Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Summary

Mağaza çalışan Ca ölçüde

Abstract

Mağaza önceki kapasitif Ca ^{2 +} girişi olarak adlandırılan, Ca ^{2 +} girişi (SOCE) ameliyat, ⁺ tükenmiş endoplazmik retikulum (ER) veya sarkoplazmik retikulum (SR) Ca ^{2 +} depolarının doldurulmasıdır hücre içine ekstraselüler Ca ² akını için sıkı regüle mekanizmadır ^1,2. Ca ^{2 +} bir yerde ikinci bir haberci olduğu için, o SOCE çoğalması, apoptoz, gen transkripsiyonu ve motilite dahil, hücresel süreçlerin çeşitli önemli rol oynar görmek şaşırtıcı değildir. Epitel hücreleri ve iskelet kasları dahil olmak üzere hemen hemen tüm hücre tipleri, içinde geniş görülmesi nedeniyle, bu yolu büyük ilgi ^3,4 aldı. Ancak, farklı hücre tipleri ve fizyolojik fonksiyonu SOCE özellikleri heterojenite hala ^5-7 net değil.

SOCE fonksiyonel kanal özellikleri thi hakkında bilgi büyük bir gövde ise, yama klemp çalışmalarla ortaya edilebilirs yolu çünkü yüksek verimli tarama rahatlığının ve fizibilite floresans tabanlı hücre içi Ca ^{2 +} ölçümleri ile elde edilmiştir. Bu raporun amacı, tek tabakalı hücreler, askıya hücreleri ve kas lifleri ^5,8-10 içinde SOCE aktivasyonu ölçmek için bir kaç floresans tabanlı yöntemler özetlemektir. En yaygın olarak floresans bu yöntem kullanılır, doğrudan intraselüler ^{Ca2 +} dinamiği izlemek için F ve _{340 nm} oranlı metrik ^{Ca2 +} göstergesi Fura-2 F _380nm (emisyon dalga boyu için 510 nm) oranı kullanılarak bir. Hücre içi ^{Ca2 +} serbest bırakılması ve Ca arasından ² yönlü SOCE aktivitesini izole etmek için ⁺ ekstrüzyon, bir Mn ^{2 +} soğutmadan assay sıkça kullanılır. Mn ^{2 +} o yüzeye membran ekstrüzyon süreçlere veya Ca ² tarafından ER uptake geçirmez iken SOCE yoluyla hücre içine nüfuz edebilir olduğu bilinmektedir ⁺ olan çok yüksek bir afiniteye wit nedeniyle pompalarh Fura-2. Bunun sonucu olarak, ⁺ hücrelerine ekstraselüler Mn ² girişi ile indüklenen Fura-2 floresans soğutmadan SOCE ⁹ faaliyeti, bir ölçüm temsil eder. Oranlı metrik ölçümü ve Mn ⁺² soğutmadan deneyleri, bir hücre popülasyonunu modunda ya da tek hücrelerin canlandırmak için mikroskop tabanlı bir sistem içerisinde bir küvet bazlı spectrofluorometer üzerinde gerçekleştirilebilir. Tek hücre ölçümlerin avantajı gen manipülasyonu tabi tek tek hücrelerin genetik olarak modifiye edilmiş ya da mutasyon hücrelerinde çalışmaları sağlayan GFP veya RFP gazetecilere kullanılarak seçilebilir olmasıdır. Yapısal olarak özel bir iskelet kasında SOCE arasında zamanmekansal özellikleri aynı anda iki düşük afinite Ca ² floresans izlenerek kabuklu kas fiberler elde edilebilir SR ve bu gibi flüoresan 5N olarak kas fiberin özel bir bölme, hedeflenen ⁺ göstergeleri Rhod- transvers tübüller ^9,11,12 olarak 5N.

Protocol

1. ^{Ca2 +} tek tek hücrelerin hücre içi ölçümü

1. KYSE-150, bir insan özofagus skuamöz hücreli karsinom (ECSS) hücre hattı 37% 5 CO _{2 atmosferinde} kültüre ° C% 5 fetal sığır serumu içeren karışık RPMI 1640/Ham 'nin F-12 orta (1:1) içinde.
2. KYSE-150 hücreleri plazmit ile transfekte edilmiş olan, ya Orai1 ya da bir karıştırılmış sekansı karşı spesifik olarak shRNA içeren. Plazmidler, aynı zamanda, ayrı bir promotör tarafından sürülen bir raportör gibi bir gen kodlaması kırmızı floresan proteini (RFP) dahildir.
3. Hücreler 48 saat boyunca (No 1.5 cam kapak, MatTek Corp, MA) cam alt yemekleri yetiştirilmektedir.
4. Orta çıkarın ve dengeli tuz çözeltisi (BSS) (140 mM NaCI, 2.8 mM KCI, ₂ mM CaCl2, 2 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.2) ile hücre durulanır.
5. Kabına 2 uM Fura-2 asetoksimetil ester (Molecular Probes) içeren 1 ml BSS çözümü ekleyin ve prote için folyo ile bütün çanak sarmakIşıktan ct.
6. 37 ° C'de 40 dakika süreyle inkübe edilir ve daha sonra hücreler ester hidrolizi tamamlanmasını sağlamak için oda sıcaklığında ilave bir 15 dakika süreyle bırakırlar. Iki kez BSS ile hücreleri yıkayın.
7. 510 nm 350 ve 390 nm eksitasyon ve emisyon dalga boyuna sahip, PTI spectrofluorometer bağlı Nikon TE200 inverted mikroskop, sahnesine çanak monte edin. Kullanılacak kesin uyarma dalga boyları biraz her bir sistemin optik bağlı olarak değişebilir. Dinamik iyi oranı ile iki dalga boyu ^{Ca2 +} 0 ila 39.8 uM (ya da 2-Fura floresans doymuş az daha yüksek konsantrasyon) arasında değişen içeren çözeltilerde Fura-2 tuz tarama eksitasyon spektrumu ile tespit edilir.
8. Ca ^{2 +} (2 mM), EGTA (0.5 mM), EGTA-TG (thapsigargin, 5 mM), ^{Ca2 +-2-APB} (a SOCE inhibitörü, 75: BSS 4 farklı çözüm ile bir yerçekimi perfüzyon sistemi ayarlama uM). Bilgisayar kontrollü otomatik perfusiüzerine sistemleri de kullanılabilir.
9. Görselleştirme modunda RFP ifade hücreleri seçin.
10. Ucu 45 derecelik bir açıyla sağa ilgi bölgenin üstüne kadar 10x büyütmede perfüzyon sisteminin açılışını ucu yerleştirin.
11. Aynı zamanda floresan sinyalleri F _350Nm ve F _390nm kaydedin. Oranı (F _350Nm / F _390nm) üçüncü penceresinde görüntülenir. ; EGTA; Ca ^{2 +;} EGTA-TG; Ca ^{2 +,} Ca ^{2 +-2-APB} Ca ^{2 +:} aşağıdaki sırayla perfüzyon çözümler değiştirin.

Yukarıda protokolü ⁺ hücre süspansiyonu sistemi içinde hücre içi Ca ² ölçümü için değiştirilebilir.

