Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Summary

A levedura de fissão,

Abstract

Várias técnicas de microscopia estão disponíveis hoje, que pode detectar uma proteína específica dentro da célula. Durante a última década imagens de células vivas usando fluorocromos como Proteína Fluorescente Verde (GFP) diretamente ligado à proteína de interesse tornou-se cada vez mais populares ^1. Usando GFP e fluorocromos similares a localizações subcelulares e os movimentos de proteínas pode ser detectada em um microscópio fluorescente. Além disso, também a localização subnuclear de uma determinada região de um cromossomo podem ser estudados usando esta técnica. GFP é fundida à proteína repressora Lac (LACR) e ectopicamente expresso na célula onde repetições em tandem da seqüência Laco foi inserido na região de interesse no cromossomo ^2. O LACR-GFP se ligará à repete Laco e que a área do genoma será visível como um ponto verde no microscópio de fluorescência. A levedura é especialmente adequado para este tipo de manipulação desde homólogosrecombinação é muito eficiente e, assim, permite a integração orientada dos repete Laco e proteínas de fusão com GFP engenharia ^3. Aqui nós descrevemos um método quantitativo para análise de células vivas de levedura. Protocolos adicionais para a análise de células vivas de levedura pode ser encontrado, por exemplo, sobre como fazer um filme dos ⁴ comportamento meiótico cromossômicas. Neste experimento em particular nos concentramos na organização subnuclear e como ela é afetada durante a indução de genes. Nomeamos um cluster gene, chamado chr1, pela introdução de sites Laco ligação na vizinhança dos genes. O cluster do gene é enriquecido para genes que são induzidos precocemente durante a fome de nitrogênio de levedura ^5. Na linhagem da membrana nuclear (NM) é marcado pela fixação do mCherry ao Cut11 proteína NM dando origem a um sinal vermelho fluorescente. O eixo Pólo corpo composto (SPB) Sid4 é fundida a uma proteína fluorescente vermelha (Sid4-MRFP) ⁶ 7. O SPB é identificado como uma grande estrutura redonda no NM. Por imagem antes e 20 minutos após o esgotamento da fonte de nitrogênio, podemos determinar a distância entre o grupo de genes (GFP) e NM / SPB. As distâncias médias ou mediana antes e após a depleção de nitrogênio são comparados e podemos, assim, quantificar se há ou não uma mudança na localização subcelular do cluster do gene após a depleção de nitrogênio.

Protocol

1. Cultura de levedura de fissão

1. Prepare Edinburgh Mídia Minimal (EMM) e sem ammoniumchloride EMM (EMM-N) ^8. Para reduzir autofluorescência a solução de glicose não deve ser autoclavado, mas ao invés de filtro esterilizado usando um filtro de 0,2 mm e, posteriormente, adicionadas ao meio autoclavado.
2. Células de levedura de fissão vacinar recém-cultivadas em uma placa de ágar com rich media, YEA ^8, em 3 mL de meio líquido EMM com glicose esterilizados filtro. Use tubos de 13mL com uma leve empurrada na tampa para garantir uma boa ventilação das células. Permitir que as células crescem, agitando-os com 225 rpm em 30 ° C. Manter as células de crescimento em fase log (1 X 10 ⁶ - 2 x 10 ⁷ células / mL) por 2 dias, contando-los usando uma câmara Bürker seguido por diluição adequada, todas as manhãs e à noite.
3. No dia do experimento certifique-se que células na fase log no início, 5 X 10 ⁶ - 1 x 10 ⁷ células / mL.
4. Morrer de fome tele células de nitrogênio durante 20 minutos do interruptor de mídia para EMM EMM-N mídia. Isto é feito através da colheita 3 ml de células em um tubo de 1,5 mL Eppendorf em uma centrífuga de bancada na rcf 1,5 máximo como centrifugação a uma velocidade mais rápida pode induzir uma resposta de estresse na levedura ^9. Use a técnica de duplo giro, o que significa; primeiro giro por 2 min, depois vire o tubo de Eppendorf 180 ° e girar novamente para 1,5 rcf 2 min ^10. Isso ajuda a recolher todas as células em um pellet no fundo do tubo. Lavar uma vez com EMM-N e depois dissolver o sedimento em EMM-N e incubar as células durante 15 minutos a 30 ° C a 225 rpm balançando e depois continuar com o ponto 2. Preparação de amostras.

