangning af Rhod-5N farvestof i TT rum, karakteristiske pattedyr dublet mønster (visualized i den røde kanal). Efter læsning af SR med Fluo-5N AM, var den typiske afbrudt SR mønster synligt (i grøn kanal). Efter perfusion af hud fiber med TT / SR lastning opløsning forøget fluorescensintensitet af både Rhod-5N og Fluo-5N, ved perfusion med SR depletion opløsning begyndte niveauer af fluorescens i SR kammeret og TT rum at falde, hvilket indikerer tæt kobling mellem SR Ca2 +-lagre opbrug og SOCE aktivering, henholdsvis (figur 5).. Figur 1. Aktivering af store-Ca2 +-optagelse (SOCE). Orai1 er en kanal poredannende enhed placeret på plasmamembranen (PM) og STIM1 en Ca2 +-sensor, der er placeret på det endoplasmatiske eller sarcoplasmatisk reticulum (ER / SR) membraner. Når ER / SR Ca2 +-lagre reduceres enten på grund af blokering af ER / SR Ca2 +-pumpe (SERCA) eller Ca2 +-frigivelse via IP 3-receptor eller ryanodine receptor, STIM1 aktiveret. Aktiverede STIM1 molekyler danner patches og inducere aggregering af Orai1, hvilket yderligere fører aktivering af SOCE. Figur 2. Måling af intracellulær Ca2 + i Kyse-150 celler. Udveksling af ekstracellulær opløsning fra 0 Ca2 + (0,5 mM EGTA) og 2 mM Ca2 + inducerede ikke nogen ændring i intracellulær Ca2 +. 5 uM TG i 0 Ca 2 + badopløsningen induceret passiv ER Ca 2 + frigivelse. Efter ER Ca2 +-lagre blev udtømt (> 10 min), tilsætning af ekstracellulær Ca2 + (2 mM) aktiveres en vedvarende intracellulær Ca2 + lodret gennem SOCE, som kan blokeres af SOCE inhibitorer, fx SKF-96.365 og 2 – APB (data ikke vist). Celler transficeret med plasmider indeholdende shRNA specifikt modorai1 (rød) viste signifikant reduceret SOCE end celler transficeret med scramblesekvens (sort). Figur 3. Mn2 + quenching assayet SOCE i Kyse-150 celler. Quenching af Fura-2-fluorescens ved Mn2 + (0,5 mM) blev målt ved Ca2 +-uafhængig excitationsbølgelængde på Fura-2 (360 nm). Cellerne blev behandlet med 5 pM TG i 10 minutter til fuldstændig nedbryder ER Ca 2 + butikker. Henfald Hældningen af Fura-2 fluorescens efter Mn2 + tilsætning (stiplede linier, indenfor de første 10 sek) repræsenterede aktivering af SOCE, der blev udtrykt som procent reduktion i fluorescens pr tidsenhed (den oprindelige værdi som 100%). Den maksimalt bratkølede fluorescenssignal blev etableret ved slutningen af forsøget ved lysering af cellerne med 0,1% Triton X-100 (som 0%). Celler behandlet med 2-APB (75 uM) viste en meget fladerehældning, hvilket tyder SOCE blokeres af denne forbindelse i Kyse-150-celler. Figur 4. Gradueret aktivering af SOCE i muskelceller afsløret ved Mn2 + quenching assayet. Aktivering af SOCE kan registreres, medens TG nedbryder SR Ca2 +-lagre. Samtidig anvendelse af Mn2 + (0,5 mM) og TG (20 uM) inducerede en gradueret-og S-formet fald i intracellulært Fura-2-fluorescens (cyan stiplet linie for at vise den hurtigste bratkøling point), der var forskellig fra den første Mn2 + quenching sats (blå streg linje). Mn2 + quenching hældning var næsten det samme som basisniveauet i celler behandlet 2-APB (75 uM), hvilket antyder, at SOCE blev inhiberet. Figur 5. Rumligt og tidsligt løst SOCE i flået muskelfiber. (A) RhOD-5N-salt blev fyldt i TT og Fluo-5N AM blev fyldt i SR. (B) Efter påføring Ca2 + depletion opløsning faldt fluorescensen i både TT og SR rum. Tabet af Fluo-5N fluorescens angivet hurtigt frigives SR Ca2 +-indholdet og tab af Rhod-5N fluorescens foreslået aktivering af SOCE.