12. Yukarıdaki ile aynı kültürü koşulu ile bir şişe içerisinde kültüre T25 KYSE-150 hücreleri.
13. Hücrelerin% 90 izdiham ulaştığınızda, orta çıkarın ve BSS çözümü ile hücreleri durulayın.
14. 2 uM Fura-2 AM ve inkübe içeren 2.5 ml BSS çözümü ekle37, 40 dakika boyunca hücreleri ° C deesterification izledi.
15. Hücreleri ayırmak ° C ye kadar BSS çıkarın, 37 balon ve inkübe içine 2,5 ml tripsin ekleyin. Sonra tripsinizasyon durdur ve 5 dakika boyunca 800 rpm'de santrifüj yoluyla hücre hasat etmek için 2.5 ml'lik kültür ortamına ilave edin.
16. Santrifüjle kültür ortamından sahip hücrelerin bir kez daha yıkayıp BSS çözelti içine hücreleri 'pelet ₍₂ mM CaCl2 ilave edilmeden, ^{Ca2 +} uM aralığı içeren) tekrar askıya ve bir hematometer kullanılarak hücrelerin sayısını.
17. Kuvars küvetine (10 mm, Starna Hücreleri) içine ~ 10 ⁶ hücre ekleme ve BSS ile 2 ml hacmi kadar doldurun.
18. Spectrofluorometer içine küvet (manyetik ile karıştırılır) yerleştirin.
19. Aynı zamanda 510 nm emisyon dalga boyu ile floresan sinyalleri F _340nm ve F _380nm kaydedin. Çalışan bir protokoldür: 1 ul thapsigargin ve BSS, 0.5 ul EGTA (0.25 M stok) ilave, ek(TG, 10 mM stok), 4 ul Ca ^{2 +} (1 M stok) ilavesi.

2. Kültürlenmiş hücrelerde Mn soğutmadan deneyi

1. Dalgaboyu çeşitli Ca ² içeren çözeltilerde Fura-2 taranması gerçekleştirmek isosbestic noktası olarak Ca konsantrasyonunu belirlemek için bağımsız bir dalga boyunun 0 ila 39.8 uM arasında değişen ⁺ konsantrasyonu. Genellikle, isosbestic noktada 360 nm ya da yakın.
2. KYSE-150 hücre sırça yemekleri kültüre ve Fura-2 AM yüklenir.
3. 5 farklı BSS çözümleri ile perfüzyon sistemi kurun: Ca ^{2 +} (2 mM), EGTA / TG (sırasıyla 0.5 mM ve 5 uM), Mn ^{2 +} (0.5 mM EGTA veya Ca ^{2 +} ilave edilmeden, ücretsiz içeren Ca ⁺ uM aralığında) ^2, Mn ^{2 +} / 2-APB (75 uM), EGTA / Triton X-100 (% 0.1).
4. Mikroskobun sahnede çanak Mount ve 510 eksitasyon 360 nm dalga boylarında ve 390 nm ve emisyon ile "Uyarma Oranı" modunu seçinnm.
5. Aynı zamanda Oranı F _360nm ve _390nm F (F _360nm / F _390nm) üçüncü penceresinde görüntülenen floresan sinyalleri kaydedin. Çalışan bir protokoldür: ^{Ca2 +} 1 dakika için Mn ^{2 +} 30 sn için, 10 dakika için, EGTA / Mn TG ^{2 +} 2 dakika süreyle, EGTA-Triton X-100 (% 0.1) 1 dakika boyunca, floresans stabilize etmek için Arka plan okuma elde etmek için. Mn ^{2 +} / 2-APB çözüm ^+, Mn ^{2 +} girişi SOCE yolu aracılığıyla olduğunu gösterir kaldırıldı floresans, incelemek yerine, Mn ² kullanılabilir.

3. Kas hücrelerinde Mn soğutmadan deneyi

1. C2C12, bir fare miyojenik hücre hattı,% 10 fetal bovin serumu,% 10 at serumu ihtiva eden DMEM ortamı içinde 37 ° _C'de% 5 CO2 atmosferinde cam-alt yemek üzerinde kültive edilir.
2. Hücreleri birleştiği ulaştıktan sonra, kültür ortamı (kaldırmak fetal bovin serumu ve redüksiyonun farklılaşma orta değiştirilir% 2.5 'e at serumu). C2C12 matür 4 gün sonra myotubes farklılaşır.
3. 5 uM'lik bir son konsantrasyon Fura-2 olarak tanımlanan Pasif 1,4-1,6 olan C2C12 myotubes yerleştirin.
4. Kas kasılma ve bunların yol açtığı hareket eşya inhibe eden ve deney başlamadan önce 15 dakika izin vermek için 20 uM N-benzil-p-toluen sülfonamid (BTS) bir son konsantrasyon ekleyin.
5. PTI cihaza bağlı mikroskop sahnede çanak takın ve perfüzyon sistemine aşağıdaki BSS çözümleri yüklemek: 2 Ca ^{2 +} (2 mM), 0 Ca ^{2 +,} Mn ^{2 +} (0.5 mM) Mn ^{2 +} / TG (0.5 mM, 20 uM idi).
6. Yukarıda tarif edildiği gibi perfüzyon sistemi ayarlayın.
7. Aynı zamanda üçüncü penceresinde görüntülenen Oranı (F _360nm / F _390nm) ile floresan sinyalleri F _360nm ve F _390nm kaydedin. Çalışan bir protokoldür: 2 ⁺ 1 dakika boyunca, 0 ^{Ca2 +} 1 dakika süreyle fl Ca ²uzağa Ush ^{Ca2 +,} Mn ^{2 +} 0.5 dk, Mn ² dakika 10 ve Mn için ^{2 +} / TG ⁺ / EGTA-Triton X-100 (% 0.1).

4. Tenli kas liflerinde ve mekansal çözüme SOCE

1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
   İzotonik Tyrode tamponu: 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, 2.5 mM _CaCl2, pH 7.2, 290 mOsm
   Kültür orta:% 2 at serumu ve% 1 penisilin ve streptomisin ile DMEM
   Çözeltisi # 1 yıkayıp: 109.6 mM potasyum glutamat-, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 mM _MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM kreatin fosfat (CP), 20 mM N, N-bis (2-hidroksietil)-2-aminoetansülfonik asit (BES)-KOH, pH 7.0
   140 mM potasyum glutamat-, 5 mM EGTA-KOH, 6,5 mM _MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7.0: çözeltisi # 2 yıkayıp
   140 mM potasyum glutamat-, 6,5 mM _MgCl2, 2 mM ATP, 6 mM CP, 20 mM BES-KOH, pH 7.0: çözeltisi derisini
   TT-yüklemesolüsyonu: 90.6 mM potasyum glutamat-, 18 mM Na-glutamat, 0.55 mM _CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6,7 mM _MgCl2, 5.4 mM ATP, 15 mM CP, 0.0025 mg / ml kreatin kinaz (CK), 20 mM BES-KOH, 5 uM karbonil siyanür p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), pH 7.0, PCA 7.0
   SR yükleme solüsyonu: 107.8 mM potasyum glutamat-, 0.98 mM _CaCl2, 2 mM EGTA-KOH, 6,6 mM _MgCl2, 5.4 mM ATP, 15 mM CP, 0.0025 mg / ml CK, 20 mM BES-KOH, 5 uM FCCP, pH 7.0, PCA 6.6
   SR tüketen solüsyonu: 100 mM potasyum glutamat-, 40 mM Na-glutamat, 10 mM EGTA-KOH, 10 mM 1,2-bis (o-aminofenoksi) etan-N, N, N ', N'-tetraasetik asit (BAPTA ), 0.35 mM _MgCl2, 0.5 mM ATP, 1 mM CP, 20 mM BES-KOH, 5 uM FCCP, pH 7.0. 25 mM caffeine/20 uM thapsigargin (TG) deneyleri önce eklenir.
2. Ekstansör digitorum longus (EDL) kas incelemek için, önce fareler uzandı ve lateral pozisyonda bacak düzenleyin ve sonra kesilir kadar diz, ayak bileği bölgesinden deri kaldırmakdoku yüzeysel kas tabakalar EDL maruz ve sağlam EDL kas boşaltmak için üst ve alt tendonları hem koparmak üzere; mümkün olduğu sürece tendonları tutmak için önemlidir. EDL herhangi kasılmaları önlemek için 0 ^{Ca2 +} ve 0.1 mM EGTA içeren Tyrode çözeltisi transfer edilir.
3. Bir stereomikroskop altında, daha düşük yerleştirme tendonlar sarılmak için iki cımbız kullanın ve iki demetleri içine EDL kas ayrıldı. 4 ve 8 demetleri elde etmek işlemi tekrarlayın. Bu tendonlar işleminin sonunda 8 demetinin her boyunca kalırlar olması kritik bir durumdur. Bazı demetleri kayıp varsa, onları atın.
4. Bir stereomikroskop altında, her EDL paket şeridi 3 kadar her iki tendon de griped ve dikkatli gerilir ~ 4 ayrı tek kas liflerinin her iki tarafta tendon bozulmadan kalır.
5. Sırça yemeğin ortasında ⁺ ücretsiz tyrode tampon, düz tabak üzerine EDL şeritler yatıp Ca ² 1 damla koyun, hızlı mümkün olduğunca kaldırıyoruzÇözüm, daha sonra suya dayanıklı seloteyip ve bant emin olun kullanarak her iki tendon aşağı bant sıkı. 0 ^{Ca2 +} çözeltisi ile ve daha sonra bir 2.5 mM ^{Ca2 +} çözeltisi 2 kez birinci fiber yıkanır. Lif hiper-sözleşmeler ve hasar dikkat edilirse, fiber atın.
6. Gerekirse, fiber genetik manipülasyonlar izin veren, 96 saat için kadar kültüre edilebilir. Tam bir kültür ortamı olan fiber 3 kez yıkayın ve çanak içine 2 ml orta,% 5 CO ₂ ve 37 ° C inkübatör yer ekleyin. Her deneyden önce, kas lifleri incelemek ve net çizgili olmayanlar veya kirlenme belirtileri ile veya bu sarkolemmal membran kontraktürü olarak hasar belirtileri ile atın. İyi lifler KCl, elektrik stimülasyonu, ve kafein uyarısına cevap verme.
7. Tek kas lifleri yıkama çözeltisi # 1 ile 3 kez yıkanır ve ⁺ 5 dakika boyunca 500 uM Rhod-5N ve 0.5 mM Ca ² ile hücre içi benzeri zarını çözelti içinde yıkanmış edilir.
<li> ⁺ TT, iki kez tenli lifleri yıkamak otomatik reseal ve Ca ² Rhod-5N konjuge yakalamak için transvers tübüller (TT) sağlayan bir stereomikroskop altında fiber kaplama mekanik, bir iğne tutucu bağlı bir tungsten iğne kullanma çözüm # 2 yıkama. Hücre genişliği az% 25 zarını işlemi sırasında kaldırıldığında mekanik zarını süreci en uygunudur.
8. SR yerleştirmek için, kabuklu lifler flüoresan 5N izin vermek için ek bir 30 dakika süre ile yıkama çözeltisi # 2, ve inkübe kullanılarak yaygın yıkama izledi, oda sıcaklığında 1 saat için 20 uM AM ihtiva eden arayüz çözeltisi ile inkübe edilir de-esterifikasyon komple boya.
9. 30 dakika sonra, fiberler kabuklu konfokal mikroskop altında görüntülendi 60X amacı vardır. Floresans görüntüleri karşılık boyalar (; Fluo-5N için 530-560 nm 488 nm ve emisyon eksitasyon 543 nm ve Rhod-5N için 570 nm uzun emisyon eksitasyon) dalga boyları elde edilir. Regiilgi ons (ROI) her boya yüklü alanlar için seçilir.
10. Deney protokolü aşağıdaki gibidir: 400-750 s SR Ca ^{2 +} mağaza tüketmek için 120 s, SR-tükenmesi çözümü için 120 s, SR-yükleme çözümü için TT-yükleme çözüm. Bu süreçte, Rhod-5N yoğunluğundaki değişiklikler (TT Ca ^{2 +)} ve Fluo-5N yoğunluğu (SR Ca ^{2 +)} TT ve SR göreli floresans değişikliklerin bir zaman tabii belirlenmesi oluştururken, kaydedilir. Birden fazla elyaflardan floresans yoğunluğunu ortalama değerleri daha analiz edilir. TT / SR-yükleme sonunda maksimal yükleme yoğunluğu% 100 normalize edilir.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Bu hücre içi Ca ² kullanılarak KYSE-150 hücreleri SOCE aktivite incelendi ⁺ ölçümü (Şekil 2).. Muhabir olarak RFP kullanarak, orai1 karşı plazmid içeren özel shRNA ile transfekte tek hücreleri seçebilirsiniz, bir gen SOCE c kodlayanhannel. Kapış shRNA (siyah iz), azalmış aktivite SOCE (kırmızı iz) in Orai1 protein sonuçlarının aşağı vurma. Içeren plazmid ile transfekte hücreleri ile karşılaştırıldığında

KYSE-150 hücreleri SOCE da Mn ^{2 +} ıslah yöntemi (Şekil 3). Ile teyit edilmiştir. 360 nm dalga boyu uyarılması floresans ^{Ca2 +} konsantrasyonu bağımsızdır Fura-2 isosbestic noktası bildirmektedir. TG tamamen ER Ca ² seyreltilmiş sonra ⁺ depolar, Mn ² perfüzyon ⁺ önemli bir floresans azalma ile sonuçlanmıştır. Genel SOCE aktivitesi sığ bir şev anlamı ise daha az aktif SOCE, daha aktif SOCE gösteren dik bir eğime sahip Fura-2 floresans yoğunluğunu azalma oranı ile ölçülebilir. 2-APB tedavi edilen hücrelerde floresan düşüş eğiminin bu SOCE aktivite bu bileşik tarafından engellendi görülürken, çok sığ olduğu ortaya çıktı. Mn^{2 +} soğutmadan oranları soğutmadan doygunluk olmadan lineer aralığında hala başlangıç ​​10 saniye, bir kayıt ile tespit edildi.

Benzer bir Mn ^{2 +} soğutma deneyi kas (Şekil 4). Yapıldı. Bu durumda, Mn ^{2 +} TG birlikte tatbik edilmiştir. TG SR Ca ^{2 +} mağazaları tüketen iken onun maksimum hızı ulaşıncaya kadar, floresans yamaç yavaş yavaş değişti. Sigmoidal eğrisi, bu deney koşulları altında SOCE arasında dereceli aktivasyonu gösterir.

Kültür Sağlıklı bozulmamış tek kas liflerinin açık ve düzgün çizgili, kontaminasyonların hiçbir işaret ve daralma bağlı hasara rastlanmadı. Bu liflerin elektrik stimülasyonu veya depolarizan çözümleri yanıt olarak sözleşme başardık. Konfokal görüntüleme altında, TT bölmeye Rhod-5N boya tenli elyaf yakalama (Visu karakteristik memeli çifti paterni gösterdi) kırmızı kanalı alized. Fluo-5N AM ile SR yükledikten sonra, tipik sıçramalı SR desen (yeşil kanal) görülebiliyordu. TT / SR yükleme solüsyonu ile tenli lif perfüzyon üzerine, Rhod-5N ve Fluo-5N hem floresan yoğunluğu artmış; SR tükenmesi çözeltisi ile perfüzyon üzerine, SR bölmesi ve TT kompartmanda floresans düzeyleri sıkı bağlantı gösteren, azalmaya başladı SR Ca ² arasında sırasıyla ⁺ mağaza tükenmesi ve SOCE aktivasyon, (Şekil 5)..

Şekil 1.. Aktivasyon mağaza çalışan Ca ^{2 +} girişi (SOCE). Orai1, birim oluşturan bir kanal gözenek, plazma zarı (PM) ve STIM1, bir Ca ^{2 +} sensörü bulunan endoplazmik veya sarkoplazmik retikulum (ER / yer almaktadır SR) membranlar. ER / SR Ca ^{2 +} mağazaları nedeniyle ER / SR Ca ^{2 +} pompası (SERC engelleme ya da indirgenir zamanA) ya da Ca ² IP ₃ reseptör veya riyanodin reseptör aracılığıyla ⁺ sürümü, STIM1 aktive edilir. Aktive STIM1 molekülleri yamalar oluştururlar ve daha fazla SOCE aktivasyonu açar Orai1 agregasyonu, indüklemek.

Şekil 2. ⁺ KYSE-150 hücrelerinde hücre içi Ca ² ölçümü. 0 Ca ^{2 +} (0.5 mM EGTA) 2 mM Ca ² hücre dışı çözüm Borsası ⁺ hücre içi Ca ^{2 +} herhangi bir değişiklik neden olmadı. 0 Ca ^{2 +} banyo çözümü kaynaklı pasif ER Ca ^{2 +} sürümde TG 5 uM. ER Ca ² sonra ⁺ depolar ekstraselüler ^{Ca2 +} (2 mM) ilave SOCE inhibitörleri tarafından bloke edilebilir SOCE vasıtasıyla sürekli Hücre içi ^{Ca2 +} yükselme aktive, (> 10 dakika) tüketilmiş edildi, örneğin SKF-96365 ve 2 - APB (verileri göstermiyor). Karşı spesifik olarak shRNA içeren plazmit ile transfekte edilmiş hücrelerinorai1 (kırmızı) karıştıran sekansı (siyah) ile transfekte edilmiş hücrelerin daha önemli ölçüde azaltılmış SOCE göstermiştir.

Şekil 3. Mn ^{2 KYSE-150} hücreleri SOCE arasında ⁺ soğutmadan assay. Mn ^{2 +} (0.5 mM) ile Fura-2 floresans soğutmadan Fura-2 (360 nm) ^{+-bağımsız} dalgaboyu Ca ² ölçüldü. Hücreler, tamamen ER ^{Ca2 +} depolar tüketeceğinden 10 dakika süreyle TG 5 uM ile muamele edildi. Mn ² üzerine Fura-2 floresans bozunum eğimi ⁺ ek (çizgi hatları, ilk 10 saniye içinde) birim zamanda floresans oranında azalma (% 100 olarak başlangıç ​​değeri) olarak ifade edildi SOCE aktivasyonu, temsil etti. Söndürülmüş maksimum floresans sinyali ile hücre parçalama tarafından deneyi sonunda kurulmuş% 0.1 Triton X-100 (% 0). 2-APB (75 uM) ile muamele edilmiş hücreleri bir çok sığ gösterdieğim, düşündüren SOCE KYSE-150 hücrelerinde bu bileşik tarafından engellenir.

Şekil 4. TG SR Ca ^{2 +} mağazaları tüketen iken Mn ² gösterdiği kas hücrelerinde SOCE, kademeli aktivasyonu ⁺ su verme deneyi. SOCE aktivasyonu tescil edilebilir. Mn ^{2 +} (0.5mM) ve TG (20 uM) aynı anda uygulanmasından intrasellüler Fura-2 ilk Mn ² farklı bulunmuştur floresans (hızlı soğutma noktasına göstermek için mavi çizgi çizgi), ⁺ su verme bir kademeli ve sigmoid düşme gözlenmiştir oranı (mavi çizgi çizgi). Mn ^{2 +} soğutma yamaç olduğu SOCE inhibe edildi düşündüren, neredeyse 2-APB (75 uM) tedavi edilen hücrelerde bazal seviye olarak aynı kaldı.

Şekil 5. Ve mekansal tenli kas lif SOCE düzeldi. (A) Rhod-5N tuz TT ve Fluo-5N AM konuldu SR konuldu. (B) ⁺ tükenmesi çözüm Ca ² uygulandıktan sonra, TT ve SR bölümlerinde hem de floresan azalmıştır. Fluo-5N floresans kaybı hızla ⁺ içerik ve Rhod-5N floresans kaybı SOCE aktivasyonu önerilen SR Ca ² serbest belirtti.

Discussion

Ca ^{+ 2-bağlayıcı} ve ^{Ca2 +} serbest Fura-2 uyarma dalga boyları sırasıyla, 340 nm ve 380 nm olmasına rağmen, Ca ² için Fura-2 iyi oranı dinamik aralığı ⁺ konsantrasyonunun ölçülmesi belirli bir başka dalga boylarında oluşabilir mikroskop sistemi. Bu tür değişimler dalga boyunda genellikle farklı optik bileşenlerin ilavesi ile optik yol üzerinde değişikliklere bağlı bulunmaktadır. Bu çalışmada, Fura-2 için uyarma dalga Fura-2 floresans spektral analizi yaparak 350 nm ve 390 nm olarak belirlendi.

Dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan arasında bir denge, gelen sitozolüne sonuçlar ^{intraselüler} Ca2 ⁺ seviyesi ^{intraselüler} Ca2 ⁺ serbest bırakma, hücre dışı ^{Ca2 +} giriş yanı sıra, ER ve plazma membranında ^{Ca2 +} dışlama mekanizmasıdır. Hücre içi Ca ^{2 +} sürümü ve Ca ^{2 +} extr gelen tek yönlü SOC-aracılı Ca ^{2 +} akını izole etmek içinusion, Mn ^{2 +} soğutmadan test kullanılabilir. Mn ^{2 +} SOCE yoluyla hücre içine nüfuz edebilmek için bilinen ama yüzey membran ekstrüzyon veya Ca ² ER alımı ⁺ pompaları geçirmeyen edilir. Bu nedenle, flöresan söndürmesiyle SOCE aktivasyon derecesi tahmin hücrelerin içine tek yönlü Mn ^{2 +} akısı bir ölçüm temsil eder. Mn ^{2 +} soğutmadan deneyi gibi dalga boyunda, isosbestic noktada gerçekleştirilir Fura-2 floresans yoğunluğunu ^{Ca2 +} konsantrasyonu bağımsızdır. Edilir Her sistem için isosbestic noktası spektrum taraması ile tespit edilir. Alternatif olarak, Mn ^{2 +} soğutmadan son değere ^{Ca2 +} konsantrasyonu ¹³ bağımsız şekilde herhangi iki dalga boyunda ayarlanmış floresans tarafından kaydedilebilir.

Iskelet kaslarında SOCE faaliyet zamansal ve mekansal bilgi almak için, simultane ölçüm tekni sağlayan bir çift boya yöntemi, istihdamSOCE aktivite ve SR Ca ² tenli yetişkin memelilerin EDL kas liflerinin ⁺ içerik nt. SR Ca ² değişimler arasındaki ilişki ⁺ içeriği ve SOCE aktivite SR Ca ² tükenmesi ⁺ depolama SOCE aktivasyon eşiği ve duyarlılık göstermek için çizilebilir. TT-yükleme çözüm ek Ca ² T-tubul yüklemek için optimize edilmiştir ⁺ ve T-tubul ve SR-yükleme çözüm priming için maksimal SR Ca ^{2 +} yükleme teşvik etmek ve ayrıca T-tubul yüklemek için tasarlanmıştır ~ 500 uM Ca ² ile ^+. FCCP TT / SR-yükleme çözümü ve mitokondri gelen etkileri ortadan kaldırmak için SR-tüketen bir çözüm bulunur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Mediatech	10-040-CV
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
DMEM	Mediatech	10-013-CV
Glass Bottom Dish	MatTek	P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	-20 °C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO
Fluo-5N AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F14204	-20 °C, seal tight, protected from light
Rhod-5N	Invitrogen (Molecular Probes)	R14207	-20 °C, seal tight, protected from light
Quartz Cuvette	Starna Cells	3-Q-10
thapsigargin	Tocris	1138
2-Amin–thoxydiphenylborane (2-APB)	Tocris	1224
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Collagenase Type I	Sigma	C0130
Equipment:
A spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon arc lamp, computer-controlled high-speed random access monochromator, cuvette-based emission monochromator, Nikon TE-200 inverted fluorescence microscope, S Fluor 40x/1.30 oil objective, PMT detectors. Laser Scanning Confocal Microscope (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 inverted microscope, 60X objective (N.A. 1.4, oil). A stereomicroscope with a magnification power > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).