2. Preparação de amostras

1. ML 1,5 colheita de células em um tubo de 1,5 mL Eppendorf em uma centrífuga de bancada na rcf 1,5 máximo como centrifugação a uma velocidade mais rápida pode induzir uma resposta de estresse na levedura ^9. Use a técnica de dupla fiação, Meaning; primeira rodada por 2 min, depois vire o tubo de Eppendorf 180 ° e girar novamente para 1,5 rcf por 2 min ^10. Isso ajuda a recolher todas as células em um pellet no fundo do tubo.
2. Retire o sobrenadante, mas deixe 10-15 mL e ressuspender as células em meios de comunicação restantes. Alternativamente adicionar 10 mL de mídia fresco para ressuspender o sedimento celular.
3. Certifique-se de ter lâminas de vidro claro e tampa de vidro (Nenhum 1.5). Normalmente você não tem que limpá-los, mas certifique-se que eles não estão cheios de poeira.
4. Retire do freezer uma alíquota de uma solução estoque de 1mg/mL lectina que foi esterilizado por filtração. A solução lectina pode ser novamente congelado algumas vezes. A lectina é usado para corrigir as células de levedura na tampa de vidro.
5. ML lugar 5 de EMM com glicose esterilizados filtro no vidro objetivo.
6. Colocar 5 mL de solução de lectina no canto do vidro da tampa. Posteriormente, colocar 5 mL de cultura de células no mesmo canto, ou seja, a queda lectina. Mix pipetando algumas vezes e, em seguida, espalhar a cultura de células-lectina mix toda a tampa de vidro usando o lado longo da ponta da pipeta. Dependendo da densidade de sua mistura de células deixar tudo ou sugar o excesso de líquido no canto oposto da tampa de vidro.
7. Coloque a tampa de vidro, em cima, com um lado sobre o vidro do objetivo e do outro lado no banco. Deixe a tampa de vidro secar um pouco por alguns minutos. Ele não deve absolutamente ser completamente seco, mas não deve ser muito líquido no vidro.
8. Coloque a tampa de vidro com um anjo · aproximadamente 70 a partir do vidro objetivo pela queda de EMM. Deixe de lado a tampa de vidro de modo que ele vai cair de cima para baixo para a queda de EMM.
9. Para selar as bordas com graxa de silicone preparar uma seringa de 2 ml. Corte a extremidade mais larga de uma ponta de 200 mL e anexá-lo à seringa. Encha a seringa com cerca de 1 mL de graxa de silicone. A linha fina de silício é aplicado para as bordas da tampa de vidro delicadamente pushing o pistão da seringa. Agora você tem uma pequena câmara de crescimento de S. células pombe.

3. Microscopia

1. Inicializar a microscopia de fluorescência, ligando a lâmpada de mercúrio / xenon, o microscópio eo computador. Coloque a câmara de crescimento de levedura no microscópio de fluorescência. Use um objetivo X 63 ou um objetivo X 100 com NA = 1.3 ou superior. Se um objetivo óleo é usado, acrescente o óleo.
2. Use o campo brilhante para encontrar as células e obter uma imagem nítida.
3. As configurações para a microscopia de fluorescência variar dependendo do fluorocromos utilizados para rotular as células de levedura e do microscópio. Nós usamos um microscópio Zeiss LSM confocal Microscópio Laser Scanning 700 com o Plano Apochromat-lens 63x de petróleo objetivo (NA = 1.4) com a configuração de digitalização de 16 linha média avião. O pinhole deve ser definido para 1-1,1 unidades Airy, que dá uma fatia óptica de 0,8 mm. Nós detectar GFP na Pista 1, usando o conjunto de filtro para Alexa 488 com um divisor de feixe de 582 nm, portanto, detecting comprimentos de onda entre 488 e 582 nm. Na Pista 2, usamos um conjunto de filtros ideais para mCherry usando um divisor de feixe de 578 nm, assim, detectar comprimentos de onda entre 578 e 600 nm. Isso significa que, tanto o Track 2 MRFP (SPB) e NM (mCherry) serão detectados.
4. Tome-se como muitas fotos necessárias para ser capaz de medir em 60 células diferentes para cada cepa. Normalmente, 15 fotos de campos de microscopia independentes são suficientes. Recomenda-se que uma câmara de um novo crescimento de células novas é feita se o seu tempo a microscopia exceder os 60 minutos.

4. Medição quantitativa de distâncias subcelulares

1. Abra as fotos no programa Edição Zeiss Zen Light. Usando a ferramenta de medida medições a distância em M entre os fluorocromos diferentes em todas as células, onde todos os sinais estão no mesmo plano focal. Ajustar a intensidade de luz e contraste para identificar o centro do sinal fluorescente. Este protocolo simplificado usa apenas dois diferentes colours e, portanto, o SPB e NM estão no mesmo canal. O SPB é apontada por sua grande estrutura redonda no NM. Transferir as distâncias a uma folha de bloco de notas. Medida em pelo menos 60 células. Outros programas como o ImageJ também poderia ser usado para medir a distância, mas Zeiss Luz Zen é o preferido devido à sua maior resolução da imagem e da facilidade para fazer zoom in e out usando esse programa. Imagens em formato lsm inaugurado em ImageJ terá os dois canais em cima uns dos outros. Para fazer uma foto com os dois canais, primeiro separar os dois canais e depois fundi-los. Posteriormente a ferramenta de linha podem ser usados ​​para medir as distâncias, tal como descrito acima.
2. Compare as distâncias média ou mediana subcelulares entre as diferentes estirpes e tratamentos usando um programa de estatística, por exemplo, t-test ou Mann-Whitney Rank Sum Test, por exemplo, utilizando o software SigmaStat-3.5. Freqüentemente os dados não são normalmente distribuídos uma vez que haverá uma seleção para células com menordistâncias entre os sinais fluorescentes já que todos os sinais precisam estar no mesmo plano focal a ser medido. Um t-teste só pode ser usado quando os dados tem uma distribuição normal, enquanto uma Mann-Whitney Rank Sum Test permite a comparação de conjuntos de dados que a falta de distribuição normal. Em um t-teste a média de dois conjuntos de dados diferentes são comparados ao mesmo tempo em um teste de Mann-Whitney Sum Posição da mediana é comparado.

5. Resultados representante

Strain PJ1185: (h ^{+ +} his7:: dis1placR - GFP chr1 [:: ⁺ ura4 hphMX6 Laco] sid4-MRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18-32 Leu1 ade6-DN / N) foi cultivado em EMM . A amostra foi retirada e montada em uma câmara de crescimento pequenas e fotos foram tiradas (Fig. 1A + N). Posteriormente, o meio de crescimento foi substituído por EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N), e as células foram grown por 15 minutos agitando. As células foram então carente de nitrogênio montado em uma câmara de crescimento com EMM-N e fotos foram tiradas (Fig. 1A-N). A ferramenta de medição foi utilizado para medir a distância entre o locus (GFP) e do SPB (Fig. 1B e Tabela 1). Além disso, a distância entre o locus (GFP) e os NM foi medido (Figura 1B e Tabela 2). As distâncias mediana subcelulares antes e após a depleção de nitrogênio foram comparados utilizando o programa SigmaStat-3.5 software (Tabela 3). Houve uma mudança significativa na localização do cluster gene se afastando do NM para o PAS. Os dados que medem a distância entre o GFP eo PAS teve uma distribuição normal e, portanto, a distância média (1,777 M + N e 1.587 M-N) pode ser comparada usando uma t-teste (Tabela 1 e 3). Houve diferença significativa entre os dois valores médios (P = 0,008, t-test). Os dados que medem a distância entre a GFP e NM não tinha um di normaisstribution e, portanto, as distâncias mediana (0 mM + N e 0,390 M-N) foram comparados utilizando um teste de Mann-Whitney Rank Sum (Tabela 2 e 3). Houve diferença significativa entre os dois valores médios (P <0,001, Mann-Whitney Rank Sum).

Figura 1. A localização de um grupo de genes chamado chr1, marcado por GFP, mudou após a privação de nitrogênio. (A) Coluna da esquerda, + N, um núcleo de célula representante de uma célula criada em coluna da direita EMM,-N, um núcleo de célula representante de uma célula criada em EMM-N. Verde é o sinal de GFP rotulagem do cluster chr1, o vermelho é a MRFP mCherry e rotulagem do SPB e NM, respectivamente. (B) núcleo da célula mesmo que (A), mas agora com medidas distâncias subnuclear; amarelo: o diâmetro do núcleo da célula, azul: a distância entre SPB e sinal de GFP e rosa: a distância entre o sinal de boas práticas agrícolas ea membrana nuclear.

Tabela 1. As distâncias medidas em subnuclear M da cepa PJ1185 cultivadas em EMM. Primeira linha, o diâmetro da célula (d), segunda linha, a distância entre o GFP eo SPB, terceira fileira, a distância entre o GFP eo NM.

Tabela 2. As distâncias medidas em subnuclear M da cepa PJ1185 cultivadas em EMM-N. Primeira linha, o diâmetro da célula (d), segunda linha, a distância entre o GFP eo SPB, terceira fileira, a distância entre o GFP eo NM.

Tabela 3. Estatísticas descritivas das distâncias observadas subnuclear em tensão PJ1185 antes (+ N) e depois (-N) privação de nitrogênio. Primeira linha: número de células medido, segunda linha: diâmetro médio (d) linha, em terceiro lugar: diâmetro médio (d), diante linha: distância média entre a GFP e SPB, quinta linha: distâncias médio entre o GFP e NM.

Discussion

Durante a última década o uso de imagens de células vivas para monitorar eventos celulares tornou-se cada vez mais popular. Tudo começou com o uso de proteína de fluorescência verde da água-viva Aequorea victoria e agora muitos fluorocromos diferentes estão disponíveis através de uma emissão de fluorescência espectro amplo de ciano (475 nm) para vermelho distante (648 nm) ^11. Uma das grandes vantagens de imagens de células vivas por imunofluorescência é que as células não são fixados por formol ou etanol / acetona tratamento antes de microscopia, evitando assim possíveis artefatos do processo de fixação. Além disso, imagens de células vivas oferece a possibilidade de seguir células individuais e tirar fotos em intervalos freqüentes durante horas ou dias de incubação, tornando-se possível obter filmes de eventos celulares ^12. Células de mamíferos têm a vantagem de ter um tamanho maior, com diâmetros de cerca de 100 mm, em comparação com a célula de levedura menor com um diâmetro de cerca de 3-4 emu; m. Por outro lado, a vantagem com o fermento é o genoma facilmente manipulado. Recombinação homóloga ocorre de forma muito eficiente em leveduras e é usado para fundir as proteínas de interesse para diferentes fluorocromos ^3. Além disso, usando a integração de seqüências alvo Laco e posterior expressão da proteína GFP-LACR permite a detecção de uma parte específica do genoma dentro do núcleo da célula ^2. Utilizando S. pombe células em microscopia tem vantagens adicionais, uma vez que são naturais organismos unicelulares que crescem com um tempo de geração rápido em condições de baixo custo de cultura de células. Além disso, S. pombe é um organismo modelo excelente eucarióticas já que tem metazoários genes homólogos.

Uma das principais limitações desta técnica é autofluorescência na célula de levedura perturbar a detecção do sinal de verdade. Este problema pode ser superado usando mídia crescimento mínimo com glicose filtro esterilizado em vez de autoclavado. EmAlém células da levedura devem ser cultivadas por 2 dias na fase de log antes de montá-los. O protocolo aqui apresentado oferece um método relativamente simples, mas ainda não quantitativos para determinar a localização subcelular de proteínas dentro da célula de levedura. Também por tirar fotos em momentos diferentes que podemos seguir eventos celulares.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lectin	Sigma-Aldrich	L1395
Silicon grease	Dow Corning
Laser scanning microscope LSM 700	Carl Zeiss, Inc.	LSM 700	Other confocal microscope could be used.
SigmaStat3.5	Statcon	SigmaStat3.5	Any software for statistical analysis could be used.