Vi beskriver en metod som kombinerar automatiserad cellodling med högt innehåll imaging att visualisera och kvantifiera olika cellulära processer och strukturer, i en hög genomströmning sätt. Sådana metoder kan stöd i den fortsatta funktionella notering av genomet samt identifiera nätverk sjukdomsgen och potentiella mål drog.
Den funktionella annotering av genom, byggande av molekylära nätverk och nya läkemedelsmål identifiering, är viktiga utmaningar som måste lösas som ett mycket angeläget 1-4. Flera kompletterande "omik" metoder har gett ledtrådar till de genetiska riskfaktorerna och patogena mekanismer som ligger bakom många neurodegenerativa sjukdomar, men de flesta fynd fortfarande kräver fungerande validering 5. Till exempel är en nyligen genomet hela föreningen studier för Parkinsons sjukdom (PD), identifierat många nya loci som riskfaktorer för sjukdomen, men den underliggande orsakande variant (er) eller patogenetisk mekanism inte känt 6, 7. Eftersom varje tillhörande region kan innehålla flera gener, skulle den funktionella bedömningen av varje av de gener på fenotyper i samband med sjukdomen, med traditionell teknik cellbiologi tar för lång tid.
Det finns också ett behov av att förstå de molekylära nätverk som sammanbindergenetiska mutationer till fenotyper de orsakar. Det förväntas att sjukdomen fenotyper är resultatet av flera interaktioner som har stört. Rekonstruktion av dessa nätverk med traditionella molekylära metoder skulle vara tidskrävande. Dessutom kommer nätverket förutsägelser från oberoende studier av enskilda komponenter, reduktionism metod underskattar förmodligen nätverket komplexitet 8. Denna underskattning kan delvis förklara den låga andelen framgångsrika godkännande av läkemedel på grund av oönskade eller toxiska biverkningar. Att få ett nätverk perspektiv av sjukdomsrelaterade vägar med HT / HC cellulära screening metoder, och identifierar de viktigaste noder inom dessa vägar, skulle kunna leda till identifiering av mål som är mer lämpade för terapeutisk intervention.
High-throughput screening (HTS) är en idealisk metod för att hantera dessa frågor 9-12. men traditionella metoder endimensionella hel-och cell-analyser, som används förenklarSTIC avläsningar för komplexa biologiska processer. De var oförmögna att samtidigt kvantifiera många fenotyper observerats i neurodegenerativa sjukdomar som axonal transport underskott eller förändringar i morfologi fastigheterna 13, 14. Denna metod kunde inte användas för att undersöka dynamiken i cellulära processer eller händelser patogena som inträffar i en delmängd av celler. För att kvantifiera sådana funktioner man måste flytta till flerdimensionella fenotyper kallas hög halt screening (HCS) 4, 15-17. HCS är cellbaserade kvantifiering av flera processer samtidigt, vilket ger en mer detaljerad bild av cellulära svar på olika störningar jämfört med HTS.
HCS har många fördelar jämfört HTS 18, 19, men bedriver en hög genomströmning (HT)-högt innehåll (HC) skärmen i neuronala modeller är problematisk på grund av höga kostnader, miljö variation och mänskliga fel. För att upptäcka cellulära svaren på en "fenomik" skalamed hjälp av HC avbildning man har för att minska variation och fel, samtidigt som man ökar känslighet och reproducerbarhet.
Häri beskriver vi en metod för att korrekt och tillförlitligt sätt utföra shRNA skärmar med hjälp av automatiserade cellodling 20 och HC avbildning i neuronala cellulära modeller. Vi beskriver hur vi har använt denna metod för att identifiera modulatorer för ett visst protein, DJ1, som när muterade orsakar autosomalt recessiv parkinsonism 21.
Kombinera den mångsidighet av HC avbildning med HT metoder är det möjligt att exakt kvantifiera en uppsjö av fenotyper. Detta kan sedan utnyttjas för att öka vår förståelse av genomet, de som är involverade i sjukdomens patogenes samt identifiera potentiella terapeutiska mål.
Med minskade kostnader för HT / HC cellulära screening system, i kombination med tillgången på kraftfulla Genomvid verktyg för att modifiera genfunktion, är HT / HC skärmar blir allt vanligare i den akademiska världen. Den metoden har redan framgångsrikt tillämpats på olika forskningsområden som identifiering av läkemedel mål i cancer 9, 31-33 och embryonal utveckling 34-36 och har även potential för tillämpning i dechiffrera involverade i de neuropsykiatriska störningar 37,38. Men genomförandet av ett sådant system kräver en betydande investering i tid och ansträngning med processoptimering ofta tar minst 6 månader. Alla åtgärder, såsom trypsinization tider, pipettering hastigheter och densitet seeda måste justeras för att säkerställa att cellerna är friska och växer ständigt. Förebyggande av bakteriell kontamination är en av de svåraste utmaningarna för automatiserad cellodling med veckostädning protokoll i Combination med konstant sköljning av all vätska som bär linjer med 70% etanol är nödvändigt för föroreningar fria kulturer. Det blir också nödvändigt att förbättra robotik, så att ytterligare instrument, t.ex. konfokala mikroskop för högre upplösning och -80 ° C frysar för sammansatta lagring kan integreras.
Det finns också begränsningar som måste åtgärdas för att förbättra den känsliga, hastighet och nyttan av denna metod för att studera gen nätverk och identifiera gener involverade i patogena molekylära vägar.
Att genomföra en HT / HC skärmen och se till att tillförlitliga uppgifter samlas in, flera aspekter måste optimeras. För det första är tillförlitligheten i mätningen av största vikt och är beroende av robusthet och känslighet analysen. Till exempel analyser som beskrivs ovan är lämpliga för mindre skärmar, men är svåra att genomföra på ett genomet stor skala, på grund av de steg antalet bearbetning som krävs innan bilden förvärvet.Således skulle man ha för att bygga stabila cellinjer som uttrycker reportern genen, vilket skulle möjliggöra direkt avbildning och leda till minskad variation på grund av minskat antal processteg. För närvarande utforma ett test som korrekt beskriver och tillförlitligt kvantifierar en fenotyp av intresse är en stor flaskhals i HC screening process.
Många skärmar bedrivs i däggdjursceller med olika RNAi bibliotek, som alla lider ej åsyftade effekter, begränsad geners uttryck effektivitet och ofullständig genomet täckning. Således biblioteken behöver göras som är mer specifika, potent och har bättre täckning. Ansträngningar görs för att skapa sådana Förhoppningen är sådana strävanden kommer att förbättra reproducerbarheten för HT / HC SCRE sv träffar.
En begränsning av många stora baserat skala cell skärmar är att de bedrivs i neuroblastom celler eftersom de kan vara genmanipulerade och odlade ett stort antal relativt enkelt. Dock är betydelsen av "träffar" som identifierats i ex vivo-modeller cellodling för in vivo-funktionen tveksamt, särskilt som hjärnan består av högt specialiserade celltyper som bildar en tät och komplicerat nätverk av synapsförbindelser att fungera som en starkt integrerad enhet. Som en följd är det vanligt att träffar identifieras med hjälp av screening som beskrivs ovan, är validerade i sekundära skärmar med hjälp av ytterligare tekniker och i mer fysiologiskt relevanta modeller 39. För att förbättra översättningen av träffar som identifierats under HCS, mer representativ och sofistikerade modeller, såsom primär celler och differentierade stamceller eller co-kultur-system behöver utvecklas och anpassas för HT / HC metoder.
ntent "> Med en kombination av automatiserade cellodling och HC avbildning ett snabbt kan få nya insikter i hur nervceller fungerar och bestämma vilka vägar är viktiga för sjukdomens utveckling. kombinera HCS / HTS data med information som härrör från andra" omik synsätt, kommer det då vara möjligt att konstruera ett system biologi överblick av sjukdomar i hjärnan, vilket underlättar terapeutisk utveckling.The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Hamilton programmerare och specialister för fortsatt stöd och Eva Blaas för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av två NWO Investeringsbidrag (911-07-031 och 40-00506-98-10011), The Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 och neurovetenskap Campus Amsterdam, SJ stöds av Ti-Pharma: T5-207.
Name of reagent | Company | Catalogue Number |
AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |