Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Summary

L'entità del negozio ad azionamento Ca

Abstract

Conservare operato Ca ^{2 +} voce (Soče), in precedenza chiamato capacitivo Ca ^{2 +} voce, è un meccanismo strettamente regolata per influsso di Ca ^{2 +} extracellulare nelle cellule per ricostituire impoverito reticolo endoplasmatico (ER) o reticolo sarcoplasmatico (SR) Ca ^{2 +} negozi ^1,2. Dal Ca ^{2 +} è un messaggero ubiquitario secondo, non è sorprendente vedere che Soče svolge un ruolo importante in una varietà di processi cellulari, compresa la proliferazione, l'apoptosi, la trascrizione del gene e la motilità. Grazie alla sua ampia presenza in quasi tutti i tipi cellulari, comprese le cellule epiteliali ed i muscoli scheletrici, questo percorso ha ricevuto grande interesse ^3,4. Tuttavia, l'eterogeneità delle caratteristiche Soče in diversi tipi di cellule e la funzione fisiologica non sono ancora chiari ^5-7.

Le proprietà funzionali dei canali di Soče può essere rivelato da patch-clamp studi, mentre un ampio corpus di conoscenza thivia s è stata acquisita dalla basato sulla fluorescenza intracellulare di Ca ^{2 +} misure a causa della sua convenienza e fattibilità per high-throughput screening. L'obiettivo di questa relazione è quello di riassumere alcuni fluorescenza a base di metodi per misurare l'attivazione di Soče nelle cellule monostrato, cellule in sospensione e fibre muscolari ^5,8-10. Il più comunemente usato di questi metodi fluorescenza è di controllare direttamente le dinamiche di Ca ^{2 +} intracellulare utilizzando il rapporto di F _340nm e _380nm F (510 nm di lunghezza d'onda di emissione) del raziometrico Ca ^{2 +} indicatore Fura-2. Per isolare l'attività di Soče unidirezionale dal intracellulare Ca ^{2 +} release e Ca ^{2 +} di estrusione, una tempra Mn ^{2 +} test è usato frequentemente. Mn ^{2 +} è noto per essere in grado di permeare nelle cellule tramite Soče mentre è impermeabile ai processi superficie della membrana estrusione o per assorbimento da ER Ca ^{2 +} pompe a causa del suo ingegno un'elevata affinitàh Fura-2. Come risultato, la tempra di Fura-2 fluorescenza indotta dalla entrata di Mn ^{2 +} extracellulare in cellule rappresenta una misura dell'attività di Soče ^9. Raziometrica misurazione e le Mn ⁺² saggi di spegnimento può essere eseguita su una cuvetta basato spettrofluorimetro in una modalità popolazione cellulare o in un microscopio sistema basato su visualizzare le cellule singole. Il vantaggio delle misurazioni singola cellula è che le cellule individuo soggetto a manipolazioni genetiche possono essere selezionati tramite GFP o reporter RFP, che consente studi in cellule geneticamente modificate o mutato. Le caratteristiche spaziotemporali di Soče in strutturalmente specializzato muscolo scheletrico può essere realizzato in fibre muscolari pelle contemporaneamente monitorando la fluorescenza dei due bassa affinità di Ca ^{2 +} indicatori mirati a specifici compartimenti della fibra muscolare, come Fluo-5N nella SR e di Rhod 5N nella trasversale tubuli ^9,11,12.

Protocol

1. Intracellulare di Ca ^{2 +} misura per singole celle

1. KYSE-150, un essere umano esofageo carcinoma a cellule squamose (ECSS) linea cellulare viene coltivato in 5% CO ₂ atmosfera a 37 ° C in RPMI mista 1640/Ham 's F-12 (1:1) contenente 5% di siero fetale bovino.
2. KYSE-150 cellule sono trasfettate con i plasmidi contenenti sia shRNA specifico contro Orai1 o strapazzato sequenza. I plasmidi anche incluso codifica una proteina fluorescente rossa gene (RFP) come reporter, che è azionato da un promotore distinto.
3. Le cellule sono cresciute in fondo di vetro piatti (No. 1,5 vetro di copertura, MatTek, MA) per 48 ore.
4. Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con una soluzione salina bilanciata (BSS) (140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl _2, 2 mM MgCl _2, 10 mM HEPES, pH 7,2).
5. Aggiungere 1 ml di soluzione BSS contenente 2 mM Fura-2 estere acetossimetil (Molecular Probes) nel piatto e avvolgere tutto il piatto con un foglio di protect dalla luce.
6. Incubare le cellule per 40 min a 37 ° C e poi lasciare loro per un ulteriore periodo di 15 min a temperatura ambiente per consentire idrolisi dell'estere essere completata. Lavare le cellule con BSS due volte.
7. Montare il piatto sul palco del microscopio invertito Nikon TE200, che è collegata al PTI spettrofluorimetro, con lunghezze d'onda di eccitazione a 350 e 390 nm ed emissione a 510 nm. Le lunghezze d'onda di eccitazione esatti da utilizzare può variare leggermente a seconda delle ottiche di ogni singolo impianto. I due lunghezze d'onda con miglior rapporto dinamico sono determinate da spettro di eccitazione scansione di Fura-2 sale in soluzioni contenenti Ca ^{2 +} da 0 a 39,8 pM (o superiore concentrazione alla quale è saturo Fura-2 fluorescenza).
8. Impostare un sistema di perfusione gravità con 4 diverse soluzioni in BSS: Ca ^{2 + (2} mM), EGTA (0,5 mM), EGTA-TG (thapsigargin, 5 pM), Ca ^{2 +-2-APB} (un inibitore Soče, 75 pM). Controllato dal computer automatizzato perfusisistemi su possono anche essere utilizzati.
9. Selezionare le cellule che esprimono RFP in modalità di visualizzazione.
10. Posizionare la punta di apertura del sistema di perfusione con ingrandimento 10x fino a quando la punta è proprio sopra la regione di interesse ad un angolo di 45 gradi.
11. Contemporaneamente registrare i segnali di fluorescenza F _350nm e _390nm F. Ratio _(350nm F / F _390nm) viene visualizzato nella finestra del terzo. Modificare le soluzioni di perfusione nel seguente ordine: Ca ^{2 +;} EGTA, Ca ^{2 +;} EGTA-TG; Ca ^{2 +,} Ca ^{2 +-2-APB.}

Il protocollo sopra può essere modificato per la misurazione di intracellulare Ca ^{2 +} nel sistema di sospensione cellulare.

12. Cultura KYSE-150 cellule in un pallone T25 con la condizione cultura come sopra.
13. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, rimuovere il mezzo e sciacquare le cellule con una soluzione BSS.
14. Aggiungere 2,5 ml di soluzione BSS contenente 2 mM Fura-2 AM e incubarele cellule per 40 min a 37 ° C seguita da deesterification.
15. Rimuovere il BSS, aggiungere 2,5 ml di tripsina nel pallone e incubare a 37 ° C finché le cellule distacco. Poi aggiungere 2,5 ml di terreno di coltura per fermare la tripsinizzazione e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 800 rpm per 5 min.
16. Lavare le cellule con un terreno di coltura ancora una volta mediante centrifugazione e risospendere pellet delle cellule in soluzione BSS (senza aggiunta di 2 mM CaCl _2, contenente gamma mM Ca ^{2 +)} e contare il numero di cellule con un hematometer.
17. Aggiungi ~ 10 ⁶ celle in una cuvetta di quarzo (10 mm, Starna Cells) e riempire il volume fino a 2 ml di BSS.
18. Posizionare la cuvetta (mescolando con una barra magnetica) nella spettrofluorimetro.
19. Contemporaneamente registrare i segnali di fluorescenza F _340nm e _380nm F con lunghezza d'onda di emissione a 510 nm. Il protocollo è in esecuzione: BSS, aggiunta di 0,5 pl EGTA (0,25 M archivio), aggiunta di 1 pl thapsigargin(TG, stock 10 mM), l'aggiunta di 4 pl Ca ^{2 +} (1 magazzino M).

2. Mn saggio tempra in cellule in coltura

1. Eseguire lunghezza d'onda di eccitazione di scansione di Fura-2 in soluzioni contenenti varie concentrazione di Ca ^{2 +} da 0 a 39,8 pM per determinare la lunghezza d'onda indipendente dalla concentrazione di Ca come punto isosbestic. Di solito, il punto isosbestic è pari o circa 360 nm.
2. KYSE-150 cellule sono coltivate in vetro fondo piatti e caricate con Fura-2 AM.
3. Impostare il sistema di perfusione con 5 diverse soluzioni BSS: Ca ^{2 +} (2 mm), EGTA / TG (0,5 mM e 5 mM, rispettivamente), Mn ^{2 +} (0,5 mm, senza aggiunta di EGTA o Ca ^{2 +,} contenente libero Ca ^{2 +} in campo pM), Mn ^{2 +} / 2-APB (75 pM), EGTA / Triton X-100 (0,1%).
4. Montare il piatto sul palco del microscopio e selezionare il "Rapporto di eccitazione" modalità con lunghezze d'onda di eccitazione a 360 nm e 390 nm ed emissione a 510nm.
5. Contemporaneamente registrare i segnali di fluorescenza F _360nm e _390nm F con il rapporto (F _360nm / F _390nm) visualizzati nella terza finestra. Il protocollo di marcia è: Ca ^{2 +} per 1 min per stabilizzare la fluorescenza, Mn ^{2 +} per 30 sec, EGTA / TG per 10 min, Mn ^{2 +} per 2 min, EGTA-Triton X-100 (0,1%) per 1 min per ottenere la lettura di sfondo. Mn ^{2 +} / 2-APB soluzione può essere usato al posto di Mn ^{2 +} per esaminare la tempra abolito fluorescenza, che indica che la voce Mn ^{2 +} è attraverso il percorso Soče.

3. Mn saggio tempra in cellule muscolari

1. C2C12, una linea cellulare miogenica topo, viene coltivato su fondo di vetro piatti in 5% CO ₂ atmosfera a 37 ° C in mezzo DMEM contenente 10% siero fetale bovino, siero di cavallo 10%.
2. Dopo che le cellule raggiungono la confluenza, il mezzo di coltura viene cambiato a mezzo di differenziazione (rimuovere siero bovino fetale e riduzionee siero di cavallo al 2,5%). I mioblasti C2C12 si differenziano in miotubi dopo 4 giorni.
3. Caricare C2C12 miotubi con una concentrazione finale di 5 pM Fura-2 AM come descritto in 1,4-1,6.
4. Aggiungere una concentrazione finale di 20 pM N-benzil-p-toluene solfonammide (BTS) per inibire le contrazioni muscolari e gli artefatti di movimento da essi causate e consentire 15 minuti prima di iniziare l'esperimento.
5. Montare il piatto sulla fase del microscopio collegato al dispositivo PTI e caricare le seguenti soluzioni BSS nel sistema di perfusione: 2 Ca ^{2 + (2} mM), 0 Ca ^{2 +,} Mn ^{2 +} (0,5 mM), Mn ^{2 +} / TG (0,5 mM, 20 pM, rispettivamente).
6. Impostare il sistema di perfusione, come descritto sopra.
7. Contemporaneamente registrare i segnali di fluorescenza F _360nm e _390nm con la F Ratio (F _360nm / F _390nm) visualizzato nella terza finestra. Il protocollo è in esecuzione: 2 Ca ^{2 +} per 1 min, 0 Ca ^{2 +} per 1 min a flUSH via Ca ^{2 +,} Mn ^{2 +} per 0,5 min, Mn ^{2 +} / TG per 10 minuti, e Mn ^{2 +} / EGTA-Triton X-100 (0,1%).

4. Soče spazialmente e temporalmente risolte nelle fibre muscolari pelle

1. Preparare le seguenti soluzioni.
   Isotonica Tyrode buffer: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl _2, 2.5 mM CaCl _2, pH 7,2, 290 mOsm
   Terreno di coltura: DMEM con siero di cavallo 2% e 1% di penicillina e streptomicina
   Soluzione di lavaggio # 1: 109,6 mM K-glutammato, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 mM MgCl _2, 2 mM ATP, 6 mM di creatin fosfato (CP), 20 mM di N, N-bis (2-idrossietil)-2-aminoethanesulfonic acido (BES)-KOH, pH 7,0
   Lavare la soluzione # 2: 140 mM K-glutammato, 5 mM EGTA-KOH, 6,5 mM MgCl _2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7,0
   Skinning soluzione: 140 mM K-glutammato, 6,5 mM MgCl _2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7,0
   TT-loadingSoluzione: 90,6 mM K-glutammato, 18 mM Na-glutammato, 0,55 mM CaCl _2, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 mM MgCl _2, 5,4 mM ATP, 15 mM di CP, 0,0025 mg / ml creatina chinasi (CK), 20 mM BES-KOH, 5 carbonile uM cianuro p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), pH 7,0, PCA 7,0
   SR carico soluzione: 107,8 mM K-glutammato, 0,98 mM CaCl _2, 2 mM EGTA-KOH, 6,6 mM MgCl _2, 5,4 mM ATP, 15 mM di CP, 0,0025 mg / ml CK, 20 mM BES-KOH, 5 pM FCCP, pH 7.0, PCA 6,6
   SR soluzione esaurendo: 100 mM K-glutammato, 40 mM Na-glutammato, 10 mM EGTA-KOH, 10 mM 1,2-bis (o-amminofenossi) etan-N, N, N ', N'-tetraacetico (BAPTA ), 0,35 mM MgCl _2, 0,5 mM ATP, 1 mM CP, 20 mM BES-KOH, 5 pM FCCP, pH 7,0. 25 mM caffeine/20 pM thapsigargin (TG) vengono aggiunti prima degli esperimenti.
2. Per sezionare il estensore lungo delle dita (EDL) muscolare, prima stabilisce i topi ed organizzare la gamba in posizione laterale, quindi rimuovere la pelle dalla zona caviglia fino al ginocchio, tagliaregli strati muscolari superficiali di tessuto per esporre la EDL, e tagliare entrambi i tendini superiore e inferiore per liberare il muscolo EDL intatto, è importante mantenere tendini più a lungo possibile. Il EDL viene trasferito ad una soluzione di Tyrode contenente 0 Ca ^{2 +} e 0,1 mM EGTA per evitare contrazioni.
3. In uno stereomicroscopio, utilizzare due pinzette per tenere i tendini di inserzione più basse e dividere il muscolo EDL in due fasci. Ripetere il processo per ottenere 4 e poi 8 bundle. È fondamentale che tendini restano per ciascuno dei fasci 8 al termine del processo. Se sono perse da alcuni fasci, gettarle.
4. In uno stereomicroscopio, ogni striscia fascio EDL è griped a entrambi i tendini e tesa con cura fino al 3 ~ 4 fibre muscolari singole separate vengono lasciati intatti con tendine su entrambi i lati.
5. Mettere 1 goccia di tampone Tyrode Ca ^{2 +} libero nel centro del fondo di vetro piatto, stabiliscono le strisce EDL dritto piatto, rimuovere rapidamente quanto più possibile delsoluzione, poi il nastro premuti entrambi i tendini con del nastro adesivo resistente all'acqua, e assicurarsi che il nastro è stretto. Lavare la prima fibra con il Ca ⁺ 0 ² soluzione e poi con 2,5 mM Ca ^{2 +} soluzione 2 volte. Se la fibra iper-contratti e il danno è notato, eliminare la fibra.
6. Se necessario, la fibra può essere coltivate fino a 96 ore, permettendo manipolazioni genetiche. Lavare le fibre 3 volte con terreno di coltura completo e aggiungere 2 ml di terreno nel piatto, posto nel 5% di CO ₂ e 37 ° C incubatore. Prima di ogni esperimento, esaminare le fibre muscolari e scartare quelli senza striature chiare o con segni di contaminazione, o con segni di danno, come contrattura della membrana del sarcolemma. Buone le fibre rispondere a KCl, stimolazione elettrica, e la stimolazione caffeina.
7. Singole fibre muscolari vengono lavate 3 volte con la soluzione di lavaggio # 1 e immerso in intracellulare, come soluzione di spellatura di 500 pM Rhod-5N e 0,5 mM Ca ^{2 +} per 5 min.
<li> Utilizzando un ago di tungsteno attaccato ad un supporto del perno, meccanicamente la pelle la fibra allo stereomicroscopio, permettendo tubuli trasversi (TT) a richiudere automaticamente e per intercettare l'Rhod-5N coniugato con Ca ^{2 +} nel TT, lavare le fibre dalla pelle due volte con soluzione di lavaggio # 2. Il processo di scuoiatura meccanico ottimale quando è inferiore al 25% della larghezza della cella viene rimossa durante il processo di spellatura.
8. Per caricare il SR, fibre pelle vengono incubati con la soluzione contenente spellatura 20 pM Fluo-5N AM per 1 ora a temperatura ambiente, seguito da lavaggi con soluzione di lavaggio ampie # 2, e incubare per altri 30 min per permettere completa de-esterificazione del colorante.
9. Dopo 30 minuti, le fibre dalla pelle vengono visualizzati nel quadro dell'obiettivo 60X del microscopio confocale. Fluorescenza immagini sono acquisite a lunghezze d'onda dei coloranti corrispondenti (eccitazione a 543 nm e emissione superiore 570 nm per Rhod-5N; eccitazione a 488 nm ed emissione a 530-560 nm per Fluo-5N). Regions di interesse (ROI) sono selezionati per ogni area tintura caricati.
10. Il protocollo sperimentale è la seguente: TT-loading soluzione per 120 s, SR-loading soluzione per 120 s, SR-deplezione della soluzione per 400-750 s di svuotare il negozio SR Ca ^{2 +.} Durante questo processo, variazioni Rhod-5N intensità (TT Ca ^{2 +)} e Fluo-5N intensità (SR Ca ^{2 +)} vengono registrati, creando una determinazione del decorso di tempo relative variazioni di fluorescenza della TT e SR. Valori medi di intensità di fluorescenza da molteplici fibre vengono ulteriormente analizzati. L'intensità massima sovrapposizione al fine di TT / SR-caricamento è normalizzata a 100%.

5. Risultati rappresentativi

Abbiamo esaminato l'attività Soče in KYSE-150 celle con Ca ^{2 +} intracellulare di misura (Fig. 2.). Utilizzando RFP come reporter, abbiamo potuto selezionare le singole cellule trasfettate con il plasmide contenente shRNA specifico contro orai1, un gene che codifica per la c Sočehannel. Rispetto alle cellule trasfettate con plasmidi contenenti scramble shRNA (traccia nera), l'abbattimento dei Orai1 risultati dell'attività della proteina Soče diminuito (traccia rossa).

Soče in KYSE-150 cellule è stata anche confermata con l'Mn ^{2 +} quenching saggio (Fig. 3.). La lunghezza d'onda di eccitazione di 360 nm indica il punto isosbestic di Fura-2, dove la fluorescenza è indipendente dalla concentrazione di Ca ^{2 +.} Dopo TG completamente esaurito ER Ca ^{2 +} negozi, la perfusione di Mn ^{2 +} ha comportato una riduzione significativa fluorescenza. L'attività Soče complessiva può essere misurata mediante la velocità di diminuzione Fura-2 intensità di fluorescenza con una pendenza che indica una Soče più attivo, mentre un significato pendenza meno profondo uno Soče meno attivo. La pendenza della diminuzione della fluorescenza in 2-APB cellule trattate risultavano essere molto meno profondo, che ha indicato che l'attività Soče è stata bloccata da questo composto. Il Mn^{2 +} tassi di spegnimento sono stati determinati dal record dei primi 10 secondi, dove la tempra era ancora in campo lineare senza saturazione.

Una simile Mn ^{2 +} bonifica saggio è stato eseguito nel muscolo (Fig. 4.). In questo caso, Mn ^{2 +} è stato applicato con TG. Mentre TG è stato esaurendo le SR Ca ^{2 +} negozi, la pendenza estinzione della fluorescenza gradualmente cambiato fino a quando non ha raggiunto il suo livello massimo. La curva sigmoidale indica l'attivazione graduale di Soče in queste condizioni sperimentali.

Le fibre muscolari sane intatte unico della cultura mostrava striatura chiara e uniforme, senza segni di contaminazioni, e senza segni di contrazione danno indotto. Queste fibre sono stati in grado di contrarsi in risposta alla stimolazione elettrica o soluzioni depolarizzanti. In confocale, di intrappolamento in fibra spellate Rhod-5N colorante nel vano TT ha mostrato il modello caratteristico doppietto mammiferi (visualized nel canale rosso). Dopo il caricamento della SR con Fluo-5N AM, il modello tipico SR punteggiata era visibile (nel canale verde). Dopo perfusione della fibra pelle con TT / SR soluzione di carico, di intensità di fluorescenza sia Rhod-5N e Fluo-5N aumentata; sulla perfusione con soluzione esaurimento SR, i livelli di fluorescenza nel compartimento SR e il compartimento TT iniziato a diminuire, indicando accoppiamento stretto tra SR Ca ^{2 +} store depauperamento e l'attivazione Soče, rispettivamente (Fig. 5.).

Figura 1. Attivazione di store azionamento Ca ^{2 +} entrata (Soče). Orai1, un poro unità di formazione di canale, si trova sulla membrana plasmatica (PM) e STIM1, un sensore di Ca ^{2 +,} si trova sul reticolo endoplasmatico o sarcoplasmatico (ER / SR) membrane. Quando ER / SR Ca ^{2 +} negozi sono ridotti a causa di blocco del ER / SR Ca ^{2 +} pompa (SERCA) o Ca ^{2 +} liberazione attraverso l'IP ₃ recettore o recettore della rianodina, STIM1 è attivato. Attivati ​​STIM1 molecole formano chiazze e indurre l'aggregazione di Orai1, che porta ulteriormente l'attivazione di Soče.

Figura 2. Misurazione di Ca ^{2 +} intracellulare in cellule KYSE-150. Scambio di soluzione extracellulare da 0 Ca ^{2 +} (0,5 mM EGTA) a 2 mM Ca ^{2 +} non ha indotto alcun cambiamento in intracellulare Ca ^{2 +.} 5 uM TG in 0 Ca ^{2 +} bagno di soluzione passiva indotta ER Ca ^{2 + libero.} Dopo ER Ca ^{2 +} sono stati negozi esaurite (> 10 min), aggiunta di extracellulare Ca ^{2 + (2} mM) attivato un prolungato intracellulare Ca ^{2 +} elevazione attraverso Soče, che può essere bloccato da inibitori Soče, ad esempio, SKF-96.365 e 2 - APB (dati non mostrare). Le cellule trasfettate con plasmidi contenenti shRNA specifico controorai1 (rosso) ha dimostrato Soče significativamente ridotta rispetto alle cellule trasfettate con sequenza scramble (nero).

Figura 3. Mn ^{2 +} quenching saggio di Soče in KYSE-150 cellule. La tempra di Fura-2 fluorescenza da Mn ^{2 +} (0,5 mM) è stata misurata al Ca ^{2 +-indipendente} lunghezza d'onda di eccitazione di Fura-2 (360 nm). Le cellule sono state trattate con 5 pM TG per 10 minuti per esaurire completamente ER Ca ^{2 +} negozi. La pendenza decadimento di Fura-2 fluorescenza su Mn ² Inoltre ⁺ (linee tratteggiate, entro i primi 10 secondi) rappresentato l'attivazione di Soče, che è stata espressa come percentuale di riduzione della fluorescenza per unità di tempo (il valore iniziale come 100%). Il segnale massimo quenched fluorescenza è stata stabilita alla fine dell'esperimento con la lisi delle cellule con 0,1% Triton X-100 (come 0%). Cellule trattate con 2-APB (75 pM) dimostrato una molto meno profondopendenza, suggerendo Soče è bloccata da questo composto in KYSE-150 cellule.

Figura 4. L'attivazione di Graded Soče in cellule muscolari rivelate da Mn ^{2 +} bonifica dosaggio. Attivazione di Soče poteva essere registrato, mentre TG è stato esaurendo SR Ca ^{2 +} negozi. L'applicazione simultanea di Mn ^{2 +} (0,5 mm) e TG (20 uM) ha indotto una diminuzione graduale e sigmoidale di intracellulare Fura-2 fluorescenza (linea tratteggiata ciano per mostrare il punto più veloce quenching), che era distinta dalla prima Mn ^{2 +} bonifica rate (linea tratteggiata blu). Mn ^{2 +} quenching pendenza rimasto pressoché lo stesso livello basale nelle cellule trattate 2-APB (75 pM), suggerendo che Soče stato inibito.

Figura 5. Spazialmente e temporalmente risolte Soče in fibra muscolare pelle. (A) Rhod-5N sale veniva caricato in TT e Fluo-5N AM è stato caricato nel SR. (B) Dopo l'applicazione di Ca ^{2 +} esaurimento soluzione, la fluorescenza sia in TT e gli scompartimenti SR diminuito. La perdita di Fluo-5N fluorescenza indicato rapidamente rilasciata SR Ca ^{2 +} contenuto e la perdita di Rhod-5N fluorescenza suggerito l'attivazione di Soče.

Discussion

Sebbene le lunghezze d'onda di eccitazione di Ca ^{2 +-binding} e Ca ^{2 +} libero Fura-2, 340 nm e 380 nm, rispettivamente, la gamma dinamica migliore rapporto di Fura-2 per la concentrazione di Ca ^{2 +} misura può avvenire in altre lunghezze d'onda in un particolare microscopio sistema. Tali variazioni di lunghezza d'onda di solito sono dovute a variazioni del percorso ottico con l'aggiunta di vari componenti ottici. In questo studio, le lunghezze d'onda di eccitazione di Fura-2 sono stati determinati a 350 nm e 390 nm effettuando l'analisi spettrale di Fura-2 fluorescenza.

Il livello intracellulare Ca ^{2 +} nei risultati citosol di una bilancia di fonti diverse, comprese intracellulare Ca ^{2 +} rilascio, Ca ^{2 +} extracellulare ingresso, così come Ca ^{2 +} meccanismo di esclusione a livello della membrana plasmatica e ER. Per isolare il unidirezionale SOC-mediata Ca ^{2 +} intracellulare afflusso di Ca ^{2 +} release e Ca ^{2 +} extrperfusione, l'Mn ^{2 +} quenching saggio può essere utilizzato. Mn ^{2 +} è noto per essere in grado di permeare nelle cellule tramite Soče ma è impermeabile alla superficie della membrana estrusione o assorbimento ER da Ca ^{2 +} pompe. Pertanto, estinzione di fluorescenza rappresenta una misura di unidirezionale Mn ^{2 +} flusso in cellule che stima il grado di attivazione di Soče. Mn ^{2 +} bonifica saggio viene eseguito al punto isosbestic, a tale lunghezza d'onda Fura-2 intensità di fluorescenza è indipendente dalla concentrazione di Ca ^{2 +.} Il punto isosbestic per ogni sistema dovrebbe essere determinata mediante scansione spettro. In alternativa, Mn ^{2 +} bonifica può essere registrato da fluorescenza regolata in qualsiasi due lunghezze d'onda in modo tale che il valore finale è indipendente concentrazione di Ca ^{2 + 13.}

Per ottenere le informazioni spaziali e temporale di attività di Soče nei muscoli scheletrici, abbiamo impiegato un processore dual-colorante metodo che consenta MeasureMe simultaneant di attività Soče e SR Ca ^{2 +} contenuto in pelle dei mammiferi adulti fibre muscolari EDL. La correlazione tra i cambiamenti nella SR Ca ^{2 +} attività Soče contenuti e possono essere tracciate per indicare la soglia e la sensibilità di attivazione Soče alla deplezione del Ca ⁺ SR ² di stoccaggio. La TT-loading soluzione è ottimizzata per caricare ulteriormente le T-tubuli con Ca ^{2 +} e per l'innesco dei T-tubuli e la SR-loading soluzione è progettata per promuovere la massima SR Ca ^{2 +} carico e per caricare ulteriormente le T-tubuli con ~ 500 pM Ca ^{2 +.} FCCP è incluso nel TT / SR-caricamento soluzione e il SR deplezione soluzione per eliminare gli effetti della mitocondri.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Mediatech	10-040-CV
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
DMEM	Mediatech	10-013-CV
Glass Bottom Dish	MatTek	P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	-20 °C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO
Fluo-5N AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F14204	-20 °C, seal tight, protected from light
Rhod-5N	Invitrogen (Molecular Probes)	R14207	-20 °C, seal tight, protected from light
Quartz Cuvette	Starna Cells	3-Q-10
thapsigargin	Tocris	1138
2-Amin–thoxydiphenylborane (2-APB)	Tocris	1224
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Collagenase Type I	Sigma	C0130
Equipment:
A spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon arc lamp, computer-controlled high-speed random access monochromator, cuvette-based emission monochromator, Nikon TE-200 inverted fluorescence microscope, S Fluor 40x/1.30 oil objective, PMT detectors. Laser Scanning Confocal Microscope (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 inverted microscope, 60X objective (N.A. 1.4, oil). A stereomicroscope with a magnification power > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).