Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvantitative og Automated High-throughput Genome-wide RNAi skjermer i C. elegans doi: 10.3791/3448 Published: February 27, 2012

Summary

Vi beskriver en protokoll hjelp

Abstract

RNA interferens er en kraftig metode for å forstå gen-funksjon, spesielt når gjennomført på en hel-genom skala og i en kvantitativ sammenheng. I C. elegans, kan gen-funksjon bli slått ned enkelt og effektivt ved å mate ormer med bakterier som uttrykker en dsRNA tilsvarende et bestemt gen 1. Mens etableringen av biblioteker av RNAi kloner dekker det meste av C. elegans genom 2,3 åpnet veien for ekte funksjonelle genom studier (se for eksempel 4-7), de fleste etablerte metoder er arbeidskrevende. Moy og kolleger har utviklet semi-automatiske protokoller som gjør genom-wide skjermer 8. Tilnærmingen bygger på mikroskopisk bildebehandling og bildeanalyse.

Her beskriver vi en alternativ protokoll for en high-throughput genom-bredskjerm, basert på robot håndtering av bakteriell RNAi kloner, kvantitativ analyse ved hjelp av Copas Biosort (Union Biometrica (Ubi)), og enintegrert programvare: den MBioLIMS (Laboratory Information Management System fra Modul-Bio) en teknologi som gir økt gjennomstrømming for dataadministrasjon og prøve sporing. Metoden gjør at skjermene som skal utføres på fast medium plater. Dette er spesielt viktig for noen studier, for eksempel de adressering vert-patogen interaksjoner i C. elegans, siden visse mikrober ikke effektivt infisere ormer i flytende kultur.

Vi viser hvordan metoden kan brukes til å kvantifisere betydningen av gener i anti-sopp medfødt immunitet i C. elegans. I dette tilfellet, stoler tilnærming på bruk av en transgen belastning bærer en epidermal infeksjon-induserbar fluorescerende reporter genet, med GFP under kontroll av arrangøren av den antimikrobielle peptid genet NLP 29 og en rød fluorescerende reporter som uttrykkes konstitutivt i epidermis. Sistnevnte gir en intern kontroll for den funksjonelle integritet i overhudenog uspesifikke transgenet stanse 9. Når kontroll ormer er infisert av soppen de fluoresce grønt. Banket ned av RNAi et gen som kreves for NLP 29 uttrykk gir redusert fluorescens etter smitte. Foreløpig lar denne protokollen mer enn 3000 RNAi kloner som skal testes og analyseres per uke, åpner muligheten for screening av hele genomet på mindre enn 2 måneder.

Protocol

Protokollen som beskrevet nedenfor er delt inn i trinn på fem dager på rad (Fig. 1). Som nevnt, kan enkelte trinn gjøres på ulike dager. Varigheten av hvert trinn, samt mengden av materiale som kreves (f.eks ormer, bakterier, media) vil avhenge av antall 96 og plater behandlet per eksperiment.

Dag 1

1. Utarbeidelse av de 96 brønner NGM RNAi plater

Følgende protokoll er tilpasset fra standard metode for å lage ormen kultur plater 10, som omfatter opplysninger om sterilisering teknikker for de ulike løsningene.

  1. For 10-12 96-brønns plater, forberede 100 ml nematode vekstmedier (NGM) i avionisert H 2 O: 1,7 g BactoAgar, 0,29 g NaCl, 0,25 g Peptone, 100 mL kolesterol (5 mg / ml i EtOH).
  2. Autoclave NGM (5 min ved 121 ° C i 100 ml, 30 min ved 121 ° C i 4 L) og la den avkjøles til den er på ca 50 ° C (bare kult Enough å holde). Det er viktig at NGM forblir varm nok slik at den ikke stivner.
  3. Legg til 100 ml: 2,5 ml fosfatbuffer pH6 (1M), 100 mL MgSO 4 (1M), 100 mL 2 CaCl (1M), 400 mL IPTG (1M), 100 mL Ampicillin (100 mg / ml), 100 mL Tetracycline (12,5 mg / ml i EtOH).
  4. Fordel 75 mL av NGM til hver brønn av en 96-brønns flat bunn plate. For å unngå størkning av mediet, må det fravikes raskt, det er praktisk å bruke en repeterende dispenser (f.eks Repeatman, Eppendorf). Pass på at det ikke er luftbobler stede i brønnene.
  5. Oppbevar platene umiddelbart i en fuktig kammer (f.eks en Tupperware boks med våte tørkepapir i bunnen) ved 4 ° C.

Merk: plater kan være forberedt opp til en uke i forveien og oppbevares ved 4 ° C, og dette kan gjøre organiseringen av etterfølgende trinn lettere.

2. Automatisert tilrettelegging av 96-Deepwell LB plater

  1. Legg til en cover til hver plate og butikk ved 4 ° C. For å spore hver 96-brønn plate, bør en unik etikett eller strekkode legges, på dette stadiet eller senere.

Merk: plater kan være forberedt på 2 til 3 dager i forveien og oppbevares ved 4 ° C, og dette kan gjøre organiseringen av etterfølgende trinn lettere.

3. Grow RNAi bakterielle kloner i 96-Deepwell LB plater (over natten kultur)

  1. For påfølgende enkel håndtering, da de originale RNAi biblioteket kloner er i en 384-brønnen format, første redistribuere kloner inn merket eller bar-koda standard 96-brønnen plater som inneholder LB med 100 mikrogram / ml amp og 12,5 mikrogram / ml Tet supplert med glyserol (10% endelig konsentrasjon). Når de opprinnelige 384-vel platene ikke har kloner i alle brønnene, slik tilfellet er for de mest brukte "Ahringer" bibliotek, er det flere alternativer for å organisere datter platene. Kloner kan bli re-fordeles slik at det ikke er tomme brønner i de datteren platene. Dette minimerer antall plater til skjerm. Ideelt sett, derimot, under replikasjonen, bør noen brønner på hver datter plate stå tomme, slik at disse senere kan fylles med standard kontroll kloner (positive og negative) som letter over-plate sammenligninger. Disse 96-vel datter platene blir så brukt til å frø de 96-Deepwell LB plater for en overnatting (ON) kultur.

Alle væskehåndtering trinn er enklest med en robot flytende håndtering system (f.eks TECAN), men kan utføres manuelt ved hjelp av for eksempel en 96-pin Replicator. Hvis RNAi bibliotekets kloner er allerede i en 96-brønns format gå til trinn 3.5.

    Inkuber 96-vel RNAi datter plater ved 37 ° C med omrøring (200 rpm) for 14-15 timer.
  1. Kontroller at bakteriene vokste riktig og identifisere kloner som ikke vokser. Disse vil bli ekskludert fra senere analyser. Ideelt sett er det OD 600 målt i hver brønn, men dette kan gjøres ved enkle inspeksjon.
  2. Oppbevar 96-vel RNAi datter plater ved -80 ° C før bruk.
  3. Tin 96-brønners plater som inneholder RNAi kloner ved romtemperatur. Platene kan deretter holdes ved 4 ° C inntil bruk.
  4. Fordel 3 mL av hver bakteriell klone fra en 96-brønns replikere plate til de 96 brønnene i tilsvarende merket / strekkodet 96-Deepwell LB plate som inneholder 1,5 ml LB med 100 mikrogram / ml amp og 12,5 mikrogram / ml Tet. Bakterielle kloner å kontrollere RNAi effektivitet, for eksempel en GFP (RNAi) klone i nåtiden eksempel, og negative kontroller, kan inkorporeres manuelt i alle tilgjengelige tom brønn.
  5. Dekk til 96-Deepwell pSENESTESVA med en selvklebende film (f.eks AeraSeal mobilnettet kultur film fra Dutscher). Bytt den brukte 96-brønnen replikere plate ved -80 ° C.
  6. De 96-Deepwell merket platene er så inkuberes PÅ ved 37 ° C med omrøring (200 rpm for 14-15 timer).

Dag 2

4. Seed RNAi bakterielle kloner inn på 96-og NGM RNAi plater

Dette trinnet bør gjøres om morgenen etter på kultur.

  1. Ta 96-vel NGM plater fra 4 ° C og la dem varme opp og tørke i 5-15 min under en steril laminær skap. Ikke la platene for lenge under panseret (maks 30 min), som ellers NGM senere kan sprekke. Legg den aktuelle etiketten / strekkode for hver plate.
  2. Hent den 96-Deepwell på kultur plater fra 37 ° C. Noter plasseringen av eventuelle tomme brønner (en tom brønn er helt gjennomskinnelig), disse vil bli ekskludert fra påfølgende analyser.
  3. Sentrifuger 96-Deepwell plater 5 min ved 4000 rpm.
  4. Tips av supernatanten ved å snu platen kraftig opp ned og tørk de kantene av platen raskt på et papirhåndkle. Som kulturer er av rekombinante bakterier, må supernatanten å bli behandlet i henhold til lokale forskrifter (f.eks autoklaveres).
  5. Resuspender bakteriell pellet i den gjenværende væske (ca. 50 mL) av virvling, ideelt sett med en dedikert agitator (f.eks TECAN) slik at hver plate får nøyaktig samme behandling. Det er mulig å måle OD 600 av hver brønn for å standardisere nøyaktig bakteriell podestoff for den påfølgende trinnet, men dette er ikke uunnværlig, og vi ikke utfører en slik sjekk.
  6. Overføring 5 mL av resuspendert bakterier inn på 96-og NGM plater med en 8 eller 12-kanals Multi-pipette. Vær forsiktig så du ikke berøre eller penetrere NGM. Dette trinnet utføres manuelt, men kan bli optimalisert ved hjelp av en robot som Liquidator96 (Rainin) som gjør atfordeling av 96 RNAi kloner i ett trinn.
  7. La bakteriene tørr under en steril laminær skap, sjekker jevnlig for å unngå NGM blir for tørr. Dette trinnet bør ta ca 2 timer.
  8. Inkuber 96-vel RNAi-NGM plater ved 37 ° C i en fuktig kammer.

5. Forbered en synkronisert befolkning av ormer

For dette trinnet, bruker vi transgene ormer bærer reporteren genet (e) av interesse (f.eks en infeksjon-induserbar p NLP-29 :: GFP konstruksjonen og, som en intern kontroll, et konstituerende p kol-12 :: dsRed transgenet konstruere) . På grunn av den observerte nedgangen av transgene uttrykk med tiden, tine vi ferske grupper av ormer hver 6. uke. Vi kultur ormer for minst 2 generasjoner før bruk, og sikrer at ormer aldri har sultet før analysen. Hvis dag 2 i protokollen er tirsdag, forbereder vi ormer på fredag ​​ved å plassere 30 unge voksne ormer på en 9 cm NGM plate spres med OP50 bakterierved 20 ° C, de vil være klare til å bleke på tirsdag (se tabell 1).

  1. Bleach ormer etter standard protokoll 10.
  2. La eggene klekkes i M9 ved 25 ° C på med agitasjon for å få en synkronisert befolkning på L1 larver.

Dag 3

6. Fordel ormer på 96-og RNAi-NGM plater for fôring og RNAi

Dette trinnet bør gjøres i morgen. L1-trinns synkronisert ormer er fordelt på hver 96-brønn bakteriell klone for fôring og RNAi.

  1. Hente 96-vel RNAi-NGM plater fra 37 ° C og la dem i romtemperatur for å kjøle ned.
  2. Hente bleket ormene fra 25 ° C. Anslå antall ormer pr 2 mL og juster med M9 å ha rundt 100-120 mark per 2 mL (omtrent en eneste dråpe).
  3. Fordel manuelt 2 mL av L1-trinns ormer i hver brønn med en repeterende dispenser. Sjekk hver brønn for Worms (du bør se ormer som svømmer i væske).
  4. La platene tørke under en steril laminær kabinett (maksimalt 1 time). Kontroller platene regelmessig, ormer må gjennomgå og ikke svømme. Vær forsiktig, må NGM ikke tørker for mye, ellers vil det sprekke.
  5. Plasser platene ved 25 ° C i en fuktig kammer.

7. Test Drechmeria coniospora sporene for effektiv infeksjon

Dette trinnet er spesifikk for den nåværende skjermen. Den består i å teste ulike grupper av sporer for å velge svært infeksiøs seg. Derfor bør det gjøres så nært som mulig før 4 dag, dagen for smitte. Det er nødvendig å utarbeide tilstrekkelige L3-L4 ormer på forhånd for disse testene (Tabell 1). De detaljerte metoder som kreves for D. coniospora kultur har blitt beskrevet andre steder 11.

<ol>
  • Samle sporer fra et utvalg av hver sopp kultur i et lite volum av M9.
  • Plasser en dråpe av hver sporeoppløsning på en 35 mm NGM plate seeded med OP50, og la det tørke.
  • Legg 30-40 L3-L4 ormer bærer reporteren genet av interesse (f.eks p NLP-29 :: GFP).
  • Plasser de infiserte platene ved 25 ° C på.
  • Neste dag, sjekk ormer for GFP induksjon og velg batch av sopp som gir den klareste, bredeste og mest homogen induksjon av grønn fluorescens.
  • Dag 4

    8. Infisere RNAi eksponerte ormer med D. coniospora sporer

    Dette trinnet utføres 30 timer etter RNAi fôring når ormer har nådd L3-L4 scenen.

    1. Bestem volumet av sporer bruke til å distribuere 4 mL per brønn.
    2. Samle frisk D. coniospora sporer fra den valgte batch med M9 buffer. Bruk 8-10 mL M9 for en 9 cm plate av sporer.
    3. <li> Fordel 4 mL av sporer i hver brønn med en repeterende dispenser. Sjekk hver brønn for sporer (du kan se ormer svømming i væske).
    4. La platene tørke under en steril laminær kabinett (~ 1 time). Kontroller platene regelmessig til ormene begynner å gjennomgå. Vær forsiktig, må NGM ikke tørker for mye, ellers vil det sprekke.
    5. Plasser de infiserte platene ved 25 ° C i en fuktig kammer.

    Dag 5

    9. Observasjon og lagring av platene før automatisert kvantitativ analyse

    Dette trinnet starter 18 timer etter infeksjonen, og er utført i løpet av dagen fem. Worms er forventet å være unge voksne begynner å legge egg. Under dette trinnet fenotypen er scoret visuelt: enten ormer fluoresce grønt, som tilsvarer en normal situasjon etter infeksjon, eller induksjon av GFP endres i en gitt brønn som betyr at de forstummet genet endrer respons på infeksjon.

      <li> raskt observere platene under fluorescens dissekere mikroskop. Hvis platene viser en god generell GFP induksjon deretter gå videre til neste trinn, ellers vente til ettermiddagen for en bedre induksjon, så lenge det fortsatt er mat igjen for ormer.
    1. Visuelt scorer hver tallerken og legg merke noe godt med en markert fenotype (f.eks ingen uttrykk av GFP). Ved å kontrollere for de resultatene som oppnås med noen kontroll RNAi kloner som kan ha blitt tilsatt, gir dette første foreløpige analysen en indikasjon på om forsøket har vært vellykket.
    2. Ved hjelp av en 8 eller 12-kanals Multi Pipetter overføring ormene med 100 mL av NaCl 50 mm-Triton 0,05%, til en ny tilsvarende merket / strekkodet 96-godt rund bunn plate. Frys platene ved -80 ° C til analyse.
    3. På dagen for analysen, tine platene i romtemperatur og fortsett til den automatiserte analyse ved hjelp av Copas Biosort. Det sorter analyserer en enkel plate på 22 minutter. Plater skal ikke værevenstre ved romtemperatur i mer enn en time før analyse, og de kan ikke fryses igjen.
    4. Informasjonen innhentet fra Copas Biosort er transkribert til en Excel-fil for overfladisk verifisering av datakvalitet. Rådata med de ulike parametrene målt ved Copas Biosort (optisk tetthet (utryddelse), axial lengde (flygetid), fluorescens utslipp, samtidig med tre forskjellige detektorer) blir da lagret i en egen LIMS pakke (MBio LIMS, Modul- Bio) for påfølgende detaljerte kvantitative analyser.

    10. Representative Resultater

    Bruke mengder av ormer og bakterier gitt ovenfor, på slutten av forsøket, i de fleste brønner, bør dyrene alle har utviklet til voksen alder, og det bør fortsatt være litt mat igjen i alle brønnene. Under disse forholdene, bør de fleste brønner også inneholde egg. Det bør være et tilstrekkelig antall voksne i hver brønn slik at Biosort Data er hentet feller minst 50 individuelle ormer. På den annen side, hvis RNAi er effektiv, vil et stort antall RNAi kloner provosere en synlig fenotype. For eksempel kan ormer være ukoordinert, eller mer åpenbart, steril, eller arrestert i deres utvikling. Dette bør skje ofte, slik at vanligvis minst én brønn per 96-brønn plate inneholder ormer med en tydelig RNAi fenotype. Da fenotypen av interesse er uttrykk for en GFP reporter gen, brønner med en GFP (RNAi) klone gir en robust kontroll (Fig. 2). Andre fenotyper, som en endring av størrelse kan lett måles med Biosort (Fig. 3A). Vi observerte at ormer kunne migrere til tilstøtende brønner med svært lav frekvens (<1%, BS, upubliserte resultater) når maten i et godt løp ut.

    Slå ned funksjon av ulike klasser av gener kan påvirke transgener uttrykk i C. elegans. Noen er ikke spesielt nødvendig for transgener uttrykk 12. Andre, sliksom vev-spesifikke transkripsjonsfaktorer, for eksempel epidermal Gata faktoren ELT-3 13, vil være nødvendig i bestemte undergrupper av celler. Dette er en av grunnene til at inkludering av en ikke-relatert og konstituerende epidermal celle transgenet reporter konstruksjon (p col-12 :: dsRed) i belastningen som brukes for gjeldende protokollen. Dette tillater slike gener kan skilles fra de som er særskilt involvert i genet regulatoriske prosessen under studien (Fig. 3B & C). Dette transgenet er uttrykt i alle larvestadier. Dersom en analyse innebærer å påvise genuttrykk i embryoer en annen kontroll reporter genet ville være nødvendig.

    En av nyvinningene i denne protokollen er bruk av frysing plater å utsette sin analyse. Frysing gjør at platene skal lagres i opptil to uker uten vesentlig endre resultatene. Selv om de absolutte verdiene måles fluorescens kan bli endret, deres relative forholdstall forblir lik (Fig. 4). På othennes hånd, er RNAi en bunn variabel eksperimentell prosedyre 14. For å oppnå robuste resultater og eliminere de mange mulige falske positiver, RNAi skjermer trenger å bli replikert, minst en gang. Hvis forsøkene er vellykket gjennomført, bør det være en rimelig sammenheng mellom resultatene fra en plate testet på ulike dager. Spesielt bør gener som har en sterk effekt være klart identifiserbar, selv om deres presise kvantitative effekten er ikke identisk mellom dupliserte plater (Fig. 5).

    Figur 1.
    Figur 1. Generelle ordningen for en typisk eksperiment.

    Figur 2.
    Figur 2. Kontroll RNAi hjelp av en klon målretting GFP uttrykk. Transgene ormer expressing constitutively ap kol-12 :: dsRed reporter og en induserbar p NLP 29 :: GFP reporter på solid medium i en 96-brønns plate visualisert ved hjelp av en GFP dissekere mikroskop med en filter sett tillater samtidig observasjon av rød og grønn fluorescens. Worms ble utsatt for kontroll (øvre panel) eller en GFP RNAi klone (nederste paneler) for 48 timer. Panelene på venstre er friske ormer, de på høyre ormer 18 timer etter infeksjon med D. coniospora. Skalaen Baren er 1 mm.

    Figur 3.
    Figur 3. Kvantitativ analyse av en 96-brønns plate. Den Copas Biosort genererer numeriske data for hver mark analysert. Grafene viser gjennomsnittet og standardavviket for flygetid (TOF; A), som tilsvarer størrelsen på 15 ormer, rød fluorescens (B) og forholdet (X100) av grønn fluorescens til TOF (C) av transgen worms uttrykke constitutively AP kol-12 :: dsRed reporter og en induserbar p NLP 29 :: GFP reporter som hadde blitt dyrket på fast medium i en 96-brønns plate med forskjellig RNAi kloner for 48 timer, 18 timer etter infeksjon med D. coniospora. Visse kloner, for eksempel en markert med pilen i (A), provosere vekst mangler og / eller påvirke uttrykket av p kol-12 :: dsRed. Andre, spesielt påvirke GFP uttrykk, som fremhevet av pilen i (C). Dette bestemte klone rettet genet en nsy, tidligere vist seg å være viktig for reguleringen av NLP 29 13. Grønn, rød fluorescens og TOF måles i vilkårlige, men konstant enheter.

    Figur 4.
    Figur 4. CompARISON av data innhentet med levende og frossen prøver fra samme eksperiment. Plater av L4 ormer bærer p NLP-29 :: GFP og p kol-12 :: dsRed transgener ble enten infisert med D. coniospora eller ikke. Etter 18t, ble hver plate grovt sett deles i to, halvparten ble analysert umiddelbart og halvparten fryses ved -80 ° C til 24t, før tining og analyse. Verdier for gjennomsnittlig TOF (størrelse på ormer), EXT (optisk tetthet) og grønn og rød fluorescens ble beregnet for hver prøve. Grafen viser forholdet mellom gjennomsnittet for smittet dividert med ikke-infiserte prøvene, for de frosne og levende prøver (n = 7638 og 5096, og 8634 og 3850 ormer, henholdsvis).

    Figur 5.
    Figur 5. Komparativ analyse av dupliserte 96-brønns plater. Den normaliserte fluorescens ratio (gjennomsnittlig fluorescens ratio (her, 100 * grønn / TOF) for hver brønn delt påden trimmede (25 th til 75 th persentil) betyr for hver plate) for hver brønn fra duplikate analyser av et representativt 96-brønn plate.

    Material Eksperimentell Timeline
    • IPTG: ~ 1,4 mL
    • Ampicillin: ~ 5 ml
    • Tetracyclin: ~ 5 ml
    • LB: 5 L
    • 96-vel flate plater: 30 for NGM
    • 96-vel runde plater: 30 for frysing (analyse)
    • 96-Deepwell plater: 30 for på kultur
    • kultur film: 30
    • Tips boks: 30 for bakterier såing
    • 9 cm OP50 plater: ~ 17
    • Worms: 1 ferskt tint cyrovial per måned
    • Sportegn: ~ 2 plater
    • NaCl 50mm + Triton 0,05%: ~ 300 ml
    Torsdag
    1. Klargjør NGM RNAi 96-brønners plater (~ 1t + autoklav)
    Fredag
    1. Klargjør 96-Deepwell LB plater (~ 4t)
    2. Forbered Worms (14 plater med 30 unge voksne ormer ved 20 ° C + 1 plate ved 25 ° C)
    Mandag
    1. Overfør ormer fra platen ved 25 ° C på ny plate
    2. Fordel bakterier i LB plater (~ 7h)
    3. PÅ kultur på 18:00
    Tirsdag
    1. Distribuer bakterier på NGM plater i morgen (~ 3t+ ~~~HEAD=NNS 2h tørking)
    2. Bleach ormer fra platene ved 20 ° C
    Onsdag
    1. Fordel ormer kl 10 (~ 1h + ~~~HEAD=NNS 1h tørking)
    2. Test sporer med ormer fra plate ved 25 ° C
    Torsdag
    1. Infisere ormer kl 15:00 (~ 1h + ~~~HEAD=NNS 1h tørking)
    Fredag
    1. Transfer i nye 96-brønn plater + frys (~ 2t)

    Tabell 1. Eksempel på en en-syklus eksperiment med 30 plater.

    Her presenteres materialet som trengs for en ett-syklus eksperiment av 30 plater og en tidsplan for et eksperiment fra trinn 1 til trinn 12. organisert på 9 dager.

    Nematode vekstmedier (NGM), 100 ml:

    0.3 g NaCl
    0,25 g BactoPeptone
    2 g BactoAgar
    100 mL 5 mg / ml Kolesterol i EtOH
    Legg avionisert vann til 100 ml
    Autoklav i 5 minutter ved 121 ° C og la avkjøles, deretter legge til:
    100 mL 1 M MgSO 4
    100 mL 1 M CaCl 2
    2,5 mL 1 M KPO 4 pH 6,0

    NGM for RNAi behandling i 96-brønn plate, 100 ml:

    0,29 g NaCl
    0,25 g BactoPeptone
    1,7 g BactoAgar
    100 mL 5 mg / ml Kolesterol i EtOH
    Legg de ionisert vann til 100 ml
    Autoklav i 5 minutter ved 121 ° C og la avkjøles, deretter legge til:
    100 mL 1 M MgSO 4
    100 mL 1 M CaCl 2
    2,5 mL 1 M KPO 4 pH 6,0
    400 mL 1 M IPTG
    100 mL 100 mg / ml Ampicillin
    100 mL 12,5 mg / ml Tetracycline

    Bleach løsning, 5ml:

    2,5 ml H 2 O
    2,3 mL Bleach
    0,2 ml NaOH 50%

    NaOH 50%, 100 ml:

    50 g NaOH
    Legg avionisert vann til 100 ml

    NaCl 50mm-Triton 0,05%, 400 ml:

    4 ml NaCl 5 M
    1 ml Triton 20%
    Legg avionisert vann til 400 mL

    TEP "> Triton 20%, 10 ml:

    2 mL Triton X-100
    8 mL avionisert vann

    M9 buffer, 1L

    6 g Na 2 HPO 4 (MW: 178)
    3 g KH 2 PO 4 (MW: 136)
    5 g NaCl
    Legg avionisert vann til en L
    Autoklaver
    Tilsett 1 mL MgSO 4 1 M

    Luria buljong (LB), 1L:

    10 g BactoTryptone
    20 g gjær ekstrakt
    10 g NaCl
    Legg avionisert vann til en L
    Autoklaver

    1 M 4 MgSO, 300 ml:

    73.95 g MgSO 4
    Legg avionisert vann til 300 mL
    Autoklaven og oppbevares ved romtemperatur

    5 mg / ml Kolesterol, 200 ml:

    1 g Kolesterol
    Tilsett 100% EtOH til 200 ml
    Filtrer sterilisere og lagre ved romtemperatur

    1 M 2 CaCl, 500 ml:

    27.75 g CaCl 2
    Legg avionisert vann til 500 ml
    Filtrer sterilisere og lagre ved romtemperatur

    1 M KPO 4 pH 6,0, 4 L:

    517 g KH 2 PO 4 (MW: 136)
    207 g K 2 HPO 4 (MW: 174)
    Legg avionisert vann til 4 L

    100 mg / ml Ampicillin (Amp), 10 ml:

    1 g Ampicillin
    Legg avionisert vann til 10 ml
    Lagres ved -20 ° C

    1 M Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml:

    2,38 g IPTG
    Legg avionisert vann til 10 ml
    Lagres ved -20 ° C

    12,5 mg / ml Tetracyclin, 100 ml

    1,25 g Tetracycline
    Tilsett 100% EtOH til 100 ml

    Tabell 2. Solutions.

    Discussion

    Disclosures

    Den Ewbank lab samarbeider med Union Biometrica og Modul-Bio.

    Acknowledgments

    Vi takker D. Braendle, CL Kurz og F. Montañana-Sanchis for deres bidrag. Dette prosjektet ble støttet med tilskudd fra ANR og Conseil Regional PACA, og institusjonell støtte fra INSERM og CNRS.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BactoAgar BD Biosciences 214010
    Ampicillin Sigma-Aldrich A9518
    BactoPeptone BD Biosciences 211677
    CaCl2 Any Supplier
    AeraSeal adhesive film Dutscher 760214
    Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific, Inc. AB-0481
    K2HPO4 Any Supplier
    KH2PO4 Any Supplier
    MgSO4 Any Supplier
    NaCl Any Supplier
    Na2HPO4 Any Supplier
    NaOH Any Supplier
    96 deep well plate Thermo Fisher Scientific, Inc. AB-0932
    96 well flat plate Falcon BD 353072
    96 well round plate Falcon BD 353077
    Tetracycline Sigma-Aldrich T8032
    Triton X-100 Any Supplier
    TECAN robot Tecan Group Ltd.
    Liquidator96TM Rainin
    COPAS Biosort Union Biometrica
    LIMS Modul-Bio

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
    2. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
    3. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
    4. Lee, S. S. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).
    5. Hamilton, B. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).
    6. Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. Functional genomic analysis of C. elegans molting. PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).
    7. Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes. Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).
    8. O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model. Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).
    9. Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
    10. Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1551-8507 (2006).
    11. Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. Methods Mol Biol. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).
    12. Cardoso, C. XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans. Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).
    13. Pujol, N. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).
    14. Simmer, F. Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions. PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).
    15. Couillault, C. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).
    16. Morton, E., Lamitina, T. A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data. Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).
    17. Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans. PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).
    18. Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis. Virulence. 1, 113-122 (2010).
    19. Duverger, Y. A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).
    20. Pierce-Shimomura, J. T. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).
    21. Ruzanov, P., Riddle, D. L. Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).
    22. Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).
    23. Okoli, I. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).
    24. Moy, T. I. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).
    25. Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2. Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).
    Kvantitative og Automated High-throughput Genome-wide RNAi skjermer i<em> C. elegans</em
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448, doi:10.3791/3448 (2012).More

    Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448, doi:10.3791/3448 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video
    Waiting X
    simple hit counter