Summary
تعيش خلية من الخلايا بوساطة التصوير كاسباس 3 في خلد الثقافات الخلية N19 - oligodendrocyte باستخدام
Abstract
يمكن للنظام العصبي المركزي التجربة عددا من الضغوط العصبية والشتائم ، والذي يمكن أن يكون لها آثار سلبية عديدة تؤدي في نهاية المطاف الى خفض في عدد السكان وظيفة الخلايا العصبية. ويمكن إطلاق الجزيئات التالفة المحاوير مثير بما البوتاسيوم أو الغلوتامات في المصفوفة خارج الخلية ، والتي بدورها ، يمكن أن تنتج المزيد من الاهانة والضرر لخلايا الدبقية النجمية بما في ذلك دعم وoligodendrocytes 8 و 16. إذا استمرت الإساءة ، وسوف تخضع خلايا موت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج) ، الذي ينظم وتفعيلها من خلال عدد من شلالات راسخة نقل الإشارة 14. يمكن أن موت الخلايا المبرمج ونخر الأنسجة تحدث بعد إصابات في الدماغ ، نقص التروية الدماغية ، والنوبات. والمثال الكلاسيكي لتنظيم أفكارك هي السيستين عائلة تعتمد على البروتياز - اسبارتاتي الموجهة ، أو caspases. كما تم تفعيلها بما البروتياز caspases متورطين في موت الخلايا العصبية في استجابة لالمزمنةالأمراض التنكسية بما في ذلك مرض الزهايمر ، وهنتنغتون ، والتصلب المتعدد 4 ، 14 ، 3 ، 11 ، 7.
في هذا البروتوكول وصفنا استخدام الركيزة NucView كاسباس 3 488 لقياس نسبة موت الخلايا المبرمج 3 كاسباس توسط في خلد N19 - oligodendrocyte الثقافات الخلية (OLG) 15 ، 5 ، بعد التعرض لضغوط خارج الخلية مختلفة مثل تركيزات عالية من البوتاسيوم أو الغلوتامات. تم الحصول على مشروط ، خلدت خط الخلية N19 - OLG (الذي يمثل السلف O2A) من الدكتور أنتوني Campagnoni (UCLA سيميل معهد العلوم العصبية) 15 ، 5 ، وكان يستخدم في السابق لدراسة الآليات الجزيئية في التعبير الجيني الميلين ونقل الإشارة الرائدة لOLG التمايز (على سبيل المثال 6 ، 10). لقد تم العثور على هذا الخط الخلية لتكون قوية فيما يتعلق ترنسفكأيشن الخارجية مع البروتين الأساسي المايلين (MBP) يبني تنصهر فيها إما لطلب تقديم العروض أو GFP (أحمر أو أخضر بروتين فلوري) 13 ،12. هنا ، تم التعامل مع الثقافات الخلية N19 - OLG إما مع 80 ملم كلوريد البوتاسيوم أو الصوديوم الغلوتامات 100 ملم إلى محاكاة تسرب محواري في المصفوفة خارج الخلية للحث على موت الخلايا المبرمج 9. استخدمنا ثنائية وظيفية كاسباس 3 الركيزة التي تحتوي على (حمض الغلوتاميك - ASP - فال ASP) DEVD كاسباس 3 الوحيدات الاعتراف وصبغة الحمض النووي ملزم 2. الركيزة يدخل بسرعة السيتوبلازم حيث المشقوق من قبل الخلايا 3 caspase. يتم تحرير الصبغة ، NucView 488 و يدخل نواة الخلية حيث يربط الحمض النووي والأخضر في 488 نانومتر تتفلور ، مما يشير إلى موت الخلايا المبرمج. استخدام 488 NucView الركيزة - 3 caspase يسمح للخلية الحية التصوير في الوقت الحقيقي 1 و 10. في هذا الفيديو ، ونحن كذلك أن تصف وزراعة الخلايا ترنسفكأيشن من خلد N19 - OLG ، فضلا عن تقنيات التصوير الحية الخلية.
Protocol
1. ذوبان الجليد وخلايا التثقيف
- الحصول على مخزون من خلايا مجمدة N19 - oligodendroglial خلدت من مخازن طويلة الأمد النيتروجين السائل.
- قارورة تحتوي على خلايا تزج في حمام مائي 37 ° C حتى يتم إذابة تماما التعليق الخلية.
- إضافة 7 مل من DMEM (متوسطة Dulbecco والنسر التعديل) على درجة عالية من الجلوكوز تستكمل مع FBS 10 ٪ (مصل بقري جنيني) و 1 ٪ البنسلين / الستربتومايسين لوحة الثقافة الطول 10.
- إضافة خلية تعليق على لوحة قطرة من الحكمة ، وتستنهض الهمم بلطف والصخور لوحة بيتري لتفريق الخلايا بالتساوي.
- خلايا الثقافة في 34 درجة مئوية / 5 ٪ CO 2 الحاضنة.
- بعد 4 ساعات ، ووسائل الإعلام نضح من لوحات لإزالة أي DMSO المتبقية (ثنائي ميثيل sulphoxide) التي كانت تستخدم بوصفها cryoprotectant ، واستبدالها مع وسائط جديدة (7 مل DMEM عالية الجلوكوز وسائل الإعلام تستكمل مع FBS 10 ٪ و 1 ٪ البنسلين / الستربتومايسين) .
2. الركض الخلايا
- في 70-80 ٪التقاء (4-7 أيام النمو) ، نضح وسائل الاعلام من الخلايا.
- إضافة 1 مل من التربسين 0.25 ٪ لوحة. التربسين ماصة لفصل الخلايا (حوالي 5 دقائق).
- جعل التخفيفات الملائمة للظروف تجريبية وممر اضافي لوحة 10 سم للتجارب في المستقبل في مناطق ذات كثافة الخلية لا يقل عن 0.1 × 10 6 خلية / مل.
ملاحظة : يجب تمرير الخلايا الخاصة بك على الأقل مرتين بعد ذوبان الجليد قبل استخدامها لإجراء التجارب.
3. العد وطلاء الخلايا
- لوحة للخلايا الحية الخلية والتصوير ، ويعرض للتريبسين كما هو موضح سابقا.
- إزالة ما يقرب من 30 ميكروليتر من الخلايا والعد باستخدام haemocytometer.
- وضع علامة الزجاج المصقول في ساترة لوحة 6 جيدا. إضافة إلى الخلايا بشكل جيد في مناطق ذات كثافة تبلغ 0.1 X الخلايا 6 10 / مل في 2 مل من الفينول خالية من وسائل الإعلام عالية DMEM الجلوكوز ، على أن تستكمل مع FBS 10 ٪ و 1 ٪ البنسلين / الستربتومايسين ، في 34 درجة مئوية / 5 ٪ CO 2.
- سماحالخلايا لتنمو بين عشية وضحاها (16-20 ساعة) في 34 درجة مئوية / 5 ٪ CO 2 قبل ترنسفكأيشن.
4. ترنسفكأيشن
- تجمع 100 مصل ميكرولتر خالية من وسائل الإعلام ، 0،5-4 ميكروغرام تنقية البلازميد الحمض النووي ، و 4 ميكرولتر FuGENE HD (روش). دوامة برفق لمزج.
- مرة أخرى لفترة وجيزة الدوامة ، والسماح للحمض النووي للمجمع لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ومن ثم إضافة خليط FuGENE HD الحمض النووي مباشرة إلى الخلايا المستزرعة. إمالة لوحة برفق لمزج.
- ثقافة الخلايا ل48 ساعة إضافية عند 34 درجة مئوية / 5 ٪ CO 2 قبل العلاج أو التجريب.
5. إعداد الخلايا لايف سيل التصوير (LCI)
- بدوره على Chamlide LCI الخلية الحية أداة تحكم مربع على الأقل قبل 1 ح تريد أن تبدأ تجربتك. مربع عنصر التحكم كما ينظم درجة الحرارة والرطوبة داخل Chamlide LCI ، وينظم تدفق ال 5 ٪ خلط ثاني أكسيد الكربون 2.
ملاحظة : من المستحسنبدوره على التحكم مربع تصل إلى 3 ساعات قبل بداية التجارب لضمان أن تصل إلى مرحلة بأكملها 34 درجة مئوية. وهذه الخطوة تقليل الانجراف التنسيق ، والذي كان سببه fluxulation والتمدد الحراري للمرحلة المعادن مع ارتفاع درجة الحرارة ، وخلال التصوير.
- العمل في غطاء تدفق ، رش الغرفة Chamlide ثقافة من نوع المغناطيسي ، وملاقط ، مع الايثانول 70 ٪ والسماح لهم الجافة لمدة 5 دقائق.
- إزالة الخلايا من الحاضنة وتأكيد أنهم يتمتعون بصحة جيدة. ينبغي أن تظهر ملتصقة جيدا وتنتشر على الزجاج مع ساترة العمليات الغشائية عديدة. الخلايا التي شددت من ترنسفكأيشن ليست مناسبة للتجريب ، وسيكون لها عدد محدود من عملية التمديد ، وغالبا ما يكون نواة غير منتظمة الشكل.
- إمالة لوحة 6 جيدا وإزالة ساترة مع ملاقط. المكان بسرعة الجانب الخلية ساترة يصل الى لوحة السفلي من الغرفة الثقافة. لا تسمح ساترة لتجف.
- نعلق الرئيسية المغناطيسيةجسد الثقافة الغرفة وإضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام من لوحة 6 - جيدا الأصلي على الجزء العلوي من ساترة. وإعادة استخدام هذه الوسائط خفض مقدار الضغط وضعت على خلايا الناجمة عن التغيرات البيئية ، ويمكن أيضا أن تكون مفيدة لتقييم العوامل التي تفرز خارج الخلية.
- وضع غطاء زجاجي على غرفة الثقافة.
- استخدام رش KimWipe مع الايثانول 70 ٪ لإزالة أي مواد متبقية من الجزء السفلي من ساترة ، التي من شأنها أن تتداخل مع المجهري.
- وضع الثقافة في غرفة لمدة 30 دقيقة 34 م / 5 ٪ CO 2 حاضنة درجة. وسوف تضمن هذه الخطوة أن الغرفة نفسها لارتفاع درجة حرارة 34 درجة مئوية للحد من التحول من المعدن ساترة كما تسخن.
6. إعدادات المجهر
تم الحصول على الصور هنا باستخدام مجهر لايكا DMIRE2 المقلوب مع عدسة تتابع العرف والإسكان الانبعاثات عجلة تصفية لتحميل خرطوشة من العجلات متعددة (النصاب القانوني تكنولوجيز ، Guelph ، ON).
- Brightfield -- تعيين مصباح إلى 2.5 V والتعرض إلى 240 مللي الوقت.
- بروتين أحمر فلوري (RFP) -- وضعت في كسب 140 ل 200 مللي.
- البروتين الأخضر نيون (GFP) -- وضعت في كسب 140 ل 500 مللي.
- مجهر لدينا لديه مصباح عكس الضوء بدلا من قرص الغزل للتحكم في كمية الضوء المتاحة للخلايا. نركض تجاربنا مع النور في 90 ٪ من كثافة مصباح الأقصى.
7. علاج الخلايا مع محرضات موت الخلايا المبرمج وNucView 488 كاسباس 3 الركيزة
- من المهم أن تعد مخزونات كبيرة من محرضات موت الخلايا المبرمج في وقت سابق وتجميدها في aliquots ، بحيث تركيزات ستكون متسقة بين التجارب.
- و488 NucView الركيزة حساس الضوء. إعداد aliquots من 15 ميكرولتر للحد من تجميد / الذوبان ، وتخزينها في أنابيب -20 درجة مئوية مغطاة بورق الألومنيوم. العمل مع إضاءة الغرفة المحيطة عند أدنى مستوى ممكن للحد من التعرض للNucView 488 الركيزة للضوء ، وقبل استخدامه.
- استرداد بسرعة من الغرفة الثقافة الحاضنة بحيث لا تتعرض الخلايا إلى انخفاض في درجات الحرارة. مكان الغرفة على غرفة الثقافة البيئية للمجهر ، واستخدام المشابك للحفاظ على ثقافة غرفة من التحرك. عند هذه النقطة يجب عليك أيضا تحت أضواء خافتة الغرفة.
- بدوره على 5 ٪ CO 2 خزان خلط مع منظم المزدوجة.
- باستخدام الهدف 10X ، والتركيز على إيجاد خلايا على شاشة الكمبيوتر باستخدام مشرق الميدان المجهري ملاحظة : كنت ترغب في استخدام أكبر الفتحة العددية على الهدف مع التكبير المطلوب للحد من التعرض الوقت.
- تسليم محرضات للموت الخلايا المبرمج للخلايا (في حالة البوتاسيوم لدينا 80 ملم أو 100 ملم الغلوتامات) ، يمكن استخدام إحدى الطرق التالية. سوف نستخدم تسليم البوتاسيوم 80 ملم وعلى سبيل المثال ، باستخدام بوكل حل باعتبارها تركز 10X في وسائل الإعلام ثقافتنا التقليدية.
- تبادل وسائل الاعلام بذ نضح بطيئة والمحلية :
-- استخدام مضخة تمعجية إلى وسائل الإعلام في غرفة تبادل الثقافة مع وسائل الإعلام الجديدة التي تحتوي على البوتاسيوم 80 ملم.
-- واحدة من نهاية الأنبوب تسليم 10 مل من مخزون من البوتاسيوم 80 ملم المذاب في الفينول DMEM خالية ، وعلى الطرف الآخر من الأنبوب وإزالة وسائل الاعلام من القاعة.
-- تحتاج ما لا يقل عن 10X تبادل وسائل الإعلام لضمان أن وسائل الإعلام ترك في الغرفة والتركيز الصحيح من البوتاسيوم.
-- بعد تبادل وسائل الإعلام ، إضافة 3 ميكروليتر من 488 الركيزة NucView إلى وسائل الإعلام في القاعة. ماصة إلى المزيج. - علاوة على ذلك مباشرة من 80 ملم K + و 488 NucView الركيزة لوسائل الاعلام في غرفة الثقافة :
-- تحضير محلول المخزون 10X 80 ملم من البوتاسيوم المذابة في الفينول خالية DMEM.
-- إضافة 3 ميكروليتر من 488 الركيزة NucView إلى 50 ميكرولتر من البوتاسيوم 10X 80 مم. ماصة إلى المزيج. إضافة إلى 500 DMEM الفينول خالية ميكرولتر في غرفة الثقافة.
ملاحظة : هذا الأسلوب هوالمفضل إذا كنت ترغب في الحفاظ على النمو أو تقييم أو غيرها من العوامل التي تفرز التي قد تكون موجودة في وسائل الاعلام الأصلي. لقد وجدنا أن 488 NucView ركيزة ثابتة في الثقافة خلية للتجارب دائم ما دامت 36 ساعة.
- تبادل وسائل الاعلام بذ نضح بطيئة والمحلية :
8. تعيش خلية التصوير
- انقر على القناة الحمراء لعرض الخلايا transfected.
- اختيار وتوفير ما يقرب من اثني عشر الإطارات حيث هناك خلايا transfected عدة ، وحفظ هذه "المرحلة XY نقاط". اعتمادا على مقدار ذاكرة الكمبيوتر ، قد تقتصر على عدد من النقاط المرحلة التي سوف تكون قادرة على الحصول عليها.
- لديك التقاط الصور المجهر (في القناة ، ومشرق الميدان الأحمر ، وقناة خضراء) في هذه المرحلة نقطة حفظ كل 6 دقائق.
- أي تلطيخ الخضراء التي هي واضحة خلال المراحل المبكرة من التجارب تشير إلى احتمال الخلايا التي تشهد بالفعل موت الخلايا المبرمج ، ويرجع ذلك عادة إلى ترنسفكأيشن و / أو الإجهاد البيئي. Apoptوسيتم الكشف عن عمليات التفتيش الموقعي نتيجة لعلاجات تجريبية في وقت لاحق timepoint في التجربة.
9. التحليل الإحصائي
لكل تجربة ، ونحن برنامج المجهر للحصول على نقاط XY متعددة لجمع بيانات مجموعة كبيرة بكفاءة. يتم تنفيذ كل تجربة مكررة أو في ثلاث نسخ ، ويتم تجميع البيانات من التجارب منفصلة أجريت على أيام مختلفة. من كل مجموعة البيانات ، ونحن نحلل ما يصل إلى 15 حقلا للعرض ومقارنة نسبة كاسباس السلبية الخلايا لكاسباس إيجابية الخلايا (العدد الكلي للخلايا في مجال الرؤية / العدد الكلي للكاسباس إيجابية الخلايا).
- يتم تجميع القياسات المسجلة من كل مجموعة البيانات إلى مجموعة أكبر العينة ، ويتم فيما بعد مقارنة مع بعضها البعض باستخدام جدول ANOVA (ع = 0.05). نظهر الأخطاء المعياري للمتوسط (SEM) من كل تجربة ، وقارن ثم الاختلاف في الوسائل عن طريق إجراء اختبار توكي يعني المقارنة (ع = 0.05) لتحديد WHICH العلاجات تختلف اختلافا كبيرا عن بعضها البعض.
10. ممثل النتائج
وقد وصفت لنا تجربة لتوضيح كيف أن 488 NucView الركيزة يمكن أن تشير إلى زيادة معدل موت الخلايا المبرمج من N19 - OLG الثقافات الخلية بعد العلاج مع تركيز البوتاسيوم خارج الخلية عالية. وكانت transfected N19 خلايا مع طلب تقديم العروض ، وعولج إما مع 3 ميكروليتر الركيزة 488 NucView (السيطرة) ، أو 3 ميكروليتر NucView الركيزة 488 و 80 ملم [K +] (العلاج). تم رصد الخلايا والصور تم الحصول عليها خلال دورة الساعة 12 ساعة ، وهو كاف لدراسة شملت الشتائم العصبية (الشكل 1A). في ظروف السيطرة ، فإننا لم نلاحظ كميات كبيرة من الخلايا مقارنة مع 80 ملم [K +] الثقافات المعالجة (تجزئته مربع) ، والذي أظهر حوالي 45 ٪ موت الخلية بعد 12 ساعة (الشكل 1B). إشارة خضراء الخلفية مراقبةد التحكم في ظروف تشير إلى الخلايا التي تمر موت الخلايا المبرمج دون إضافة البوتاسيوم خارج الخلية. لا شيء تقريبا من الخلايا في المعرض موت الخلايا المبرمج من قبل السيطرة التجربة المرة ح 12 نقطة ، رغم أنه في حالات أخرى قد تكون مطلوبة في تجارب لتشغيل لفترة أطول. تم الحصول على الصور باستخدام هدفا 10X. بار = 100 ميكرون.
الشكل 1. (أ) الوقت ح 12 تجربة مسار N19 الثقافات OLG 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن معربا عن RFP - MBP (أحمر قناة) جنبا إلى جنب مع 3 ميكروليتر من 488 الركيزة NucView (القناة الخضراء). عولجوا إما الثقافات مع التركيز النهائي من 80 مم [K +] (لوحات اليسار) ، أو أي علاج كعنصر تحكم (لوحات اليمين). صور تم الحصول عليها في فترات دقيقة 6 ، وتفعيل كبير من المشقوق كاسباس 3 (إشارة خضراء) ويمكن ملاحظةد في الثقافات تعامل مع 80 ملم [K +] داخل نواة الخلية (تجزئته مربع) مقارنة التجربة السيطرة عليها. (ب) النسبة المئوية للخلايا كاسباس 3 المشقوق (تحسب بقسمة مجموع عدد الخلايا في مجال الرأي إجمالي عدد كاسباس إيجابية الخلايا). في المقارنة للسيطرة على الأوضاع ، لاحظنا حوالي 45 ٪ موت الخلية التالية K + المعاملة من قبل 12 ساعة.
sVideo 1. ح 12 ألف مرة خلال تجربة ثقافات N19 OLG 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن معربا عن RFP - MBP (أحمر قناة) مع 3 ميكروليتر من 488 الركيزة NucView (قناة خضراء) ، جنبا إلى جنب مع صور مشرقة الميداني وطريقة ثلاثة الصور المدمجة ، وبعد العلاج مع 80 ملم [K +].
sVideo 2. ح 12 ألف مرة خلال تجربة ثقافات N19 OLG 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن معربا عن RFP - MBP (أحمر قناة) مع 3 ميكروليتر من 488 الركيزة NucView (قناة خضراء) ، جنبا إلى جنب مع مشرق الميدان ايماجوفاق وصورة الثلاثية المدمجة. تم تطبيق أي علاج لثقافات ويمكن رؤية N19 - OLGs المهاجرة من خلال حقل المجهر على النقيض من الثقافات الخلية تعامل مع 80 ملم [K +] (قارن مع sVideo 1).
Discussion
على الرغم من أن هذا ليس هو المنتج الوحيد fluorogenic المتاحة للكشف عن موت الخلايا المبرمج ، وهناك العديد من المزايا الهامة لاستخدام 488 NucView الركيزة. واحدة من الفوائد الرئيسية هي القدرة على متابعة موت الخلايا المبرمج في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي ، في حين أن معظم المنتجات البديلة تتطلب إما تحلل الخلية أو الفقراء نفاذية الخلية. وتشمل المزايا الأخرى للحساسية عالية كاسباس 3 الاعتراف ، وارتفاع نفاذية الخلية ، السمسة منخفضة ، وعدم التدخل في تطور الخلايا. الركيزة كما منخفضة مضان الخلفية حتى يتم ذلك المشقوق ويدخل النواة ، الذي يلغي مضان الخلفية. تسلسل كاسباس 3 الاعتراف يحتوي على 3 الشحنات السالبة وصبغ الحمض النووي ملزم واحد شحنة موجبة 2. وDEVD - NucView 488 جزيء وبالتالي تهمة صافية سلبية ، مما يحول دون تفعيل وملزمة للصباغة على الحمض النووي في الخلايا حيث caspase غير نشطة.
أماهمطلوب التناسق بين intaining التجارب لتكون قادرة على عقد مقارنات ذات مغزى بين مكررات. واحدة من المعالم الرئيسية للحفاظ على كثافة الثابت هو الخلية ، كما أنه يؤثر على معدل ترنسفكأيشن. الحصول على معدلات عالية في خلد ترنسفكأيشن N19 - OLG الثقافات الخلية هي أكثر صعوبة من غيرها مع خطوط الخلايا الشائعة مثل هيلا أو HEK293 ، وتعتمد بدرجة كبيرة على الكثافة ، وتجربتنا في 12 و 13. وقد تم الحصول على الكفاءات وسعنا ترنسفكأيشن لهذه الخلايا مع HD Fugene (روش) ، وعادة ما يقرب من 15 ٪ ، ولكن يمكن أن تصل إلى أكثر من 30 ٪ ، اعتمادا على بناء. سيكون حذرا العد الخلية المساعدات في الحصول على أسعار ترنسفكأيشن متناسقة. من المهم أيضا للكشف عن خلايا من علاجات مختلفة لنفس الدرجة من الإجهاد البيئي ، وبخاصة عندما قياس معدلات موت الخلايا المبرمج. على وجه التحديد ، وطول الفترة الزمنية التي يتعرض لها أكثر من الخلايا لالكواشف ترنسفكأيشن ، أو مقدار التعرض للضوء ، أهمية بيئية فاريABLES للنظر ، وينبغي أن تظل ثابتة عبر التجارب. لتقديم الطلبات ، لدينا وجدت أن جمع عدد كبير من حقول للرؤية يوفر حجم عينة كبيرة بما فيه الكفاية لإجراء مقارنات إحصائية كبيرة ، [المرجع السابق].
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا المختبر من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة ، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث وكندا ، وجمعية التصلب المتعدد في كندا (MSSC). وكان GSTS المتلقي لدراسية لدرجة الدكتوراه من MSSC. نحن ممتنون للدكتور جوان بوغز (مستشفى الأطفال المرضى ، وتورونتو) لإجراء مناقشات مفيدة كثيرة وتعليقات على هذه المخطوطة. ونحن ممتنون لBiotium لبيع الهدايا السخية من NucView إضافية 488 كاسباس 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment | |||
| NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells | Biotium, Inc. | 30029 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Roche Group | 04709705001 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO, by Life Technologies | 31053-028 | |
| 0.25% Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 15050-065 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 12483-020 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140122 | |
| #1.5-25 mm glass coverslip | Warner Instruments | 64-0715 | |
Chamlide CMB magnetic culture chamber for 25 mm coverslip |
Quorum Technologies | CM-B-40 | |
| Cellstart tissue culture 10 cm dishes | VWR international | 82050-576 | |
| BD Falcon 6-well tissue culture dishes | VWR international | CA62406-161 | |
References
- Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening. J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).
- Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells. FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).
- de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. Caspase activation precedes and leads to tangles. Nature. 464, 1201-1204 (2010).
- Eldadah, B. A., Faden, A. I. Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury. J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).
- Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation. Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).
- Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins. Glia. 58, 1292-1303 (2010).
- Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination. Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).
- Lau, A., Tymianski, M. Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration. Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).
- Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo. J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).
- Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells. J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).
- Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M.
- Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes. J. Neurosci. Res. , Forthcoming (2011).
- Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms. J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).
- Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury. Nat. Med. 5, 943-946 (1999).
- Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus. J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).
- Yu, S. P. Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis. Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).
