Nós descrevemos uma metodologia que combina cultura de células automatizado com alto conteúdo de imagem para visualizar e quantificar vários processos celulares e estruturas, de uma forma de alto rendimento. Tais métodos podem auxiliar na anotação de genomas ainda mais funcional, bem como identificar redes de doença genética e alvos terapêuticos potenciais.
A anotação funcional de genomas, construção de redes e identificação molecular romance alvo da droga, são desafios importantes que precisam ser tratadas como uma questão de grande urgência 1-4. Múltiplas abordagens complementares a genómica forneceram pistas sobre os fatores de risco genéticos e mecanismos patogênicos subjacentes inúmeras doenças neurodegenerativas, mas a maioria dos achados ainda necessitam de validação funcional 5. Por exemplo, um recente estudo de associação genômica ampla para a Doença de Parkinson (DP), identificou muitos loci novos fatores de risco para a doença, mas a variante subjacente causal (s) ou mecanismo patogênico não é conhecida 6, 7. Como cada região associada pode conter vários genes, a avaliação funcional de cada um dos genes em fenótipos associados com a doença, utilizando técnicas de biologia celular tradicional levaria muito tempo.
Há também uma necessidade de compreender as redes moleculares que apontammutações genéticas para os fenótipos que elas causam. Espera-se que fenótipos da doença são o resultado de múltiplas interações que foram rompidas. Reconstrução dessas redes usando os tradicionais métodos moleculares seria demorado. Além disso, as previsões de rede de estudos independentes de componentes individuais, a abordagem reducionista, provavelmente subestimam a complexidade da rede 8. Essa subestimação poderia, em parte, explicar a baixa taxa de sucesso de aprovação da droga devido aos efeitos colaterais indesejáveis ou tóxicos. Ganhando uma perspectiva de rede de vias de doenças relacionadas com HT / HC abordagens de triagem celular, e identificar os nós-chave dentro dessas vias, poderiam levar à identificação de alvos que são mais adequados para a intervenção terapêutica.
High-throughput screening (HTS) é uma metodologia ideal para abordar estas questões 9-12. mas os métodos tradicionais foram unidimensional ensaios de todo o bem celular, que usava simplistic leituras de processos biológicos complexos. Eram incapazes de quantificar simultaneamente os fenótipos observados em muitas doenças neurodegenerativas, tais como déficits de transporte axonal ou alterações nas propriedades morfologia 13, 14. Esta abordagem não poderia ser usado para investigar a natureza dinâmica de processos celulares ou eventos patogênicos que ocorrem em um subconjunto de células. Para quantificar tais características tem de se mudar para multi-dimensional fenótipos denominado de alto teor de triagem (HCS) 4, 15-17. HCS é a quantificação baseada em células de vários processos simultaneamente, o que fornece uma representação mais detalhada da resposta celular a perturbações diversas em relação ao HTS.
HCS tem muitas vantagens sobre HTS 18, 19, mas a realização de um high-throughput (HT) de alta o conteúdo da tela (HC) em modelos neuronal é problemático devido ao alto custo, a variação ambiental e erro humano. A fim de detectar respostas celulares em uma escala 'phenomics'usando uma imagem HC tem que reduzir a variação e erro, enquanto aumentando a sensibilidade e reprodutibilidade.
Aqui nós descrevemos um método para realizar com precisão e confiabilidade telas shRNA utilizando cultura de células automatizado 20 e HC de imagem em modelos celulares neuronais. Descrevemos como nós usamos esta metodologia para identificar moduladores de uma determinada proteína, DJ1, que quando mutado causa parkinsonismo autossômica recessiva 21.
Combinando a versatilidade do HC de imagem com métodos de HT, é possível quantificar com precisão um grande número de fenótipos. Esta situação pode ser utilizada para fazer avançar a nossa compreensão do genoma, os caminhos envolvidos na patogênese da doença, bem como identificar potenciais alvos terapêuticos.
Com os custos decrescentes de HT / HC sistemas de rastreamento de celular, combinado com a disponibilidade de poderosos genome-wide ferramentas para modificar a função do gene, HT / HC telas estão se tornando comuns na academia. A abordagem já foi aplicado com sucesso em diversas áreas de pesquisa, como a identificação de alvos terapêuticos no câncer 9, 31-33 e 34-36 desenvolvimento embrionário e ainda tem potencial para aplicação em decifrar os caminhos envolvidos em distúrbios neuropsiquiátricos 37,38. No entanto a implementação de tal sistema exige um investimento significativo de tempo e esforço com otimização de processos, muitas vezes tendo um mínimo de 6 meses. Todas as etapas, tais como tripsinização vezes, velocidades e densidades de semeadura pipetagem tem que ser ajustado, para garantir que as células são saudáveis e crescem de forma consistente. Prevenção da contaminação bacteriana é um dos desafios mais difíceis enfrentados cultura de células automatizado semanalmente com os protocolos de limpeza em combination com a constante lavagem de todas as linhas de rolamento líquido com etanol 70% é necessário para a cultura livre de contaminação. Será igualmente necessário melhorar a robótica de forma que instrumentos adicionais, como microscópios confocal de alta resolução e -80 ° C freezers para armazenamento de composto pode ser integrado.
Há também limitações que precisam ser tratadas para melhorar a velocidade, sensível e utilidade deste método para estudar redes de gene e identificar genes envolvidos em vias patogênicas molecular.
Para conduzir uma tela HT / HC e assegurar que dados confiáveis são coletados, vários aspectos precisam ser otimizados. Primeiro, a confiabilidade da medição é primordial e é dependente da robustez e da sensibilidade do ensaio. Por exemplo, os ensaios acima descritos são adequados para telas menores, mas são difíceis de implementar em uma escala genoma de largura, devido ao número de passos de processamento necessária antes da aquisição da imagem.Assim, seria necessário construir linhas celulares estáveis expressando o gene repórter, o que permitiria a imagem direta e levar a variação diminuiu devido ao número reduzido de etapas de processamento. No presente, projetando um ensaio que retrata com precisão e confiabilidade quantifica um fenótipo de interesse é o principal entrave para o processo de triagem HC.
Muitas telas são realizados em células de mamíferos utilizando diferentes bibliotecas RNAi, que sofrem de efeitos fora do alvo, eficiência limitada silenciamento de genes do genoma e cobertura incompleta. Thus bibliotecas precisam ser feitas, que são mais específicos, potentes e têm uma melhor cobertura. Estão em curso esforços para criar tal espera-se tais empreendimentos irão melhorar a reprodutibilidade de HT / HC scre en hits.
A limitação de muitas telas de grande escala à base de células é que eles são realizados em células de neuroblastoma, porque eles podem ser manipulados geneticamente e cultivadas para grandes números com relativa facilidade. No entanto, a relevância dos 'hits' identificadas na ex vivo modelos de cultura de células para função in vivo é questionável, especialmente porque o cérebro é composto de tipos de células altamente especializadas que formam uma rede densa e complicada de conexões sinápticas funcionar como uma unidade altamente integrado. Como conseqüência, é comum que atinge identificados utilizando a abordagem de triagem descrito acima, são validados em telas secundárias usando técnicas adicionais e mais fisiológico modelos relevantes 39. Para melhorar a tradução de visitas identificadas durante HCS, os modelos mais representativo e sofisticadas, tais como pilhas e células-tronco diferenciadas ou co-cultura sistemas precisam ser desenvolvidos e adaptados para HT / HC abordagens.
> ntent "Com uma combinação de cultura de células automatizado e imagem HC pode rapidamente obter novos insights sobre como os neurônios de função e determinar quais as vias são importantes para o desenvolvimento da doença. Combinando HCS / HTS dados com informações geradas a partir de outras abordagens a genómica, que vai então, ser possível construir uma visão de biologia de sistemas de doenças cerebrais, facilitando assim o desenvolvimento terapêutico.The authors have nothing to disclose.
Agradecemos aos programadores Hamilton e especialistas para o apoio contínuo e Blaas Eva para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por duas bolsas de Investimento NWO (911-07-031 e 40-00506-98-10011), The Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 eo Neuroscience Campus Amsterdam; SJ é suportado por Ti-Pharma: T5-207.
Name of reagent | Company | Catalogue Number |
AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |