Summary
이 프로토콜은 태아의 척추 코드에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유래를 설명하고 이식이나 oligodendrocytic 혈통의 연구 중 체외 유지.
Abstract
이것은 E13 마우스 fetuses의 척수에서 glial 제한된 전구체 (GRP) 세포의 유도를위한 프로토콜입니다. 이러한 세포는 oligodendrocytic 세포 혈통 내에서 초기 엽 성의 전구 물질입니다. 최근 이러한 세포 백질 질환에서 회복 치료를위한 잠재적인 소스로 연구되었습니다. Periventricular leukomalacia (PVL)은 어린 시절의 비 유전자 흰색 물질 질병의 주요 원인이며, 매우 조기 유아의 50 %까지 영향을 미칩니다. 데이터 hypoxia-국소 빈혈로 개발 뇌, 산화 스트레스와 선택적으로 초기 백색 물질을 대상으로 excitotoxicity의 강한 자화율을 제안한다. Glial 제한된 엽 성의 전구 물질 (GRP), oligodendrocyte 전구 세포 (OPC)와 미숙 oligodendrocytes (preOL)는 PVL의 개발에 핵심 선수가 될 것과 지속적인 연구의 주제입니다. 또한, 이전의 연구로 excitotoxicity를 글루 탐 산염하는 자화율 증가하고있다 CNS 조직의 하위 집합을 확인했습니다이 느끼기 쉬운 상태로 발달 패턴뿐. 저희 연구실은 현재 개발 GRP 단계에서 PVL 및 사용 세포의 oligodendrocyte progenitors의 역할을 조사하고 있습니다. 우리는 PVL과 일치 응력을 선택한 그들의 반응을 테스트하기 위해 여러 가지 실험적인 패러다임에서 이러한 파생 GRP 세포를 활용. GRP 세포는 마우스 PVL 모델 및 hypoxia - 국소 빈혈을 포함하여 PVL과 같은 모욕의 체외 모델에서 이식 실험 OPCs 및 preOL으로 체외에서 조작 할 수 있습니다. 교양 세포를 사용하고 시험 관내 연구에서 데이터의 해석을 용이하게 실험 사이의 다양성을 감소시킬 수있을함으로써. 비 GRP 표현형의 세포 오염의 영향을 최소화하면서 배양해 세포는 또한 GRP 인구의 농축을 허용합니다.
Protocol
소개
이 프로토콜에서는 E13 마우스 fetuses의 척수에서 glial 제한된 전구체 (GRP) 세포를 추출 선택하고 플레이트하는 방법을 보여줍니다. 이러한 세포는 oligodendrocytic 및 astrocytic 세포 lineages 내에 조기 엽 성의 전구 물질이며, A2B5 자신의 표현에 의해 정의됩니다. FGF-2와 함께 보충 GRP 매체에서 A2B5 이상의 GRPs는 초기 oligodendrocytic 혈통 마커 PDGFαR 및 NG2 1,2을 표현하기 시작합니다. 이러한 oligodendrocyte 혈통 전지는 별개의 phenotypic 단계, 형태학의 변화뿐만 아니라, 특정 발달 단계에 대한 마커의 표현을 특징으로 그들 각각의 일련의 통과.
이러한 전구체 세포는 현재 다중 경화증, leukodystrophies 및 periventricular leukomalacia (PVL) 3,4,5,6를 포함한 중추 신경계 백질의 질환에서 세포 기반 치료 접근 방법에 대한 잠재적인 소스로 연구되고있다 6,7,8,9에 성공 remyelination를보고했습니다. 이러한 glial 전구체 세포와 같은 척수 손상과 루게릭병 10,11,12,13 등 다른 백질 질환 모델 연구에도 사용되었습니다.
우리 연구실은 우리가 PVL, 뇌성 마비 14,15,16 원인 중 큰 비중의 원기를 회복시키는 방식으로 GRP 세포를 파생 이러한 척수의 효능을 평가하고있는 초기 출생 후의 hypoxia - 국소 빈혈 마우스 모델을 개발했습니다. GRP 세포가 astrocytic 통로 17로 차별화하는 경향을 가지고 있기 때문에 널리 흰색 물질 부상을 연구에 사용되고 있습니다 OPC 모델을 파생 쥐 두뇌도있다. OPC의 표현형 이미 oligodendrocyte 혈통 경로, irreve 보이는 현상을 입력했습니다rsible. 그러나 GRPs 가능성도 E10.5에서 파생된 NEPs 포함한 oligodendrocyte progenitors의 넓은 스펙트럼의 응답을 평가에 관심이 있습니다. 이러한 이유로 우리는 우리의 일에 척수 파생 GRP 모델을 채택했습니다.
전지 교체를위한 GRPs의 사용 이외에 하얀 물질 질환의 야생 유형 및 유전자 변형 쥐 모델에서 이러한 세포의 유도는 체외 환경에서 정상과 질병 상황에서 glial 차별화로 진학이 가능합니다. 이전 간행물은 성숙 의존 글루 탐 산염의 excitotoxicity, 산화 스트레스, 그리고 neuroinflammation 18,19에 연루 선택 요인과 같은 각종 외부 스트레스에 대한 oligodendrocytic 계보 (Lineage) 전구체 세포의 선택적 취약성의 증거를 보여줍니다. 우리의 연구에서 세포의 자화율을 평가,이 흰색 물질 부상의 발전 뒤에 세포와 분자 메커니즘을 이해하는데 초점을 맞추고있다oligodendrocyte 혈통 스펙트럼은 putative 치료 접근법을 분석뿐만 아니라 모욕합니다.
자료
동물과 관련된 모든 절차는 PHS 정책과 JHU IACUC을 따릅니다. 모든 절차는 무균 상태를 유지하기 위해 층류 후드에서 수행해야합니다. 일반적으로 절개는 수평 유동 후드와 수직 흐름 후드의 체외 작업에서 수행됩니다. 모든 미디어는 절개 동안 추위 사용됩니다. 우리의 연구에 사용된 생쥐들은 야생에서 cd-1 변형 및 C57/BL6 배경에 유전자 변형 GFP입니다. 하나의 CD-1 마우스 댐은 일반적으로 종자 1-2 T25 flasks 정도로 10 세 이상의 fetuses를 얻을. 일반적으로, 두 댐은 댐 당 1 T25 플라스크에 풀링된와 도금 시간과 태아의 척추 코드에 희생된다. 일단 세포들이 확대 및 후속 연구를위한 체외로 특성화 수있는 파생되었습니다.
1. 미디어 및 Flasks의 작성
- GRP 주식; N2 (100x, Invitrogen) 건강 보조 식품과 소 혈청 알부민 (BSA, 0.5 % W / V) DMEM / F12 1시 1분 (Invitrogen) + B27 (Invitrogen 50x) : 매체는 해부 매체로 사용됩니다.
- 분리 매체 : 해부 매체와 같은.
- 문화 매체 : GRP 주식 매체 + FGF-2 (10-20 NG / ML, Invitrogen)과 헤파린 (1 μg / ML, 시그마).
- PLL / laminin 코팅 75cm 2 개 25cm 2 flasks (T75 또는 T25).
- 다음 aspirated 1 시간 동안 37 ° C에서 incubated 증류수 H 2 O에서, 조직 문화 flasks (75cm 2, 팔콘)가 15-20μg/ml 폴리-L-라이신 (시그마 PLL)로 코팅했다. Flasks는 PBS 그때 그때 aspirated과 세포 도금이 될 준비가 될 때까지 신선한 PBS 또는 미디어 추가, 1 시간 동안 37 ° C 15-20 μg / PBS에서 ML Laminin (시그마)로 코팅과 함께 1X을 빨기도합니다. 코팅 후, flasks가 건조 허용해서는 안되지만 4에서 PBS 또는 미디어에 보관하실 수 있습니다 사용하기 전에 짧은 기간 동안 ° C에서.에게
2. 계측기 및 기타 Material
- 배양 접시 : 4 당 댐 : 해부 3 배양 접시 (75 ㎜), 수확 척추 코드를 수집하기위한 20 밀리미터 요리.
- 큰 가위 (43 밀리미터 운영 가위, Roboz) 및 댐의 복부를 열고위한 조직 포셉.
- 자궁을 해부하고 fetuses (15mm 마이크로 분석 해 봅시다 가위, Roboz)을 제거하는 소형 가위.
- 마이크로 분석 해 봅시다 봄 가위 (6mm)는 fetuses의 척수를 해부합니다.
- 미세 수술 동안 댐 및 태아의 몸을 고정하고 나중에 한 번 노출된 척수를 제거하기 위해 직각 집게 분석 해 봅시다.
- 40 도금하기 전에 세포 파편을 제거하기 70 마이크로 미터 셀 스트레이너.
- 0.05 %의 트립신은 37 ° C.에 prewarmed
- 10 100x 주식으로 준비 MG / ML DNAse 1 (시그마), (1 G / ML).
- 동물 사체를위한 바이오 위험 가방.
- 처리 15 및 50 ML의 원심 분리기 튜브는 척추 코드를 추출.
3. 초과 저얼 결정egnancy
임신한 마우스 댐이 중 배아 일 E12 또는 집안에서 결정 태아 발달이나 임신의 E13에 납품을 지정 상용 소스에서 정렬됩니다. 간단히 두 여자는 늦은 오후에 한 남성과 함께 배치되며 함께 하룻밤을 떠났어. 다음날 여자는 vaginally있는 점액 플러그의 존재에 대해 관찰하고 있습니다. 점액 플러그 동물 이후 체중 증가의 속도를 모니터링 매일 무게가되도록 짝짓기가 발생했음을에만 표시입니다. 점액 플러그가 관찰되어 하루 배아 첫날 (E1)로 정의됩니다.
4. 조직 유도
- 무균 상태를 유지하는 수평 유동 후드 아래에서 작동합니다.
- 70 % 에탄올로 후드와 작업 공간을 스프레이.
- 압력솥 악기 또는 70 % 에탄올과 후한 스프레이.
- 악기, 미디어, 그리고 사용하기 위해 현미경을 준비합니다.
- 멸균 페트리 디로 차가운 해부 매체 20 ML을 부어쉬.
- 경추 탈구 또는 잘린 뒤에 intraperitoneally를 (IP) 관리 클로랄 하이드 레이트 (500 밀리그램 / ㎏)와 함께 동물을 마취.
- 70~90% 에탄올 (소독)로 댐의 복부 분야를 뿌려서
- 큰 가위와 집게로 복부를 엽니다.
- CD1과 C57/BL6 종자의 경우 : 보통 8-14 fetuses가 자궁 안에있을 것입니다. fetuses의 수는 응력에 의존한다.
- 태아의 혈액과 조직 파편을 씻는 깨끗한 페트리 접시에 신선한 차가운 해부 매체의 새끼과 장소를 포함하여 마우스 자궁의 압축을 풉니다.
- 자궁 나팔에서 각각 태아를 추출하고 작은 가위를 사용하여 배아 SAC와 태반에서 분리. 새로운 배양 접시에 신선한 해부 매체로 추출 fetuses을 전송합니다.
- 해부 매체 신진 대사 활동을 낮추고 파생된 세포의 생존을 보존하기 위해 낮은 온도에 있어야합니다.
- 이 포셉으로 지금부터 작업과마이크로 봄 - 가위를 해부.
- 해부 현미경 하에서 근무, 마이크로 수술 가위와 척수를 노출하기 위해 다시 껍질 피부와 척수를 따라 피부를 잘라.
- 대한 C1에서 microsurgical 가위와 함께 꼬리의 시작 부분에 척수를 가로로 쪼개다.
- 솔직히 포셉와 척수를 제거 모든 뼈 및 연골은 제거됩니다 확인하고 중간을 해부 3 회 배양 접시에 전송할 수 있습니다.
- 이후 세포 배양에 meningeal 조직의 전면에 자라난 것을 방지하기 위해서는 척수에서 가능한 meninges의 정도를 제거하려고합니다. 어렸을때 튀어나와 말초 신경으로 인해이 추출 뇌를에서 meningeal 조직을 제거하는 것보다 더 어렵습니다.
- 일단 meninges가 제거되었으며, 20mm 배양 접시에 척추 코드를 전송
- 철저하게 70~90% 에탄올로 영역을 분사하여 정리.
- 분리를위한 다음 단계는 유지하기 위해 신속하게 이루어져야파생 척수 조직의 높은 생존 능력.
5. 문화 설립
- 트립신은 37 ° CH 2 O-욕조에 적어도 30 분 동안 미리 예열한다. 적절한 나누어지는는 온도 변동에 대한 주식의 노출을 줄이기 위해 주식에서 제거되어야합니다.
- 10ml 사전 예열 트립신 (0.05 %; 품질 체액)이 포함된 50 ML의 원심 관에 수확 척추 코드를 전송 및 100 μl DNAse을 (10 밀리그램 / ML)와 간단히 씹다.
- 37 년에 품어 ° 10 분 CH 2 O - 목욕.
- 씹다 다른 10 분 동안 품어.
- 5 ML GRP 매체 (위에 정의된) 1000 RPM에서 5 분 원심 분리기를 추가합니다.
- 10 ML GRP 매체로 뜨는 및 resuspend 펠렛을 기음과 DNAse-1을 (10 밀리그램 / ML, 시그마) 추가합니다.
- 37 년에 품어 ° 10 분 CH 2 O - 목욕.
