כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Summary

שמרים הביקוע,

Abstract

שיטות מיקרוסקופיה קיימות מספר היום כי ניתן לזהות חלבון מסוים בתוך התא. בעשור האחרון הדמיה תא חי באמצעות fluorochromes כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מחוברת ישירות לחלבון של עניין הפך יותר ויותר פופולרי ^1. בעזרת ה-GFP ו fluorochromes דומה localisations subcellular ותנועות של חלבונים ניתן להבחין מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יתר על כן, גם לוקליזציה subnuclear באזור מסוים של כרומוזום ניתן ללמוד באמצעות טכניקה זו. ה-GFP הוא התמזגו לחלבון לאק repressor (LacR) והביע ectopically בתא בו חוזר טנדם של רצף לאצו כבר מוכנס לתוך האזור של עניין על כרומוזום ^2. LacR-GFP יהיה לאגד את חוזרת לאצו וכי האזור של הגנום יהיה גלוי כנקודה ירוקה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שמרים מתאים במיוחד מאז הומולוגיים עבור סוג זה של מניפולציהרקומבינציה יעילה מאוד, ובכך מאפשרת שילוב ממוקד של חוזר לאצו חלבונים מהונדסים היתוך עם GFP ^3. כאן אנו מתארים שיטה לניתוח כמותי של תא חי שמרים ביקוע. פרוטוקולים נוספים עבור ניתוח תא חי של שמרים ביקוע ניתן למצוא, למשל על איך לעשות סרט של ⁴ התנהגות meiotic כרומוזומליות. בניסוי הספציפי הזה אנחנו מתמקדים בארגון subnuclear וכיצד הוא מושפע במהלך אינדוקציה גן. יש לנו שכותרתו אשכול גנים, בשם Chr1, על ידי כניסתה של אתרי לאצו מחייב בקרבת הגנים. אשכול הגן מועשר עבור גנים המושרה מוקדם במהלך רעב חנקן של שמרים ביקוע ^5. בשנת המתח בקרום הגרעין (NM) מסומן על ידי החיבור של mCherry כדי Cut11 NM חלבון והוליד אות ניאון אדום. הפולני ציר הגוף (SPB) הוא תרכובת Sid4 התמזגו חלבון פלואורסצנטי אדום (Sid4-mRFP) ⁶ 7. SPB מזוהה כמבנה עגול גדול NM. על ידי הדמיה לפני 20 דקות לאחר דלדול של מקור חנקן אנו יכולים לקבוע את המרחק בין באשכול גנים (GFP) ואת NM / SPB. המרחקים אומר או חציון לפני ואחרי דלדול חנקן מושווים ואנחנו יכולים לכמת ולכן אם יש או אין שינוי לוקליזציה subcellular של אשכול הגנים לאחר דלדול חנקן.

Protocol

1. שמרים ביקוע תרבות

1. הכן אדינבורו מדיה מינימלי (EMM) ו EMM ללא ammoniumchloride (EMM-N) ^8. כדי להפחית autofluorescence הפתרון גלוקוז לא צריך להיות autoclaved אלא לסנן מעוקר באמצעות 0.2 מיקרומטר לסנן והוסיף לאחר מכן לכלי התקשורת autoclaved.
2. לחסן שמרים תאים ביקוע גדלה טרי עם מדיה עשירה על צלחת אגר, yea ^8, ב 3 מ"ל של נוזל התקשורת EMM עם גלוקוז מעוקרים הסינון. השתמש צינורות 13mL עם דחף קלות על מכסה כדי להבטיח אוורור טוב של התאים. בואו התאים לגדול על ידי רועדת להם סל"ד 225 ב 30 ° C. שמור את התאים לגדול בשלב יומן (1 X ^06-02 אוקטובר 10 X ⁷ תאים / מ"ל) עבור 2 ימים על ידי ספירת אותם באמצעות תא שודד גופות' ואחריה דילול מתאים, כל בוקר וכל ערב.
3. ביום הניסוי לוודא שיש תאים בשלב מוקדם יומן, 5 X ^06-01 אוקטובר 10 X ⁷ תאים / מ"ל.
4. כדי לא לגווע ברעבהוא התאים חנקן במהלך מתג 20 דקות מהתקשורת EMM כדי EMM-N התקשורת. הדבר נעשה על ידי קצירת 3 מ"ל של תאים צינור 1.5 Eppendorf מ"ל בצנטריפוגה ספסל העליון בבית RCF 1.5 מקסימום כמו צנטריפוגה במהירות גבוהה יותר עלולה לגרום תגובת הלחץ בשמרים ביקוע ^9. השתמש בטכניקה ספינינג כפול, כלומר, ספין הראשון 2 דקות, ולאחר מכן להפעיל את הצינור Eppendorf 180 ° ו - ספין שוב עבור 1.5 RCF 2 דקות ^10. זה עוזר לאסוף את כל התאים באחד גלולה בחלק התחתון של הצינור. שטפי פעם עם EMM-N ואז לפזר את גלולה EMM ב-N ו - דגירה על התאים למשך 15 דקות בקצב של 30 ° C רועדת 225 סל"ד ולאחר מכן המשך בשלב 2. לדוגמה הכנה.

2. לדוגמה הכנה

1. קציר 1.5 מ"ל של תאים צינור 1.5 Eppendorf מ"ל בצנטריפוגה ספסל העליון בבית RCF 1.5 מקסימום כמו צנטריפוגה במהירות גבוהה יותר עלולה לגרום תגובת הלחץ בשמרים ביקוע ^9. השתמש בטכניקה ספינינג כפול, meaning: הראשונה ספין 2 דקות, ולאחר מכן להפעיל את הצינור Eppendorf 180 ° ו - ספין שוב RCF 1.5 דקות 2 ^10. זה עוזר לאסוף את כל התאים באחד גלולה בחלק התחתון של הצינור.
2. הסר את supernatant, אבל להשאיר 10-15 μL ו resuspend התאים בתקשורת הנותרים. לחילופין להוסיף 10 μL התקשורת טריים resuspend גלולה התא.
3. ודא שיש שקופיות זכוכית שקופה ומכסה זכוכית (לא 1.5). בדרך כלל אתה לא צריך לנקות אותם, אבל לוודא שהם לא מלא אבק.
4. מוציאים מהמקפיא aliquot של פתרון מלאי של לקטינים 1mg/mL כי כבר מעוקרים הסינון. הפתרון לקטינים ניתן refrozen כמה פעמים. לקטינים משמש כדי לתקן את התאים שמרים על הזכוכית המכסה.
5. 5 מקום μL של EMM עם גלוקוז מעוקרים לסנן על הזכוכית אובייקטיבי.
6. מקום 5 μL של פתרון לקטינים בפינה של זכוכית המכסה. לאחר מכן מקום 5 μL של תרבית תאים באותה פינה, כלומר ירידה לקטינים. מערבבים ידי pipetting כמה פעמים ולאחר מכן להפיץ את התא תרבות לקטינים לערבב ברחבי זכוכית לכסות באמצעות צד ארוך של קצה פיפטה. בהתאם לצפיפות של תערובת הסלולרי שלך לעזוב הכל או להתחנף נוזל עודף בפינה הנגדית של הזכוכית המכסה.
7. הנח את מכסה זכוכית, למעלה, עם צד אחד על הזכוכית אובייקטיבי את הצד השני על הספסל. תן זכוכית לכסות יבש קצת לכמה דקות. זה צריך להיות ממש לא יבש לגמרי, אבל זה לא צריך להיות נוזלי יותר מדי על הזכוכית.
8. הנח את מכסה זכוכית עם מלאך 70 ° בקירוב מן הכוס אובייקטיבי על ידי ירידה של EMM. עזוב את מכסה הזכוכית, כך שהוא יפול מלמעלה למטה לתוך ירידה של EMM.
9. כדי לסגור את הקצוות עם גריז סיליקון להכין מזרק 2 מ"ל. חותכים את סוף רחב של טיפ 200 μl וצרף אותו המזרק. מלאו את המזרק עם כ 1 מ"ל של שמן סיליקון. קו דק של סיליקון מוחל על הקצוות של זכוכית המכסה על ידי מוגלה בעדינותהינג את הבוכנה של המזרק. עכשיו יש לכם חדר קטן צמיחה ש pombe תאים.

3. מיקרוסקופיה

1. Initialise מיקרוסקופ פלואורסצנטי ידי הפעלת מנורת כספית / קסנון, את המיקרוסקופ לבין המחשב. מניחים את השמרים צמיחה קאמרית מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש אובייקטיבי או 63 X 100 X מטרה עם NA = 1.3 ומעלה. אם אובייקטיבית שמן משמש, להוסיף שמן.
2. השתמש בשדה בהיר כדי למצוא את התאים לקבל תמונה חדה.
3. ההגדרות עבור מיקרוסקופיה את הקרינה משתנות בהתאם fluorochromes המשמש תווית בתאי שמרים את המיקרוסקופ. אנו משתמשים במיקרוסקופ confocal Zeiss LSM 700 לייזר מיקרוסקופ סריקה באמצעות תוכנית Apochromat-63x עדשה אובייקטיבי שמן (NA = 1.4) עם הגדרת קו 16 מטוס הממוצע סריקה. חריר צריך להיות מוגדר 1-1.1 יחידות אוורירי, אשר נותן פרוסה אופטי של 0.8 מ"מ. אנו מזהים ב-GFP מסלול 1 באמצעות הגדרת מסנן עבור Alexa 488 עם קרן splitter ב 582 ננומטר, ובכך דetecting באורכי גל שבין 488 ו - 582 ננומטר. במסלול 2 אנו משתמשים להגדיר מסנן אופטימלי mCherry באמצעות קרן splitter ב 578 ננומטר, ולכן גילוי באורכי גל שבין 578 ו - 600 ננומטר. פירוש הדבר כי מסלול 2 הן mRFP (SPB) ו NM (mCherry) יזוהו.
4. קח כמו הרבה תמונות צריך להיות מסוגל למדוד ב -60 תאים שונים עבור כל זן. בדרך כלל 15 תמונות של שדות מיקרוסקופיה עצמאי מספיק. מומלץ קאמרית צמיחה חדשים עם תאים טריים הוא עשה, אם הזמן מיקרוסקופיה שלך עולה 60 דקות.

4. מדידה כמותית של המרחקים subcellular

1. פתח את התמונות בתוכנית זן Edition Zeiss אור. באמצעות כלי מדידה למדוד את המרחק בין מיקרומטר fluorochromes שונים כל התאים שבו כל האותות הן במישור מוקד זהה. התאם את עוצמת התאורה ואת הניגודיות לזהות את מרכז האות ניאון. זה פרוטוקול פשוט משתמשת רק שני ג שונהolours ומכאן SPB ו NM הם באותו ערוץ. SPB היא בחרה לצאת ידי המבנה העגול הגדול שלה NM. מעבירים את המרחקים גיליון פנקס. מדוד לפחות 60 תאים. תוכניות אחרות כגון ImageJ יכול לשמש גם למדוד את המרחק, אבל אור Zeiss זן עדיפה בגלל רזולוציה גבוהה יותר של התמונה ואת הקלות כדי להתקרב ולהתרחק באמצעות תוכנית. תמונות בפורמט LSM נפתח ImageJ יהיו שני ערוצים על גבי אחד את השני. כדי ליצור תמונה עם שני הערוצים, קודם לפצל את שני ערוצי ואילך למזג אותם. לאחר מכן הכלי קו ניתן להשתמש כדי למדוד את המרחקים כפי שתואר לעיל.
2. השווה את המרחקים subcellular אומר או החציוני בין זנים וטיפולים שונים באמצעות תוכנית סטטיסטית, למשל מבחן t או Mann-Whitney Test סכום דרגה, למשל באמצעות תוכנה SigmaStat-3.5. לעיתים קרובות המידע אינו מופץ בדרך כלל מאז תהיה בחירה עבור תאים עם קצרהמרחקים בין אותות ניאון מאז כל האותות צריכים להיות במישור המוקד אותו כדי להימדד. מבחן t ניתן להשתמש רק כאשר הנתונים יש התפלגות נורמלית בעוד Mann-Whitney Test סכום דרגה מאפשרת השוואה של סדרות נתונים חוסר ההתפלגות הנורמלית. במבחן-t ממוצע של שני מערכי נתונים שונים מושווים בעוד מבחן מאן ויטני-Sum דרגה החציוני בהשוואה.

5. נציג תוצאות

מסננים PJ1185: (ח ^{+ +} his7: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 ⁺ hphMX6 לאצו] sid4-mRFP: kanMX6 cut11-mCherry: natMX6 ura4-D18 leu1-32-DN ade6 / N) היה גדל EMM . המדגם היה מכונס רכוב בתא גידול קטן צולמו התמונות (איור 1 א + N). לאחר מכן בתקשורת הצמיחה הוחלפה ammoniumchloride EMM w / o (EMM-N), ותאי היו grown במשך 15 דקות תוך כדי רעד. התאים חנקן היו מורעבים רכוב אז בתא עם צמיחה EMM-N והתמונות נלקחו (איור 1A-N). כלי המדידה היה להשתמש בהם כדי למדוד את המרחק בין מוקד (GFP) ו SPB (איור 1B ו טבלה 1). בנוסף, המרחק בין מוקד (GFP) ואת NM נמדדה (איור 1B ו טבלה 2). המרחקים subcellular חציון לפני ואחרי דלדול חנקן הושוו באמצעות תוכנה 3.5 SigmaStat (לוח 3). לא היה שינוי משמעותי סטטיסטית לוקליזציה של אשכול גנים מתרחק NM כלפי SBP. נתוני מדידת המרחק בין ה-GFP לבין SBP היתה התפלגות נורמלית ולכן המרחקים אומר (1.777 מיקרומטר + ​​N ו-N 1587 מיקרומטר) ניתן להשוות באמצעות מבחן t (טבלה 1 ו -3). לא היה הבדל משמעותי בין שני הערכים הממוצעים (P = 0.008, t-test). נתוני מדידת המרחק בין ה-GFP ו NM לא היה לי די נורמליstribution ולכן המרחקים החציוני (0 מיקרומטר + N ו - 0.390 מיקרומטר-N) הושוו באמצעות Mann-Whitney סכום דרגה הבדיקה (טבלה 2 ו -3). לא היה הבדל משמעותי בין שני הערכים החציוני (P <0.001, Mann-Whitney סכום מבחן דרגה).

באיור 1. לוקליזציה של אשכול גנים בשם Chr1, המסומן על ידי ה-GFP, השתנה אחרי הרעבה החנקן. (א) בטור השמאלי, + N, גרעין התא נציג מתא גדל בטור הימני EMM,-N, גרעין התא נציג מתא גדל EMM-N. הירוק הוא אות ה-GFP תיוג אשכול Chr1, אדום הוא mRFP ו mCherry תיוג SPB ו NM, בהתאמה. (ב) לגרעין התא זהה (A), אבל עכשיו עם מרחקים subnuclear נמדד; צהוב: הקוטר של גרעין התא, כחול: המרחק בין SPB ו-GFP האות ורוד: המרחק בין האות ה-GFP ואת קרום הגרעין.

טבלה 1. המרחקים subnuclear נמדד מיקרומטר של זן PJ1185 גדל EMM. שורה ראשונה, בקוטר של התא (ד), בשורה השנייה, המרחק בין ה-GFP לבין SPB, בשורה השלישית, המרחק בין ה-GFP לבין NM.

טבלה 2. המרחקים subnuclear נמדד מיקרומטר של זן PJ1185 גדל EMM-N. שורה ראשונה, בקוטר של התא (ד), בשורה השנייה, המרחק בין ה-GFP לבין SPB, בשורה השלישית, המרחק בין ה-GFP לבין NM.

לוח 3. סטטיסטיקה תיאורית של מרחקים subnuclear שנצפתה זן PJ1185 לפני (+ N) ואחרי (-N) הרעבה חנקן. שורה ראשונה: מספר התא נמדד, שורה שנייה: פירוש (ד) קוטר, שורה שלישית: הקוטר החציוני (ד), ועוד שורה: כלומר המרחק בין ה-GFP ו SPB, שורה חמישית: המרחקים בין חציון GFP ו NM.

Discussion

בעשור האחרון השימוש הדמיה תא חי כדי לפקח על אירועי הסלולר הפך יותר ויותר פופולרי. זה התחיל עם השימוש של חלבון פלואורסצנטי ירוק של מדוזה Aequorea ויקטוריה ועכשיו fluorochromes שונים זמינים פולטי הקרינה באמצעות ספקטרום רחב של ציאן (475 ננומטר) עד כה אדום (648 ננומטר) ^11. אחד היתרונות העיקריים של הדמיה תא חי מעל immunofluorescence היא כי התאים אינם קבועים על ידי פורמלדהיד או אתנול / אצטון טיפול לפני במיקרוסקופ, ומכאן הימנעות חפצים אפשרי מתהליך קיבעון. בנוסף, הדמיה תא חי מציעה את האפשרות לעקוב אחר תאים בודדים לצלם במרווחים תכופים במהלך שעות או ימים של דגירה, כך שניתן לקבל עוד סרטים של אירועים הסלולר ^12. בתאי יונקים יש את היתרון של בעל גודל גדול, עם קוטר של כ -100 מיקרומטר, לעומת תא שמרים קטנים בקוטר של 3-4 על &מו: מ ' מצד שני, היתרון הוא עם שמרים הגנום מניפולציות בקלות. הומולוגיים רקומבינציה מתרחשת ביעילות רבה בשמרים והוא משמש הפתיל חלבונים עניין fluorochromes שונה ^3. יתר על כן, באמצעות שילוב ממוקד של רצפי לאצו וביטוי הבאות של חלבון LacR-GFP מאפשר זיהוי של חלק מסוים של הגנום תוך גרעין התא ^2. באמצעות ס תאים pombe במיקרוסקופ יש יתרונות נוספים שכן הם אורגניזמים unicellular טבעי לגדול עם הזמן דור מהיר בעלות נמוכה תנאי תרבית תאים. יתרה מזאת, ס ' pombe הוא אורגניזם מודל מצוין אוקריוטים שכן יש מטזואניים גנים הומולוגיים.

אחת המגבלות העיקריות של טכניקה זו היא autofluorescence בתא שמרים להפריע לזיהוי של האות נכון. בעיה זו ניתן להתגבר באמצעות התקשורת צמיחה מינימלית עם גלוקוז מעוקרים לסנן במקום autoclaved. בתוךאת השמרים תאים בנוסף צריך להיות מבוגר עבור 2 ימים לפני שלב להיכנס גובר עליהם. הפרוטוקול המובא כאן מציע שיטה פשוטה יחסית, אך עדיין כמותי כדי לקבוע את subcellular לוקליזציה של חלבונים בתוך התא בשמרים. יתר על כן על ידי לצלם בנקודות זמן שונות נוכל לעקוב אירועים הסלולר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lectin	Sigma-Aldrich	L1395
Silicon grease	Dow Corning
Laser scanning microscope LSM 700	Carl Zeiss, Inc.	LSM 700	Other confocal microscope could be used.
SigmaStat3.5	Statcon	SigmaStat3.5	Any software for statistical analysis could be used.