Summary
De splijting gist,
Abstract
Verschillende microscopie technieken beschikbaar vandaag dat een specifiek eiwit kan detecteren in de cel. Tijdens het laatste decennium live cell imaging met behulp van fluorochromen als Green Fluorescent Protein (GFP) direct aan het eiwit van belang is steeds populairder geworden: 1. Met behulp van GFP en soortgelijke fluorochromen de subcellulaire localisaties en bewegingen van eiwitten kan worden gedetecteerd in een fluorescentiemicroscoop. Bovendien, ook de subnucleaire lokalisatie van een bepaalde regio van een chromosoom kan worden bestudeerd met behulp van deze techniek. GFP is gefuseerd met de Lac-repressor eiwit (LacR) en ectopisch uitgedrukt in de cel waar tandem repeats van de LACO sequentie werd opgenomen in het gebied van de rente op het chromosoom 2. De LacR-GFP zal binden aan de Laco herhaalt en dat gebied van het genoom wordt zichtbaar als een groene stip in de fluorescentie microscoop. Gist is vooral geschikt voor dit type van manipulatie sinds homologerecombinatie is zeer efficiënt en op basis waarvan gerichte integratie van de Laco herhalingen en ontworpen fusie-eiwitten met GFP 3. Hier beschrijven we een kwantitatieve methode voor live cell analyse van de splitsing gist. Aanvullende protocollen voor live cell analyse van kernsplijting gist kan worden gevonden, bijvoorbeeld over hoe je een filmpje van de meiotische chromosomale gedrag van 4 te maken. In dit specifieke experiment richten we ons op subnucleaire organisatie en hoe het wordt aangetast tijdens geninductie. We hebben het label een gen cluster, genaamd Chr1, door de introductie van Laco bindingsplaatsen in de buurt van de genen. Het gen cluster is verrijkt voor de genen die vroege geïnduceerd worden tijdens de stikstof uithongering van kernsplijting gist 5. In de stam van de kernmembraan (NM) wordt aangeduid door de bevestiging van mCherry aan de NM eiwit Cut11 die aanleiding geven tot een rood fluorescerend signaal. De spindel Pole lichaam (SPB) verbinding Sid4 is gefuseerd met Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6 7. De SPB is geïdentificeerd als een grote ronde structuur in de NM. Door de beeldvorming vóór en 20 minuten na uitputting van de stikstofbron kunnen we bepalen de afstand tussen het gen cluster (GFP) en de NM / SPB. De gemiddelde of de mediaan afstanden voor en na uitputting stikstof worden vergeleken, en we kunnen dus kwantificeren of er is een verschuiving in de subcellulaire lokalisatie van het gen cluster na stikstof uitputting.
Protocol
1. Fission gistcultuur
- Bereid Edinburgh Minimale Media (EMM) en EMM zonder ammoniumchloride (EMM-N) 8. Ter vermindering van autofluorescentie de glucose-oplossing mag niet worden geautoclaveerd, maar in plaats daarvan filter gesteriliseerd met behulp van een 0,2 um filter en vervolgens toegevoegd aan de geautoclaveerde media.
- Inoculeren kernsplijting gistcellen vers gekweekt op een agar plaat met rich media, YEA 8, in 3 ml EMM vloeibare media met filter gesteriliseerd glucose. Gebruik 13ml buizen met een licht geduwd op de dop om een goede ventilatie van de cellen te verzekeren. Laat de cellen groeien door schudden ze met 225 rpm in 30 ° C. Houd de cellen groeien in log-fase (1 x 10 6 - 2 X 10 7 cellen / ml) gedurende 2 dagen door te tellen ze met behulp van een Burker kamer gevolgd door passende verdunning, elke ochtend en avond.
- Op de dag van het experiment zorg ervoor dat cellen in het begin van de log-fase, 5 x 10 6 - 1 x 10 7 cellen / ml.
- Te verhongeren tHij cellen voor stikstof gedurende 20 minuten overschakelen van EMM media tot EMM-N media. Dit wordt gedaan door het oogsten van 3 ml van cellen in een 1,5 ml Eppendorf buis in een bench top centrifuge maximaal 1,5 RCF als centrifugeren bij een hogere snelheid kan leiden tot een stressrespons bij splitsing gist 9. Gebruik de dubbele spinning techniek, betekenis; eerste spin gedurende 2 minuten, draai dan de eppendorfbuisje 180 ° en de spin opnieuw voor 1,5 RCF 2 min 10. Dit helpt om alle cellen te verzamelen in een pellet op de bodem van de buis. Was eenmaal met EMM-N en vervolgens de pellet te lossen in EMM-N en incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 30 ° C schudden bij 225 toeren per minuut en ga dan verder naar punt 2. Monstervoorbereiding.
2. Monstervoorbereiding
- Oogst 1,5 ml van de cellen in een 1,5 ml Eppendorf buis in een bench top centrifuge maximaal 1,5 RCF als centrifugeren bij een hogere snelheid kan leiden tot een stressrespons bij splitsing gist 9. Gebruik de dubbele spinning techniek, meaning, eerste spin gedurende 2 minuten, draai dan de eppendorfbuisje 180 ° en de spin opnieuw voor 1,5 RCF gedurende 2 minuten 10. Dit helpt om alle cellen te verzamelen in een pellet op de bodem van de buis.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof, maar laat 10-15 pi en resuspendeer de cellen in de overige media. Als alternatief toe te voegen 10 pi van verse media naar de cel pellet resuspenderen.
- Zorg ervoor dat u helder glas dia's en glazen deksel (geen 1.5). Normaal gesproken hoeft u ze niet te schoon, maar zorg ervoor dat ze niet vol stof.
- Haal uit de diepvries een hoeveelheid van een voorraad oplossing van 1mg/ml lectine dat filter gesteriliseerd. De lectine oplossing kan opnieuw worden ingevroren een paar keer. De lectine wordt gebruikt om de gistcellen op het dekglas op te lossen.
- Plaats 5 pi van EMM met filter gesteriliseerd glucose op de doelstelling glas.
- Plaats 5 pi van lectine-oplossing in de hoek van het deksel glas. Vervolgens plaats 5 pi van celkweek in dezelfde hoek, dwz in de lectine laten vallen. Meng door pipetteren een paar keer en vervolgens verspreiding van de celcultuur-lectine mix in de dekking van glas met behulp van de lange zijde van de pipet tip. Afhankelijk van de dichtheid van uw mobiele mengsel laat alles of tot overmaat vloeistof opzuigen in de tegenovergestelde hoek van het deksel glas.
- Plaats het deksel glas, boven op, met een zijde over de doelstelling glas en aan de andere kant op de bank. Laat de dekking van glas droge een beetje voor een paar minuten. Het moet absoluut niet helemaal droog, maar het moet niet te veel vloeistof op het glas.
- Plaats het deksel glas met een ongeveer 70 ° engel uit de doelstelling glas door de daling van EMM. Laat de dekking van glas, zodat het naar beneden vallen boven in de daling van EMM.
- Voor afdichting van de randen met siliconen vet voor te bereiden een 2 ml spuit. Snijd de brede einde van een 200 ul tip en bevestig deze aan de spuit. Vul de spuit met ongeveer 1 mL van siliconenvet. Een fijne lijn van silicium wordt toegepast op de randen van de dekking van glas door zachtjes pusHing de zuiger van de spuit. Nu heb je een kleine groei kamer van S. pombe cellen.
3. Microscopie
- Initialiseer de fluorescentie microscopie door het aanzetten van de kwik / xenon lamp, de microscoop en de computer. Plaats de gist groei kamer in de fluorescentie microscoop. Gebruik een 63 X doelstelling of een 100 X objectief met NA = 1.3 of hoger. Indien een olie-objectief wordt gebruikt, voeg olie.
- Gebruik de heldere veld om de cellen te vinden en een scherp beeld te krijgen.
- De instellingen voor de fluorescentie microscopie variëren, afhankelijk van de fluorochromen wordt gebruikt om de gistcellen en de microscoop label. We maken gebruik van een confocale microscoop Zeiss LSM 700 laser scanning microscoop met Plan-Apochromat 63x olie objectief lens (NA = 1.4) met de 16-lijn gemiddelde vlak scan setting. De pinhole moet worden ingesteld op 1-1,1 Airy eenheden, die een optisch schijfje van 0,8 mm geeft. We ontdekken GFP in Spoor 1 met behulp van het filter voor Alexa 488 met een beam splitter bij 582 nm, waardoor detecting golflengten tussen 488 en 582 nm. In Spoor 2 gebruiken we een filter set optimaal voor mCherry het gebruik van een beam splitter bij 578 nm, dus het detecteren van golflengten tussen 578 en 600 nm. Dit betekent dat in Spoor 2 zowel de mRFP (SPB) en NG (mCherry) worden gedetecteerd.
- Neem zo veel foto's nodig om te kunnen meten in 60 verschillende cellen voor elke stam. Meestal 15 foto's van onafhankelijke microscopie velden zijn genoeg. Het verdient aanbeveling dat een nieuwe groei kamer met verse cellen is gemaakt als uw microscopie tijd meer dan 60 minuten.
4. Kwantitatieve meting van subcellulaire afstanden
- Open de foto's in de Zeiss Zen-Light Edition programma. Met behulp van de metingen gereedschap meet de afstand in um tussen de verschillende fluorochromen in alle cellen waar alle signalen worden in hetzelfde brandvlak worden geplaatst. Stel de lichtintensiteit en het contrast naar het midden van het fluorescerende signaal te identificeren. Deze vereenvoudigde protocol maakt gebruik van slechts twee verschillende colours en dus de SPB en NM zijn in hetzelfde kanaal. De SPB is uitgekozen door de grote ronde structuur in de NM. Overdracht van de afstanden tot een kladblok blad. Maatregel ten minste 60 cellen. Andere programma's zoals ImageJ kunnen ook worden gebruikt om de afstand te meten, maar Zeiss Zen Light heeft de voorkeur vanwege de hogere resolutie van het beeld en het gemak om in te zoomen en met behulp van dat programma. Foto's in LSM-formaat geopend in ImageJ zal de twee kanalen op de top van elkaar. Om een foto met beide kanalen, eerste splitsing van de twee kanalen en daarna samen te voegen. Daarna de line tool kan worden gebruikt om de afstanden zoals hierboven beschreven te meten.
- Vergelijk de gemiddelde of de mediaan subcellulaire afstanden tussen de verschillende stammen en behandelingen met behulp van een statistisch programma, bijvoorbeeld t-test of Mann-Whitney Rank Sum Test, bijvoorbeeld door het gebruik van de SigmaStat-3.5-software. Vaak de gegevens niet normaal verdeeld, omdat er een selectie voor cellen met kortere wordenafstanden tussen de fluorescerende signalen, omdat alle signalen dienen te worden in hetzelfde focal plane te meten. Een t-test kan alleen worden gebruikt wanneer de data een normale verdeling, terwijl een Mann-Whitney Rank Sum Test maakt de vergelijking van gegevens sets die normale verdeling ontbreekt. In een t-test het gemiddelde van twee verschillende datasets worden vergeleken, terwijl in een Mann-Whitney Rank Sum Test de mediaan wordt vergeleken.
5. Representatieve resultaten
Strain PJ1185: (h + + his7:: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 + hphMX6 Laco] sid4-mRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18 Leu1-32 ade6-DN / N) werd gekweekt in EMM . Een monster werd ingetrokken en gemonteerd in een kleine groei kamer en foto's werden genomen (Fig. 1A + N). Vervolgens werd de groei van media werd vervangen door EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N), en de cellen werden grown gedurende 15 minuten tijdens het schudden. De stikstof verhongerde cellen werden vervolgens gemonteerd in een groei kamer met EMM-N en de foto's zijn genomen (fig. 1A-N). Het meetinstrument werd gebruikt om de afstand tussen de locus (GFP) en het SPB (Fig. 1B en tabel 1) te meten. Daarnaast werd de afstand tussen de locus (GFP) en de NM gemeten (Fig. 1B en tabel 2). De mediane subcellulaire afstanden voor en na de stikstof uitputting werden vergeleken met behulp van de SigmaStat-3.5-software (tabel 3). Er was een statistisch significante verschuiving in de lokalisatie van het gen cluster af te stappen van de NM naar de SBP. De gegevens meten van de afstand tussen het GFP en de SBP had een normale verdeling en daarmee de gemiddelde afstanden (1.777 um + N en 1587 um-N) kan vergeleken worden met behulp van een t-test (tabel 1 en 3). Er was een significant verschil tussen de twee gemiddelde waarden (P = 0.008, t-test). De gegevens meten van de afstand tussen het GFP en NM niet over een normale distribution en dus ook de mediane afstanden (0 um + N en 0.390 um-N) werden vergeleken met behulp van een Mann-Whitney Rank Sum test (tabel 2 en 3). Er was een significant verschil tussen de twee mediane waarden (p <0,001, Mann-Whitney Rank Sum test).
Figuur 1. De lokalisatie van een cluster van genen genaamd Chr1, gekenmerkt door GFP, veranderde na de stikstof honger. (A) Linkerkolom, + N, een vertegenwoordiger celkern van een cel gegroeid in EMM rechter kolom,-N, een vertegenwoordiger celkern van een cel gegroeid in EMM-N. Groen is het GFP-signaal het labelen van de Chr1 cluster, rood is de mRFP en mCherry de etikettering van de SPB-en NM, respectievelijk. (B) Zelfde celkern als (A), maar nu met de gemeten subnucleaire afstanden, geel: de diameter van de celkern, blauw: de afstand tussen SPB en GFP signaal en roze: de afstand tussen de GFP-signaal en het nucleaire membraan.
Tabel 1. De gemeten subnucleaire afstanden in um van de PJ1185 stam gekweekt in EMM. Eerste rij, diameter van de cel (d), tweede rij, de afstand tussen het GFP en het SPB, derde rij, de afstand tussen het GFP en de NM.
Tabel 2. De gemeten subnucleaire afstanden in um van de PJ1185 stam gekweekt in EMM-N. Eerste rij, diameter van de cel (d), tweede rij, de afstand tussen het GFP en het SPB, derde rij, de afstand tussen het GFP en de NM.
Discussion
Tijdens de laatste tien jaar is het gebruik van live cell imaging aan cellulaire gebeurtenissen monitoren is steeds populairder geworden. Het begon met het gebruik van Green Fluorescence Protein van kwallen Aequorea victoria en nu veel verschillende fluorochromen zijn verkrijgbaar uitzenden fluorescentie via een breed spectra van cyaan (475 nm) te ver rood (648 nm) 11. Een van de grote voordelen van live cell imaging meer dan immunofluorescentie is dat de cellen niet worden vastgesteld door formaldehyde of ethanol / aceton behandeling voor microscopie, dus het vermijden van mogelijke voorwerpen uit de fixatie proces. Daarnaast, live cell imaging biedt de mogelijkheid om individuele cellen te volgen en foto's nemen met regelmatige tussenpozen gedurende uren of dagen van incubatie, waardoor het mogelijk is om films van de cellulaire gebeurtenissen 12 jaar krijgen. Cellen van zoogdieren hebben het voordeel van het hebben van een groter formaat, met een diameter van ongeveer 100 micrometer, in vergelijking met de kleinere gistcel met een diameter van ongeveer 3-4 μ m. Aan de andere kant, het voordeel met gist is het gemakkelijk te manipuleren genoom. Homologe recombinatie gebeurt zeer efficiënt in gist en wordt gebruikt om eiwitten van belang zekering aan verschillende fluorochromen 3. Bovendien, met behulp van gerichte integratie van Laco sequenties en volgende expressie van LacR-GFP-eiwit maakt de detectie van een specifiek deel van het genoom in de celkern 2. Met behulp van S. pombe cellen in de microscopie heeft bijkomende voordelen, omdat ze natuurlijk eencellige organismen die groeien met een snelle generatie tijd in low-cost celcultuur condities. Bovendien, S. pombe is een uitstekend model eukaryotische organisme omdat het metazoïsche homologe genen.
Een van de belangrijkste beperkingen van deze techniek is autofluorescentie in de gistcel verstoren van de detectie van het werkelijke signaal. Dit probleem kan worden ondervangen door met minimale groei van media met een filter gesteriliseerde glucose in plaats van geautoclaveerd. InDaarnaast heeft de gistcellen moeten worden gekweekt voor 2 dagen in log-fase voor het opspannen. Het protocol hier gepresenteerde biedt een relatief eenvoudige, maar toch kwantitatieve methode om de subcellulaire lokalisatie van eiwitten te bepalen binnen de gistcel. Bovendien is door het nemen van foto's op verschillende tijdstippen kunnen we volgen cellulaire gebeurtenissen.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Professor Hiraoka voor het sturen van stammen. Wij erkennen de steun van de Goran Gustafssons Foundation en de Zweedse Cancer Society (2008/939).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L1395 | |
| Silicon grease | Dow Corning | ||
Laser scanning microscope LSM 700 |
Carl Zeiss, Inc. | LSM 700 | Other confocal microscope could be used. |
| SigmaStat3.5 | Statcon | SigmaStat3.5 | Any software for statistical analysis could be used. |
References
- Chalfie, M. fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-802 (1994).
- Robinett, C. C. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).
- Bahler, J. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14, 943-943 (1998).
- Asakawa, H., Hiraoka, Y. Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe. Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).
- Alfredsson-Timmins, J. Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 118, 99-99 (2009).
- Kristell, C. Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes. Genome. Res. 20, 361-361 (2010).
- West, R. R. cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe. Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).
- Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network. Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).
- Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast. J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).
- Soto, T. Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).
- Hagan, I. M., Ayscough, K. R. Fluorescence microscopy in yeast. Allan, V. J. , University Press. Oxford. (2000).
- Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).
- Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection. J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).
