Мы описываем методологию объединения автоматизированных культивирования клетки с высоким содержанием изображений для визуализации и количественной оценки нескольких клеточных процессов и структур, в высокой пропускной образом. Такие методы могут помочь в дальнейшей функциональной аннотации геномов, а также выявление заболеваний генных сетей и потенциальных лекарственных препаратов.
The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary ‘omics’ approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson’s Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long.
There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS.
HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a ‘phenomics’ scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility.
Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21.
Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.
С уменьшением расходов на HT / HC системах сотовой скрининга, в сочетании с наличием мощной генома инструменты для изменения функции генов, HT / HC экраны становятся обычным явлением в академических кругах. Этот подход уже был успешно применен в различных областях исследований, таких как идентификация лекарственных мишеней в 9 рака, 31-33 и 34-36 эмбрионального развития и даже имеет потенциал для применения в расшифровке путей, участвующих в нервно-психических расстройств 37,38. Однако реализация такой системы требует значительных затрат времени и усилий благодаря оптимизации процессов часто принимает не менее 6 месяцев. Все шаги, такие как трипсинизации раз, пипетки скорости и плотности посева, должны быть скорректированы, чтобы гарантировать, что клетки здоровы и растут постоянно. Предупреждение бактериального загрязнения является одной из самых сложных задач, стоящих перед автоматизированной культуре клеток с еженедельная уборка протоколов сombination с постоянной промывки всех жидких линий подшипник с 70% этанола являются необходимыми для загрязнения свободной культуры. Это будет также необходимо для улучшения робототехники, так что дополнительные инструменты, такие как конфокальные микроскопы для более высокого разрешения и -80 ° C морозильники для хранения соединения могут быть интегрированы.
Существуют также ограничения, которые необходимо решить для улучшения чувствительны, скорость и полезности этого метода для изучения генных сетей и выявить гены, вовлеченные в патогенные молекулярных путей.
Провести HT / HC экран и убедиться, что надежные данные собираются, некоторые аспекты должны быть оптимизированы. Во-первых, надежность измерений имеет первостепенное значение и зависит от устойчивости и чувствительности анализа. Например, тесты, описанные выше, подходит для небольших экранов, но трудно реализовать на геном масштабе, по причине большого числа этапов обработки, требуется до получения изображений.Таким образом, можно было бы построить стабильные клеточные линии выражения гена-репортера, который позволил бы для прямой визуализации и привести к снижению изменения из-за сокращения числа этапов обработки. В настоящее время проектирование анализа, который точно изображает и надежно количественно фенотип интерес является основным узким местом в процессе скрининга HC.
Многие экраны проводятся в клетках млекопитающих с использованием различных библиотек RNAi, все из которых страдают от вне целевых эффектов, ограниченное эффективности глушителей гена и неполный охват генома. Таким образом библиотеки должны быть сделаны, которые являются более конкретными, сильнодействующих и лучшего покрытия сетей. Предпринимаются усилия для создания такой есть надежда, такие усилия улучшат воспроизводимость HT / HC scre ан хитов.
Ограничение многих крупных масштабах ячейке на основе экранов является то, что они проводятся в клетках нейробластомы, потому что они могут быть генетически модифицированных и культурной большому числу с относительной легкостью. Тем не менее, актуальность "хитов", определенные в бывшей модели ячейки естественных условиях культуры в естественных условиях функции сомнительна, тем более, что мозг состоит из высоко специализированных типов клеток, которые образуют плотный и сложный сети синаптических связей функционировать как высоко интегрированную единицу. Как следствие, он является общим, который бьет идентифицируются с помощью скрининга подход, описанный выше, проверяются в средних экранов с помощью дополнительных методов и в более физиологическое соответствующих моделей 39. Для улучшения перевод хитов, выявленные в ходе ЖКХ, более представительным и сложных моделей, например, первичных элементов и дифференцированные стволовые клетки или со-культуре системы должны быть разработаны и адаптированы для HT / HC подходов.
ntent "> В сочетании с автоматизированной культивирования клеток и HC изображений можно быстро получить новые знания о том, нейроны функцию и определить, какие пути имеют важное значение для развития болезни. Объединение ЖКХ / HTS данных информацию, полученную от подходов других" omics ", он будет Тогда можно построить обзор системной биологии заболеваний головного мозга, способствуя тем самым терапевтический развития.The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Гамильтон программистов и специалистов для постоянной поддержки и Ева Blaas для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана двумя NWO инвестиционных грантов (911-07-031 и 40-00506-98-10011), Prinses Беатрикс Fonds Wetenschapsprijs 2009 и неврологии Campus Амстердаме; SJ поддерживается Ti-Фарма: T5-207.
Name of reagent | Company | Catalogue Number |
AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |