Summary
Live-cell imaging af caspase-3 medieret apoptose i udødeliggjort N19-oligodendrocyte cellekulturer ved hjælp af
Abstract
Det centrale nervesystem kan opleve en række af spændinger og neurologiske fornærmelser, som kan have mange skadelige virkninger, der i sidste ende føre til en reduktion i neuronal befolkning og funktion. Beskadigede axoner kan frigive excitatoriske molekyler herunder kalium eller glutamat i den ekstracellulære matrix, som igen kan producere yderligere fornærmelse og skade for støtte gliaceller herunder astrocytter og oligodendrocytes 8, 16. Hvis fornærmelse fortsætter, vil cellerne undergår programmeret celledød (apoptose), som er reguleret og aktiveres af en række veletablerede signaltransduktion kaskader 14. Apoptose og vævsnekrose kan opstå efter traumatisk hjerneskade, cerebral iskæmi, og beslaglæggelser. Et klassisk eksempel på apoptotiske regulering er den familie af cystein-afhængige aspartat-rettet proteaser, eller caspases. Aktiveret proteaser herunder caspases har også været impliceret i celledød i reaktion på kronisk neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers, Huntingtons, og dissemineret sklerose 4, 14, 3, 11, 7.
I denne protokol beskriver vi brugen af NucView 488 caspase-3 substrat til at måle hastigheden af caspase-3 medieret apoptose i udødeliggjort N19-oligodendrocyte (OLG) cellekulturer 15, 5, efter eksponering til forskellige ekstracellulære understreger, såsom høje koncentrationer af kalium eller glutamat. Af en betinget-udødeliggjort N19-OLG cellelinie (der repræsenterer O2A stamfader) er indhentet fra Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, og tidligere har været brugt til at studere molekylære mekanismer af myelin genekspression og signal transduktion førende til OLG differentiering (fx 6, 10). Vi har fundet denne cellelinie at være robust i forhold til transfektion med eksogene myelin grundlæggende protein (MBP) konstruerer smeltet til enten RFP eller GFP (rød eller grøn fluorescerende protein) 13,12. Her blev N19-OLG cellekulturer behandlet med enten 80 mm kaliumklorid eller 100 mm natriumglutamat at efterligne aksonal lækage i den ekstracellulære matrix til at inducere apoptose 9. Vi brugte en bi-funktionelle caspase-3 substrat, der indeholder en DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 anerkendelse subunit og en DNA-bindende dye 2. Underlaget hurtigt kommer ind i cytoplasma, hvor det er kløves af intracellulær caspase-3. Farvestoffet, NucView 488 er frigivet, og kommer ind i cellekernen, hvor det binder DNA og fluorescerer grønt ved 488 nm, signalering apoptose. Brug af NucView 488 caspase-3 substrat giver mulighed for live-cell imaging i real-tid 1, 10. I denne video, vi også beskriver dyrkning og transfektion af udødeliggjort N19-OLG celler, såvel som live-cell imaging teknikker.
Protocol
1. Optøning og dyrkning af celler
- Opnå lager af frosne udødeliggjort N19-oligodendroglial celler fra langsigtede flydende kvælstof butikker.
- Fordyb hætteglas indeholdende celler ved 37 ° C vandbad, indtil cellesuspensionen er helt optøet.
- Tilføj 7 mL DMEM (Dulbecco ændrede Eagle Medium) med høj-glucose suppleret med 10% FBS (føtalt bovint serum) og 1% penicillin / streptomycin til en 10 cm agarplade.
- Tilføj celle-suspension drop-klogt at pladen, og omryst det forsigtigt og rock Petri pladen for at sprede cellerne jævnt.
- Kultur-celler ved 34 ° C / 5% CO 2 inkubator.
- Efter 4 timer, opsug medier fra pladerne for at fjerne eventuelle resterende DMSO (dimethylsulfoxid), der var blevet brugt som en kryoprotektant, og erstatte med frisk medier (7 mL DMEM high-glucose medier suppleret med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin) .
2. Passaging Celler
- Hos 70-80%sammenløbet (4-7 dage vækst), opsug medier fra celler.
- Tilsæt 1 ml 0,25% trypsin til tallerken. Pipette trypsin at frigøre celler (ca. 5 minutter).
- Foretag de passende fortyndinger til forsøg betingelser og passage yderligere 10 cm plade for fremtidige eksperimenter på et celletæthed ikke mindre end 0,1 x 10 6 celler / ml.
Bemærk: Du bør passage dine celler mindst to gange efter optøning, før du bruger dem til eksperimenter.
3. Optælling og plettering Celler
- Til bord celler til live-cell imaging, trypsinize som tidligere beskrevet.
- Tag cirka 30 μL af celler og tæller ved hjælp af en haemocytometer.
- Placer en ubestrøget dækglas i en 6 brønds plade. Tilføj celler til godt på en massefylde på 0,1 x 10 6 celler / ml i 2 ml phenol-fri DMEM høj glukose medier, suppleret med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin, på 34 ° C / 5% CO 2.
- Tilladceller til at vokse natten over (16-20 timer) ved 34 ° C / 5% CO 2 før transfektion.
4. Transfektion
- Bland 100 μL serum-frie medier, 0,5-4 mikrogram renset plasmid-DNA, og 4 μL FuGENE HD (Roche). Vortex forsigtigt for at blande.
- Vortex igen kort og tillade, at DNA til komplekse i 5 minutter ved stuetemperatur, og derefter tilføje FuGENE HD DNA-blanding direkte til dyrkede celler. Vip pladen forsigtigt for at blande.
- Kultur cellerne for yderligere 48 timer ved 34 ° C / 5% CO 2 forud for behandling eller eksperimenter.
5. Forberedelse Celler til Live-Cell Imaging (LCI)
- Tænd for LCI Chamlide levende celle instrument styreboksen mindst 1 time før du ønsker at starte dit eksperiment. Kontrolboksen også regulerer temperatur og fugtighed i LCI Chamlide, og regulerer strømmen af forblandede 5% CO 2.
Bemærk: Det er tilrådeligt atTænd kontrolboksen op til 3 timer før du begynder eksperimenter for at sikre, at hele scenen når 34 ° C. Dette skridt vil reducere fokale afdrift, som er forårsaget af fluxulation og termisk udvidelse af metal scenen som det varmer, i løbet af billeddannelse.
- Arbejde i et flow-hætte, spray Chamlide magnetiske-type kultur kammer, og pincetter, med 70% ethanol og lad dem tørre i 5 minutter.
- Fjern celler fra rugemaskinen, og bekræfter, at de er sunde. De skal vises vedhængende og godt spredt på dækglas med talrige membran processer. Celler, der er stressede fra transfektion er ikke egnet til eksperimenter, og vil have et reduceret antal proces udvidelser, og har ofte et uregelmæssigt formet kerne.
- Vip 6-brønds plade og fjern dækglasset med en pincet. Hurtigt sted dækglasset cellen opad i bundplade af kulturen kammeret. Lad ikke dækglasset til tørre.
- Sæt den magnetiske hovedkroppen af den kultur kammeret og tilsættes 500 μL af medier fra den originale 6-brønds plade på toppen af dækglasset. Genbrug af dette medie vil reducere mængden af stress placeret på de celler forårsaget af miljømæssige ændringer, og kan også være nyttige for vurderingen af ekstracellulære udskilles faktorer.
- Placer glasset dækslet på kulturen kammeret.
- Brug en KimWipe sprøjtet med 70% ethanol for at fjerne eventuelle rester af materiale fra bunden af dækglasset, som ville forstyrre mikroskopi.
- Placer kultur kammer i de 34 ° C / 5% CO 2 inkubator i 30 min. Dette trin vil sikre, at kammeret selv varmer til 34 ° C for at reducere forskydning af dækglasset som metallet varmes op.
6. Microscope Indstillinger
Billeder blev erhvervet her med en Leica DMIRE2 inverteret mikroskop med en brugerdefineret relæ linse og emission filter hjul boliger for patron lastning af flere hjul (Beslutningsdygtighed Technologies Inc., Guelph, ON).
- Brightfield - Lampe sat til 2,5 V og eksponeringstid til 240 ms.
- Rød fluorescerende protein (RFP) - Gain angivet ved 140 til 200 ms.
- Grønt Fluorescerende Protein (GFP) - Gain sat til 140 til 500 ms.
- Vores mikroskop har en dæmpbar lampe i stedet for en roterende disk for at kontrollere mængden af lys til rådighed til cellerne. Vi driver vores eksperimenter med lys i 90% af den maksimale lampens intensitet.
7. Behandling af celler med Apoptose fremmere og NucView 488 caspase-3 substrat
- Det er vigtigt at forberede store lagre af apoptose induktorer i god tid og frys dem i alikvoter, således at koncentrationerne vil være i overensstemmelse mellem eksperimenter.
- Den NucView 488 Underlaget er lysfølsomt. Forbered delprøver af 15 mikroliter med at reducere fryse / optøning, og opbevar rør ved -20 ° C dækket af aluminiumsfolie. Arbejde med den omgivende rumbelysning så lavt som muligt for at mindske eksponeringen af NucVIEW 488 substrat til lys, forud for dets anvendelse.
- Hent den kultur kammer hurtigt fra rugemaskinen, så cellerne ikke bliver udsat for en reduktion i temperatur. Placer kultur kammeret på miljøkammeret af mikroskopet, og brug klemmer til at holde kulturen kammer i at bevæge sig. På dette tidspunkt bør du også dæmpe rummet lys.
- Tænd for 5% færdigblandede CO 2 tank med dobbelt regulator.
- Brug af 10x mål, at finde celler på computerskærmen ved hjælp af lys-felt mikroskopi fokus. Bemærk: Du ønsker at bruge de største numeriske åbning på målsætningen med den ønskede forstørrelse for at reducere eksponeringen tid.
- Lever induktorer af apoptose til celler (i vores tilfælde 80 mm kalium, eller 100 mm glutamat), kan en af følgende metoder anvendes. Vi vil bruge levering af 80 mM kalium som et eksempel, ved hjælp af KCl opløst som en 10x koncentrat i vores typiske dyrkningsmedier.
- Media udveksling by langsom og lokale perfusion:
- Brug en peristaltisk pumpe til udveksling af medier i den kultur kammer med nye medier indeholdende 80 mM kalium.
- Den ene ende af slangen vil levere 10 ml af en bestand på 80 mM kalium opløst i phenol-fri DMEM, og den anden ende af slangen vil fjerne medier fra kammeret.
- Vil du have mindst 10x udveksling af medier for at sikre, at medierne tilbage i kammeret har den korrekte koncentration af kalium.
- Efter medier er udvekslet, tilsættes 3 μL af NucView 488 substrat til medierne i kammeret. Pipette for at blande. - Direkte tilsætning af 80 mM K + og NucView 488 substrat til medierne i kultur kammer:
- Udarbejde et 10x stamopløsning af 80 mM kalium opløst i phenol-fri DMEM.
- Tilsæt 3 μL af NucView 488 substrat til 50 μL på 10x 80 mm kalium. Pipette for at blande. Tilføj til 500 μL phenol-fri DMEM i kultur kammer.
Bemærk: Denne metode erforetrukne, hvis du er interesseret i at opretholde eller vurdere vækst eller andre udskilles faktorer, der kan være til stede i det oprindelige medie. Vi har konstateret, at NucView 488 underlaget er stabilt i celle kultur for eksperimenter varige så længe som 36 h.
- Media udveksling by langsom og lokale perfusion:
8. Live-cell imaging
- Klik på den røde kanal til at vise transfekterede celler.
- Vælg og spare omkring en halv snes rammer, hvor der er flere transfekterede celler, og gemme disse "XY-scenen punkter". Afhængig af mængden af computerens hukommelse, kan du blive begrænset til antallet af scenen punkter, som du vil være i stand til at erhverve.
- Har mikroskop tage billeder (i lyse-field, rød kanal, og grøn kanal) på disse gemte stadium point hver 6 minutter.
- Enhver grønne pletter, der er synlig i de tidlige faser af forsøgene sandsynligt viser celler, der allerede er under apoptose, skyldes som regel at transfektion og / eller miljømæssige stress. ApoptOSIS på grund af de eksperimentelle behandlinger vil blive opdaget på et senere Tidspunkt i eksperimentet.
9. Statistisk analyse
For hvert eksperiment, program vi mikroskop for at erhverve flere XY punkter at samle et stort datasæt effektivt. Hvert forsøg udføres i to eller tre eksemplarer, og data er indsamlet fra forskellige eksperimenter udført på forskellige dage. Fra hver datasæt, analyserer vi op til 15 synsfelter og sammenligne forholdet mellem caspase-negative celler til caspase-positive celler (totale antal celler i synsfeltet / samlede antal caspase-positive celler).
- Den indspillede målinger fra hvert datasæt grupperes i et større udsnit sæt, og derefter i forhold til hinanden ved hjælp af en ANOVA tabel (p = 0,05). Vi viser den standard fejl af middelværdien (SEM) for hvert eksperiment, og derefter sammenligne forskellen i middel ved at udføre en Tukey betyder sammenligning test (p = 0,05) til at bestemme which behandlinger er markant forskellige fra hinanden.
10. Repræsentative resultater
Vi har beskrevet et eksperiment for at illustrere, hvordan NucView 488 underlaget kan indikere en øget hyppighed af apoptose af N19-OLG cellekulturer efter en behandling med en høj ekstracellulær kaliumkoncentrationen. Den N19-celler var transficeret med RFP, og blev enten behandlet med 3 μL NucView 488 substrat (kontrol), eller 3 μL NucView 488 substrat og 80 mm [K +] (behandling). Cellerne blev overvåget, og billeder blev erhvervet i løbet af en 12 timers-kursus, som er tilstrækkelig til undersøgelser af neurologiske fornærmelser (Figur 1A). I kontrol betingelser, har vi ikke observere betydelige mængder af apoptose i forhold til de 80 mm [K +] behandlede kulturer (hashet boks), der viste omkring 45% celledød efter 12 h (figur 1B). Baggrunden grønne signal observered i kontrol betingelser angiver de celler, der undergår apoptose uden tilsætning af ekstracellulært kalium. Stort set ingen af de celler i kontrol-eksperimentet udviser apoptose af de 12 h tidspunkt, men i andre situationer forsøgene kan være nødvendigt at køre længere. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et 10x objektiv. Bar = 100 mM.
Figur 1. (A) En 12 h tidsforløbet eksperiment N19 OLG kulturer 48 h post-transfektion udtrykker RFP-MBP (rød kanal) sammen med 3 μL af NucView 488 substrat (grøn kanal). Kulturer blev enten behandlet med en endelig koncentration på 80 mM [K +] (venstre paneler), eller ingen behandling som kontrol (højre paneler). Billeder blev erhvervet på 6 min mellemrum, og en betydelig aktivering af kløvet caspase-3 (grønt signal) kan observered i kulturer behandlet med 80 mM [K +] i cellekerner (hashed boks) i sammenligning med kontrolgruppen eksperimentere. (B) Procentdel af kløvet caspase-3 celler (beregnet ved at dividere det samlede antal celler i synsfelt ved det samlede antal af caspase-positive celler). I forhold til kontrol betingelser, observerede vi omkring 45% celledød efter K +-behandling med 12 h.
S-VIDEO 1. En 12 h tidsforløbet eksperiment af N19-OLG kulturer 48 h post-transfektion udtrykker RFP-MBP (rød kanal) med 3 μL af NucView 488 substrat (grøn kanal), sammen med lyse-field billeder og en tre-vejs flettede billede, efter behandling med 80 mm [K +].
S-VIDEO 2. En 12 h tidsforløbet eksperiment af N19-OLG kulturer 48 h post-transfektion udtrykker RFP-MBP (rød kanal) med 3 μL af NucView 488 substrat (grøn kanal), sammen med lyse-feltet images og en tre-vejs flettede billede. Ingen behandling blev anvendt på de kulturer og N19-OLGs kan ses migrerer gennem mikroskopet felt i modsætning til cellekulturer behandlet med 80 mm [K +] (sammenlign med S-VIDEO 1).
Discussion
Selv om dette ikke er den eneste fluorogenic produkt til rådighed for apoptose detektion, er der flere væsentlige fordele ved at bruge NucView 488 underlaget. En af de vigtigste fordele er evnen til at følge apoptose i levende celler i realtid, mens de fleste alternative produkter enten kræver cellelysis eller har dårlig celle permeabilitet. Andre fordele omfatter høj følsomhed for caspase-3 anerkendelse, høj celle permeabilitet, lav cytotoksicitet, og ingen indblanding i udviklingen af apoptose. Underlaget har også lav baggrundsfluorescens, indtil det er kløvet, og ind i kernen, hvilket eliminerer baggrundsfluorescens. Den caspase-3 anerkendelse sekvens indeholder 3 negative ladninger og DNA-bindende farvestof har en positiv ladning 2. Den DEVD-NucView 488 molekylet har således en netto negativ ladning, som forhindrer aktivering og binding af farvestoffet til DNA i celler, hvor caspase ikke er aktiv.
Maintaining sammenhæng mellem forsøgene er forpligtet til at kunne drage meningsfulde sammenligninger mellem replikater. En af de vigtigste parametre for at holde konsekvent er celle tæthed, da det påvirker antallet af transfektion. Indhentning af høje transfektion satser i udødeliggjort N19-OLG cellekulturer er sværere end med andre fælles cellelinjer såsom HeLa eller HEK293, og er meget afhængig af tæthed, i vores erfaring 12, 13. Vores bedste transfektion effektivitet for disse celler er blevet opnået med Fugene HD (Roche) og er normalt omkring 15%, men kan nå op over 30%, afhængig af konstruktion. Omhyggelig celletælling vil hjælpe med at opnå konsekvent transfektion satser. Det er også vigtigt at udsætte celler fra forskellige behandlinger til samme grad af miljøbelastninger, især når man måler satser for apoptose. Konkret, hvor lang tid, over hvilken cellerne udsættes for transfektion reagenser, eller mængden af lys eksponering, er vigtige miljø-variabelhavender til at overveje, og det bør forblive konstant på tværs af eksperimenter. For vores applikationer, har vi fundet, at indsamling af en lang række områder-of-view giver en tilstrækkelig stor stikprøvestørrelse til at foretage statistisk signifikante sammenligninger [ibid.].
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette laboratorium er blevet støttet af den canadiske Institutes of Health Research, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, og Scleroseforeningen i Canada (MSSC). GSTS var modtageren af en ph.d.-Studentship fra MSSC. Vi er taknemmelige for Dr. Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) til mange nyttige diskussioner og kommentarer til dette manuskript. Vi er taknemmelige for Biotium for deres generøse gave af yderligere NucView 488 caspase-3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment | |||
| NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells | Biotium, Inc. | 30029 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Roche Group | 04709705001 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO, by Life Technologies | 31053-028 | |
| 0.25% Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 15050-065 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 12483-020 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140122 | |
| #1.5-25 mm glass coverslip | Warner Instruments | 64-0715 | |
Chamlide CMB magnetic culture chamber for 25 mm coverslip |
Quorum Technologies | CM-B-40 | |
| Cellstart tissue culture 10 cm dishes | VWR international | 82050-576 | |
| BD Falcon 6-well tissue culture dishes | VWR international | CA62406-161 | |
References
- Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening. J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).
- Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells. FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).
- de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. Caspase activation precedes and leads to tangles. Nature. 464, 1201-1204 (2010).
- Eldadah, B. A., Faden, A. I. Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury. J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).
- Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation. Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).
- Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins. Glia. 58, 1292-1303 (2010).
- Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination. Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).
- Lau, A., Tymianski, M. Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration. Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).
- Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo. J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).
- Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells. J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).
- Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M.
- Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes. J. Neurosci. Res. , Forthcoming (2011).
- Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms. J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).
- Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury. Nat. Med. 5, 943-946 (1999).
- Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus. J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).
- Yu, S. P. Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis. Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).
