라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Summary

매장 운영하는 CA의 범위

Abstract

쇼핑몰 이전 capacitative 칼슘 ^{2 +} 항목을 되나, CA ^{2 +} 항목 (SOCE)를 운영, ⁺ 고갈 endoplasmic reticulum (ER) 또는 sarcoplasmic reticulum (SR) 칼슘 ^{2 +} 저장소를 보충하기 위해 세포에 세포 밖 칼슘 ^2의 유입을위한 단단히 규제 메커니즘입니다 ^1,2. 칼슘 ^{2 +} 유비 쿼터스 초 메신저이기 때문에, 그 SOCE가 증식, apoptosis, 유전자 전사 및 운동성 포함한 세포 프로세스 다양한 중요한 역할을 담당 볼 놀라운 일이 아닙니다. 상피 세포와 골격 근육을 포함한 거의 모든 세포 유형에서 자사의 광범위한 발생으로 인해,이 통로가 큰 관심 ^3,4을 받았습니다. 그러나, 다른 세포 유형 및 생리적 기능에 SOCE 특징 이질 아직도 ^5-7 해제되지 않습니다.

SOCE의 기능적 채널 속성이 생에 대한 지식의 큰 몸 반면, 패치 - 클램프 연구에 의해 밝혀하실 수 있습니다의 경로가 있기 때문에 높은 처리량 검사를위한 편리 성과 타당성의 형광 기반의 세포내 칼슘 ^{2 +} 측정하여 얻고있다. 이 보고서의 목적은 단일층 세포, 정지 세포와 근육 섬유 ^5,8-10의 SOCE의 활성을 측정하기 위하여 몇 가지 형광 기반의 방법을 요약하라는 것입니다. 가장 일반적으로 이러한 형광 방법 중 하나를 사용하는 직접 세포내 칼슘 ^2의 역학을 모니터 ⁺ F를 _340nm와 ratiometric 칼슘 ^{2 +} 지표 Fura-2의 F _380nm (발광 파장에 대한 510 nm의)의 비율을 사용하고 있습니다. 세포내 칼슘 ^{2 +} 릴리스 및 CA ^2에서 단방향 SOCE의 활동을 분리하려면 ⁺ 압출는 MN ^{2 +} 담금질 분석이 자주 사용됩니다. MN ^{2 +는} 그 표면 막 압출 공정이나 ^칼슘이에 의해 응급실로 이해를 안타 중에 SOCE 통해 세포에 침투 수 있도록 알려져있다 ⁺ 매우 높은 친화도 재치로 인해 펌프는H Fura - 2. 따라서 ⁺ 세포에 세포 MN ^2의 항목에 의해 유도된 Fura-2 형광 담금질은 SOCE ⁹ 활동의 측정을 나타냅니다. Ratiometric 측정 및 ^MN이 담금질의 assays는 세포 인구 모드에서 단일 세포를 시각화하는 현미경 기반 시스템의 cuvette 기반 spectrofluorometer 수행할 수 있습니다. 단일 세포 측정의 장점은 유전자 조작에 노출 개별 세포가 유전자 변형 또는 변이되는 세포의 연구를 수 있도록 GFP 혹은 RFP 기자를 사용하여 선택할 수있다는 것입니다. 구조적으로 전문 골격근의 SOCE의 spatiotemporal 특성은 동시에이 낮은 친화력 칼슘 ^2의 형광을 모니터하여 피부 근육 섬유에서 얻을 수 SR과 이러한 Fluo-5N과 같은 근육 섬유의 특정 구획, 타겟으로 ⁺ 지표로드 - 가로 tubules ^{9,11,12에서} 5N.

Protocol

1. 칼슘 ^{2 +} 각각의 세포에 대한 측정을 세포내

1. KYSE-150, 인간의 식도 편평 세포 암종 (ECSS)은 셀 라인은 37에서 5 % CO ₂ 분위기에서 배양해있다 ° C 5퍼센트 태아 소 혈청을 포함하는 혼합 RPMI 1640/Ham의 F-12 배지 (1:1) 인치
2. KYSE-150 세포 plasmids으로 transfected되는 중 Orai1 또는 불 가능한 시퀀스에 대해 구체적으로 shRNA를 포함. plasmids은 또한 별도의 프로 모터에 의해 구동되는 기자와 같은 유전자 인코딩 적색 형광 단백질 (RFP)에 포함되어 있습니다.
3. 세포는 48 시간 (제 1.5 커버 유리, MatTek, MA) 유리 바닥 접시에 재배하고 있습니다.
4. 매체를 제거하고 균형 잡힌 소금 용액 (BSS) (140 MM NaCl, KCl 2.8 밀리미터, 2 밀리미터 CaCl _{2, 2} 밀리미터 MgCl _2, 10 밀리미터 HEPES, 산도 7.2)로 세포를 씻어.
5. 그릇에 2 μm의 Fura-2 아세 톡시 메틸 에스테르 (분자 프로브)를 포함하는 하나 ML BSS 솔루션을 추가하고 prote하기 위해 호일로 전체 요리를 싸다빛과 중부 표준시.
6. 37 ° C에서 40 분 대한 세포를 부화 후 에스테르 가수 분해 완료할 수 있도록 상온에서 추가로 15 분 동안 그들을 둡니다. 두번 BSS와 세포를 씻으십시오.
7. 510 nm의 350과 390 nm의 및 배출에 여기 파장으로 PTI spectrofluorometer에 연결되어 니콘 TE200 거꾸로 현미경의 무대에서 접시를 탑재합니다. 사용되는 정확한 여기 파장이 약간 각 개별 시스템의 광학에 따라 달라질 수 있습니다. 동적 최고의 비율을 가진 두 파장은 칼슘 ^{2 +} 0 ~ 39.8 μm의 (또는 Fura-2 형광이 포화되는에서 높은 농도)에 이르기까지를 포함하는 솔루션에 Fura-2 소금으로 스캔 여기 스펙트럼에 따라 결정됩니다.
8. 칼슘 ^{2 +} (2 ㎜), EGTA (0.5 ㎜), EGTA-TG (thapsigargin, 5 μm의), CA ^{2 +-2-지명수배} (SOCE 억제제, 75 : BSS 4 가지 솔루션 비중 재관류 시스템을 설정 μm의). 컴퓨터 제어 자동화 perfusi에 대한 시스템도 사용할 수 있습니다.
9. 시각화 모드에서 RFP를 표현하는 세포를 선택합니다.
10. 끝이 45도 각도로 오른쪽의 관심 영역 위에까지 10 배 배율에서 관류 시스템의 오프닝 팁을 놓습니다.
11. 동시 형광 신호 F _350nm와 F _390nm를 기록합니다. 비율 (F _350nm / F _390nm)은 세 번째 창에 표시됩니다. , EGTA, 칼슘 ^{2 +,} EGTA-TG, 칼슘 ^{2 +,} 칼슘 ^{2 +-2-지명수배} 칼슘 ^{2 +} : 다음과 같은 순서로 관류 솔루션을 변경합니다.

위의 프로토콜은 ⁺ 세포 현탁액 시스템에서 세포 내 칼슘 ^2의 측정을 위해 수정할 수 있습니다.

12. 상기와 같은 문화를 조건으로 T25 플라스크 문화 KYSE-150 세포.
13. 세포가 90 % 합류점에 도달하면 미디어를 제거하고 BSS 솔루션 세포 린스.
14. 2 μm의 Fura-2 AM 및 부화를 포함하는 2.5 ML BSS 솔루션 추가37 40 분 용 전지 ° C는 deesterification으로 따라갔다.
15. 세포 분리 ° C까지 BSS를 제거, 37에서 술병과 부화로 2.5 ML의 트립신을 추가합니다. 그런 다음 trypsinization를 중지하고 5 분 동안 800 rpm으로 원심 분리하여 세포를 수확하기 위해 2.5 ML 문화 매체를 추가하십시오.
16. 원심 분리하여 배지로 세포를 한 번 더 씻어 및 BSS 솔루션으로 세포 '펠릿 (2 MM CaCl ₂ 이외없이, CA ^{2 +} μm의 범위를 포함) 다시 중지되고 hematometer를 사용하여 셀 번호를 계산합니다.
17. 석영 cuvette (10mm, Starna 셀)에 ~ 10 ⁶ 세포를 추가하고 BSS 2 ML에 볼륨을 작성하십시오.
18. spectrofluorometer로 cuvette을 (자석 막대와 교반) 놓습니다.
19. 동시에 510 nm의에서 방출 파장과 형광 신호 F _340nm와 F _380nm를 기록합니다. 실행하는 프로토콜입니다 : 1 μl thapsigargin의 BSS, 0.5 μl EGTA (0.25 M 주식)의 또한이 외에도(TG, 10 MM 주식), 4 μl 칼슘 ^{2 +} (1 M 주식)의 추가.

2. 교양 세포에서 MN 담금질 분석

1. 여기 파장은 다양한 카 ^2를 포함하는 솔루션에 Fura-2의 스캔 수행 isosbestic 지점으로 칼슘 농도 독립적인 파장을 결정하는 0에서 39.8 μm의에 이르기까지 ⁺ 농도. 보통 isosbestic 지점은 360 nm의 혹은 주변입니다.
2. KYSE-150 세포는 유리 바닥 접시에 배양해 및 Fura-2 오전에로드됩니다.
3. 5 가지 BSS 솔루션 관류 시스템 설정 : 칼슘 ^{2 +} (2 밀리), EGTA / TG (각각 0.5 MM 및 5 μm의), MN ^{2 +} (0.5 MM, EGTA이나 칼슘 ^{2 +의} 추가없이도 무료로 포함하는 칼슘 ⁺ μm의 범위에서) ^2, MN ^{2 +} / 2 - 수배 (75 μm의), EGTA / 트리톤 X-100 (0.1 %).
4. 현미경의 무대에서 접시를 탑재하고 510에서 360 nm의 여기에서 파장과 390 nm의 및 방사로 "여기 비율"모드를 선택NM.
5. 동시에 비율과 F _{360nm와 390nm F가} (F _360nm / F _390nm) 세 번째 창에 표시되는 형광 신호를 기록합니다. 실행하는 프로토콜은 다음과 같습니다 칼슘 ^{2 +} 1 분 동안 MN ^{2 +} 30을위한 초, 10 분, 대한 EGTA / TG MN ^{2 + 2} 분, EGTA-트리톤 X-100 (0.1 %) 1 분 동안 형광을 안정화 배경 독서를 구하십시오. MN ^{2 +} / 2 - 수배 솔루션은 ⁺ MN ^{2 +} 항목 SOCE 경로를 통해 나타냅니다 폐지 형광 담금질을 조사하는 대신 MN ² 사용될 수 있습니다.

3. 근육 세포에있는 MN 담금질 분석

1. C2C12, 마우스 myogenic 셀 라인은 10 % 태아 소 혈청, 10 % 말 혈청을 포함한 DMEM 배지에서 37 ° C에서 5 % CO ₂ 분위기에서 유리 바닥 요리를 배양해 있습니다.
2. 세포가 합류에 도달 후, 배지는 (제거 태아 소 혈청 및 reduc 차별화 매체로 변경됩니다2.5 %로 전자는 말 혈청). C2C12 myoblasts는 4 일 후에 myotubes로 구분됩니다.
3. 5 μm의의 최종 농도 Fura-2가 아니라 1.4-1.6에서 설명 어쩌면 함께 C2C12 myotubes을로드합니다.
4. 근육의 수축과 그들에 의한 모션 유물을 억제하고 실험을 시작하기 전에 15 분 있도록 20 μm의 N-벤질-P-톨루엔 sulphonamide (BTS)의 최종 농도를 추가합니다.
5. PTI 장치에 연결된 현미경의 무대에서 접시를 탑재하고 관류 시스템에 다음과 같은 BSS 솔루션을로드 : 2 카 ^{2 +} (2 ㎜), 0 칼슘 ^{2 +,} MN ^{2 +} (0.5 ㎜), MN ^{2 +} / TG (0.5 MM, 20 μm의, 각각).
6. 위에서 설명한대로 관류 시스템을 설정합니다.
7. 동시에 세 번째 창에 표시되는 비율 (F _360nm / F _390nm)로 형광 신호 F _360nm와 F _390nm를 기록합니다. 실행하는 프로토콜입니다 : 2 ⁺ 1 분, 0 칼슘 ^{2 +} 1 분 층에 ^칼슘이멀리 ush 칼슘 ^{2 +,} MN ^{2 +} 0.5 분, MN ² 10 분, 그리고 MN ^{2 +} / TG ⁺ / EGTA - 트리톤 X-100 (0.1 %).

4. 피부 근육 섬유의 Spatially과 temporally 해결 SOCE

1. 다음과 같은 솔루션을 준비합니다.
   Isotonic Tyrode 완충액 : 140 MM NaCl, 5 밀리미터 KCl, 10 MM HEPES, 2 밀리미터 MgCl _2, 2.5 MM CaCl _2, 산도 7.2, 290 mosm
   문화 매체 : 2 % 목마 혈청 및 1% 페니실린과 스트렙토 마이신과 DMEM
   해결책 # 1 씻으 : 109.6 MM K-글루 탐 산염을, 2 MM EGTA - 코이, 6.7 밀리미터 MgCl _{2, 2} 밀리미터 ATP, 6 밀리미터 크레아틴 인산 (CP), 20 MM N, N-비스 (2 - 히드록시 에틸) -2 - aminoethanesulfonic 산성 (BES) - 코이, 산도 7.0
   140 MM K-글루 탐 산염, 5 MM EGTA - 코이 6.5 밀리미터 MgCl _{2, 2} 밀리미터 ATP, 6 MM CP, 20 MM BES-코이, 산도 7.0 : 솔루션 # 2 씻으십시오
   140 MM K-글루 탐 산염 6.5 밀리미터 MgCl _{2, 2} 밀리미터 ATP, 6 MM CP, 20 MM BES-코이, 산도 7.0 : 솔루션을 Skinning
   TT-로딩해결책 : 90.6 MM K-글루 탐 산염, 18 MM 나 - 글루 탐 산염, 0.55 MM CaCl _{2, 2} MM EGTA - 코이, 6.7 밀리미터 MgCl _2, 5.4 밀리미터 ATP, 15 MM CP, 0.0025 MG / ML의 크레아틴의 키나제 (CK), 20 MM BES-코이, 5 μm의 제품 카보닐 청산 가리 P-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), 산도 7.0, PCA 7.0
   SR로드 솔루션 : 107.8 MM K-글루 탐 산염, 0.98 MM CaCl _{2, 2} MM EGTA - 코이, 6.6 밀리미터 MgCl _2, 5.4 밀리미터 ATP, 15 MM CP, 0.0025 밀리그램 / ML CK, 20 MM BES-코이, 5 μm의 FCCP, 산도 7.0, PCA 6.6
   SR 파괴 해결책 : 100 MM K-글루 탐 산염, 40 MM 나 - 글루 탐 산염, 10 MM EGTA - 코이, 10 MM 1,2 - 비스 (O-aminophenoxy) 에탄-N, N, N ', N'-tetraacetic 산 (BAPTA ), 0.35 밀리미터 MgCl _2, 0.5 밀리미터 ATP, 1 ㎜ CP, 20 MM BES-코이, 5 μm의 FCCP, 산도 7.0. 25 MM caffeine/20 μm의 thapsigargin (TG)는 실험 전에 추가됩니다.
2. 신근 digitorum longus의 (편집 판단리스트) 근육 해부하려면 먼저 생쥐를 버리고, 수평 위치에 다리를 묶은 후 절단, 최대 무릎 발목 영역에서 피부를 제거조직의 외면 근육층은 편집 판단리스트를 노출하고, 그대로 편집 판단리스트 근육을 풀어 위턱과 아래턱에 힘줄을 모두 도려 내야, 그것은 가능한 한 힘줄을 유지하는 것이 중요합니다. 편집 판단리스트는 어떤 수축을 방지하려면 0 칼슘 ^{2 +와} 0.1 밀리미터 EGTA을 포함 Tyrode 용액으로 전송됩니다.
3. stereomicroscope에서 낮은 삽입 힘줄을 보유하기 위해 두 족집게를 사용하여 두 묶음으로 편집 판단리스트 근육을 나누었습니다. 4 그리고 8 번들을 얻는 과정을 반복합니다. 이 힘줄이 과정의 끝에 8 번들 각각에 대해 남아있는 것이 중요합니다. 그들은 어떤 번들에서 분실하는 경우, 그들을 버리고.
4. stereomicroscope에서 각 편집 판단리스트 번들 스트립은 3까지 모두 힘줄에 griped 조심스럽게 뻗어있다 ~ 4 구분된 단일 근육 섬유는 양쪽에 힘줄이있는 그대로 남아 있습니다.
5. 유리 하단 요리 중간에 ⁺ 무료 tyrode 버퍼가 바로 접시에 편집 판단리스트 스트립을 바칠 ^칼슘이 1 방울을 넣고 빠르게 가능 한한의를 제거솔루션은 다음 물 모성 스카치 테이프 및 테이프 확인을 사용하여 두 힘줄 다운 테이프가 꽉이다. 0 칼슘 ^{2 +} 솔루션 후 2.5 밀리미터 칼슘 ^{2 +} 용액 2 배와 먼저 섬유를 씻으십시오. 섬유 하이퍼 계약 및 손상이 발견되면 섬유를 버리고.
6. 필요한 경우, 섬유는 유전 조작을 허용, 96 시간에 배양해 수 있습니다. 전체 문화 매체와 섬유 3 회 씻고 접시에 두 ML 매체 5 % CO _2와 37 ° C 배양기에서 장소를 추가합니다. 각 실험 전에 근육 섬유를 검토하고 맑은 줄무늬없는 사람이나 오염의 징후가있는, 또는 그러한 sarcolemmal 멤브레인의 contracture와 같은 손상의 징후가있는 버리고. 좋은 섬유 KCl, 전기 자극과 카페인 자극에 반응한다.
7. 단일 근육 섬유 세척 용액 # 1 3 회 씻어 및 ⁺ 5 분, 500 μm의로드-5N과 0.5 밀리미터 칼슘 ² 세포내 같은 skinning 솔루션 목욕을하고 있습니다.
<리> ⁺ TT에 두 번 껍질 섬유를 씻어 자동으로 봉인과 칼슘 ^2로드-5N 복합 잡으 가로 tubules (TT)을있게 stereomicroscope 아래 섬유 피부에 기계적으로, 핀 홀더에 부착된 텅스텐 바늘을 사용하여 해결 방법 # 2 세정과. 세포의 너비가 이하보다 25 %가 skinning 과정에서 제거되면 기계적 skinning 프로세스가 최적입니다.
8. SR을로드하려면 피부 섬유 Fluo-5N 허용 추가 30 분 동안 세척 용액 # 2 및 부화를 사용하여 광범위한 세차장 다음, 실온에서 1 H를 위해 오전 20 μm의를 포함하는 skinning 솔루션으로 incubated되어 드 에스테르화 완료 염료.
9. 30 분 후 피부 섬유 공촛점 현미경 60X 목적하에 시각입니다. 형광 이미지는 해당 염료 (; Fluo-5N 용 530-560 nm의에서 488 nm의 및 방출에 여기 543 nm의 및로드-5N에 대한 570 nm의 이상 방출의 여진)의 파장에서 빛을 찾았습니다. Regi관심있는 기능은 (ROIs) 각 염료로드 영역에 대해 선택됩니다.
10. 실험 프로토콜은 다음과 같습니다 : 400-750의 SR 칼슘 ^{2 +} 저장소를 고갈하는 120 초, SR-고갈 솔루션 120 초, SR-로드 솔루션 TT-로드 솔루션입니다. 이 과정에서로드-5N 강도의 변화 (TT 칼슘 ^{2 +)} 및 Fluo-5N 강도 (SR 칼슘 ^{2 +)은} TT와 SR의 상대적 형광 변화 시간 코스 결정을 만들고, 기록됩니다. 여러 섬유의 형광 강도의 평균 값은 추가로 분석된다. TT / SR-로드의 끝 부분에 최대한의 하중 강도는 100 %로 정규화됩니다.

5. 대표 결과

우리는 세포내 칼슘 ^2를 사용 KYSE-150 세포에 SOCE 활동을 검사 ⁺ 측정 (그림 2.). 기자로 RFP를 사용하여 우리가 orai1로부터 플라스미드 포함하는 특정 shRNA으로 transfected 개별 셀을 선택할 수도 유전자가 SOCE C를 인코딩hannel. 스크램블 shRNA (블랙 추적), 감소 SOCE 활동 (적색 성분)의 Orai1 단백질 결과 쓰러뜨린.를 포함 plasmids으로 transfected 세포와 비교할 때

KYSE-150 세포에서 SOCE 또한 MN ^{2 +} 담금질 분석 (그림 3.)로 확정되었다. 360 NM의 여기 파장은 형광이 칼슘 ^{2 +} 농도의 독립 Fura-2의 isosbestic 지점을보고합니다. TG 완전히 응급실 칼슘 ^2를 고갈 후 ⁺ 매장, MN ² 재관류 ^+는 상당한 형광 감소 결과. 전체 SOCE 활동이 얕은 경사의 의미 동안 덜 활성 SOCE,보다 적극적 SOCE를 나타내는 험한 경사와 Fura-2 형광 강도의 감소 속도로 측정 할 수 있습니다. 2 - 지명수배 취급 세포의 형광 감소의 기울기는 SOCE 활동이 화합물에 의해 차단된 표시하는 얕은 것으로 나타났다. MN^{2 +} 담금질 요금은 담금질이 포화하지 않고 선형 범위 안에 여전히 남아 있었 초기 십초의 기록에서 결정됩니다.

유사한 MN ^{2 +} 담금질 분석은 근육 (그림 4.)에서 수행되었다. 이 경우 MN ^{2 +는} TG와 함께 적용되었다. TG는 SR 칼슘 ^{2 +} 저장소를 파괴하는 동안 그것의 최대한의 속도를 도달할 때까지, 형광 담금질의 기울기가 점차 바뀌었습니다. sigmoidal 곡선은 이러한 실험 조건에서 SOCE의 등급 활성화를 나타냅니다.

문화의 건강한 그대로 하나의 근육 섬유가 명확하고 균일한 줄무늬, contaminations 흔적 및 수축 유발 손상의 흔적을 보여주었다. 이러한 섬유는 전기 자극이나 depolarizing 솔루션에 대한 응답으로 계약을 체결할 수 있었다. 공촛점 이미징에서 TT 구획의로드-5N 염료의 피부를 섬유 트래핑은 (visu 특성 포유류의 이중어 패턴을 보여주었다) 빨간색 채널에 alized. Fluo-5N 오전과 SR의로드 후, 전형적인 첨부터 SR 패턴 (녹색 채널)을 표시했습니다. TT / SR로드 솔루션 피부 섬유 재관류 후,로드-5N과 Fluo-5N 모두의 형광 강도는 증가; SR 고갈 솔루션 재관류시, SR 구획 및 TT 구획의 형광 레벨 꽉 커플링을 나타내는 감소하기 시작 SR 칼슘 ² 사이 각각 ⁺ 상점 고갈과 SOCE 활성화, (그림 5.).

1 그림. 의 활성화 저장소로 작동하는 칼슘 ^{2 +} 항목 (SOCE). Orai1, 단위를 형성 채널 기공은, 플라즈마 막 (PM) 및 STIM1, 칼슘 ^{2 +} 센서에 위치해 있습니다 endoplasmic 또는 sarcoplasmic reticulum (ER /에 있습니다 SR) 세포막. ER / SR 칼슘 ^{2 +} 매장 인해 응급실 / SR 칼슘 ^{2 +} 펌프 (SERC의 차단을하거나 감소하는 경우) 또는 칼슘 ² IP ₃ 수용체 또는 ryanodine 수용체를 통해 ⁺ 릴리스 STIM1가 활성화됩니다. 활성화 STIM1 분자 패치를 형성하고 더 SOCE의 활성화를 선도 Orai1의 집계를 유발.

그림 2. ⁺ KYSE-150 세포에서 세포 내 칼슘 ² 측정. 0 CA에 ^{2 +} (0.5 MM EGTA) 2 밀리미터 칼슘 ^2에서 세포외 솔루션의 교류 ⁺ 세포내 칼슘 ^{2 +의} 어떤 변화를 유도하지 않았다. 0 칼슘 ^{2 +} 목욕 솔루션 유도 패시브 응급실 칼슘 ^{2 +} 릴리스의 TG 5 μm의. 응급실에 ^칼슘이 후 ⁺ 상점은 세포외 칼슘 ^{2 +} (2 ㎜)가 추가되는가 SOCE 억제제에 의해 차단됩니다 SOCE를 통해 지속적인 세포내 칼슘 ^{2 +} 고도를 활성화 (> 10 분) 소진되었다, 예를 들어 skf-96365 2 - 지명수배 (데이터가 표시되지 않음). 에 대해 구체적으로 shRNA를 포함 plasmids으로 transfected 세포orai1 (빨간색)은 출격 순서 (블랙)로 transfected 세포보다 훨씬 줄어 SOCE을 보여주었다.

그림 3. ^MN이 KYSE-150 세포에서 SOCE의 ⁺ 담금질 분석. MN ^{2 +} (0.5 ㎜)에 의해 Fura-2 형광 담금질은 Fura-2 (360 NM)의 ⁺ 독립적인 여기 파장 ^{칼슘이에서} 측정되었다. 세포가 완전히 응급실 칼슘 ^{2 +} 저장소를 고갈하는 데 10 분 TG 5 μm의로 치료했다. ^MN이시 Fura-2 형광의 감쇠 기울기 ^+는 또한 (대쉬 라인, 처음 10 초 이내)은 단위 시간 당 형광의 % 감소 (100 % 등 초기 값)으로 표현되었다 SOCE의 활성을 나타낸다. maximally 침묵 형광 신호로 세포를 lysing하여 실험의 끝에 설립된 0.1 % 트리톤 X-100 (0 % 등). 2 - 수배 (75 μm의)로 치료 세포가 얕은을 증명기울기, 제안 SOCE는 KYSE-150 세포에서이 화합물에 의해 차단됩니다.

4 그림. TG는 SR 칼슘 ^{2 +} 저장소를 파괴하는 동안 MN ^2로 밝혀 근육 세포의 SOCE의 등급 정품 인증 ⁺ 담금질 분석가. SOCE의 활성화가 등록 수 있습니다. MN ^{2 +} (0.5mM)와 TG (20 μm의)의 동시 응용 프로그램은 세포 내 Fura-2 초기 MN ^2에서 별개였다 형광 (빠른 담금질 지점을 표시하는 시안의 대쉬 라인) ⁺ 담금질의 등급과 sigmoidal 감소를 유도 요금 (파란색 대시 라인). MN ^{2 +} 담금질 슬로프는 SOCE가 저해되었다 제안, 거의 2 수배 (75 μm의) 취급 세포의 기저 레벨과 동일하게 남아 있어요.

그림 5. Spatially과 temporally 피부 근육 섬유에 SOCE 해결. () RHOD-5N 소금은 TT와 Fluo-5N 오전에로드되었습니다가 SR에로드되었습니다. (B) ⁺ 고갈 솔루션 칼슘 ² 적용 후, TT와 SR의 구획 모두에서 형광이 감소했다. Fluo-5N 형광의 손실은 급속히 ⁺ 내용 및로드-5N 형광의 손실이 SOCE의 활성화를 제안 SR 칼슘 ^2를 발표 지적했다.

Discussion

칼슘 ^{2 +} 바인딩 및 CA ^{2 +} 무료 Fura-2의 여기 파장은 각각 340 nm의 380 nm의 있지만, CA ² Fura-2의 최고 비율 동적 범위는 ⁺ 농도 측정은 특히 다른 파장에서 발생할 수 현미경 시스템. 파장에서의 이러한 변화는 일반적으로 다양한 광학 부품의 추가와 광학 경로의 변화로 인해 수 있습니다. 본 연구에서는 Fura-2의 여기 파장은 Fura-2 형광 분광 분석을 수행하여 350 nm의 및 390 nm의로 결정됩니다.

를 포함한 여러 소스의 균형에서 cytosol 결과에서 세포 내 칼슘 ^{2 +} 수준의 세포내 칼슘 ^{2 +} 릴리스, 세포외 칼슘 ^{2 +} 항목뿐만 아니라 응급실과 플라즈마 막에서 칼슘 ^{2 +} 배제 메커니즘. 세포내 칼슘 ^{2 +} 릴리스 및 CA ^{2 +} extr에서 단방향 SOC-매개 칼슘 ^{2 +} 유입을 분리하려면usion는 MN ^{2 +} 담금질 분석을 사용할 수 있습니다. MN ^{2 +는} SOCE 통해 세포에 침투 수 있도록 알려져 있지만 표면 막 압출 또는 ^칼슘이에 의해 응급실로 이해 ⁺ 펌프를 안타입니다. 따라서 형광 담금질은 SOCE의 활성화 정도를 예상 세포로 단방향 MN ^{2 +} 유량의 측정을 나타냅니다. MN ^{2 +} 담금질 분석 같은 파장에서 isosbestic 시점 공연 Fura-2 형광 강도는 칼슘 ^{2 +} 농도에 독립적입니다.합니다 각 시스템에 대한 isosbestic 포인트는 스펙트럼 스캔에 의해 결정되어야한다. 또한, MN ^{2 +} 담금질은 최종 값이 칼슘 ^{2 +} 농도 ¹³ 독립이라는 같은 방법으로 두 개의 파장에서 빛을 조정 형광에 의해 기록될 수 있습니다.

골격 근육의 SOCE의 활동 공간과 시간적 정보를 얻으려면 우리는 동시 measureme 수 있도록 이중 염색 방법을, 고용SOCE 활동 및 SR ^칼슘이 피부 성인 포유류의 편집 판단리스트 근육 섬유에 ⁺ 컨텐츠 NT. SR 칼슘 ^2의 변화 사이의 상관 관계는 ⁺ 내용 및 SOCE 활동은 SR 칼슘 ^2의 고갈 ⁺ 스토리지로 SOCE 활성화의 한계와 감도를 나타내는 꾸몄다 수 있습니다. TT-로드 솔루션은 또한 칼슘 ² T-tubules을로드하는 데 최적화되어 있습니다 ^+와 T-tubules 및 SR-로딩 솔루션의 마중물을 위해 최대한의 SR 칼슘 ^{2 +} 로딩을 촉진하고 추가로 T-tubules를 로드할 수 있도록 설계되었습니다 ~ 500 μm의 칼슘 ^{2 +.} FCCP는 TT / SR-로딩 솔루션과 mitochondria의 효과를 제거하는 SR-파괴 솔루션에 포함되어 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Mediatech	10-040-CV
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
DMEM	Mediatech	10-013-CV
Glass Bottom Dish	MatTek	P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	-20 °C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO
Fluo-5N AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F14204	-20 °C, seal tight, protected from light
Rhod-5N	Invitrogen (Molecular Probes)	R14207	-20 °C, seal tight, protected from light
Quartz Cuvette	Starna Cells	3-Q-10
thapsigargin	Tocris	1138
2-Amin–thoxydiphenylborane (2-APB)	Tocris	1224
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Collagenase Type I	Sigma	C0130
Equipment:
A spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon arc lamp, computer-controlled high-speed random access monochromator, cuvette-based emission monochromator, Nikon TE-200 inverted fluorescence microscope, S Fluor 40x/1.30 oil objective, PMT detectors. Laser Scanning Confocal Microscope (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 inverted microscope, 60X objective (N.A. 1.4, oil). A stereomicroscope with a magnification power > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).