- 1,000 rpm으로 5 분 원심 분리기와 뜨는을 기음.
- fre와 Resuspend 펠릿40 쉬 GRP 미디어 다음 필터 파편 - 70 μm의 셀 스트레이너.
- PLL / laminin 코팅 25cm 2 flasks (T25)와 37에서 품어 ° C, 95 % 습도 5 % CO 2의 플레이트.
- 100 % 미디어 하루 다음으로 변경합니다.
- 이 시점에서 GRPs는 첨부 및 프로세스를 확장하기 시작했습니다.
6. GRP 인구를 Immunopanning
- 플라스크까지 PLL / laminin 코팅 flasks의 플레이트 척수 조직 85~90% 합류하거나 일주일 정도입니다.
- 고무 경찰관이나 0.05 %의 트립신과 플라스크를 위해서 힘든하여 수확 세포는 철저히 씹다하지만 부드럽게, 3 ML GRP 매체로 5 분 철저히 resuspend 펠렛 1,000 rpm으로 원심 분리기.
- 세 T25 flasks 또는 3 ML ~ 1 T75 플라스크를 완전히 세포를 덮어 flasks가 80~90%의 합류점에 도달 수 있도록 매체의 적절한 볼륨을 추가 1 ML 각을 전송합니다.
- 매일 미디어를 변경, 빨리 매체는 신속 depletes 경우.
- 문장 세균 PE4에 하룻밤 트라이 요리 (75 ㎜) ° 방지용 마우스 IgM 항체와 C (남부 생명 공학), 10 μg / PBS에서 ML.
- 여분의 버퍼를 대기음하고 PBS로 3 배 페트리 접시를 씻는다.
- 5 μg / 실내 온도 (RT)에서 1 시간 동안 PBS과 부화에 희석 ML의 농도에서 A2B5 항체 (Millipore)를 추가합니다.
- 그리고 플레이트의 건조 방지하기 위해 GRP 매체의 8 ML을 추가 PBS로 다시 배 접시를 씻으십시오.
- 모든 세포를 분리하기 위해 고무 경찰관과 flasks을 위해서 힘든하여 배양 접시와 수확 GRP 세포에서 GRP 매체의 5 ML 전송
- 대단히 짧은 시간을 망쳤으니 A2B5 코팅 세균 배양 접시에 5ml 세포 현탁액을 전송하기 위해 간단히 세포 현탁액을 씹다.
- 떨지 않고 상온에서 1 시간을 품어.
- 1 시간 대기음 매체와 PBS와 8X 세차 번호판 후에.
- 부드럽게 그리고 GRP 매체의 적절한 부피와 PLL / laminin 코팅 접시 또는 flasks로 전학이 ML GRP 미디어 고무 경찰관과 함께 세포를 다쳤어요.
7. 파생된 세포의 동결 및 저장
- 셀은 2 ML 0.05 %의 트립신과 85~90% 합류 T25 또는 T75 플라스크에서 수확된다.
- 트립신은 희석과 inactivated 8ml GRP 주식 매체와 함께 5 분 1,000 rpm으로 centrifuged있다.
- T25 flasks에서 동반한은 1 ML GRP 냉동 매체 (GRP 주식 매체가 10 % (V / V) DMSO와 선택적으로, 20 % FBS과 보완)에 resuspended됩니다. T75 flasks에서 큰 알약은 두 배 희석한다.
- 1.5 세포 현탁액 - 3 × 10 10,11,12,13 세포는 극저온 튜브 (Nalgene)로 전송하며 ° C는 천천히 밤새 얼어 -80에서 이소프로판올를 포함하는 극저온 용기 (Nalgene)에 하룻밤 사이에 저장됩니다.
- 하룻밤 동결 세포를 따라하는 것은 냉장고 박스로 전송하며 -80에서 6 개월 1 년에 저장된 N에서 ° C 또는 장기 (L). 해동 세포는 일반적으로 PLL / laminin 코팅의 품질에 크게 따라 가능한 60-80% 있습니다. 8. 대표 결과
CO 2로 인해 fetuses 궁극적 파생된 세포의 생존 능력에 가능한 하류 효과의 동물을 anesthetizing 사용되지 않습니다. 또한, 너무 파생 과정에서 척수에서 meninges를 제거하는 매우 어려운 것입니다하지만, GRP 매체와 immunopanning의 결합이 빠르게 성장하는 세포를 제거합니다. 마찬가지로, 전체 척수은 그 복부 척수에서 발생하고 dorsally 20 마이 그 레이션으로 인해 GRP 인구의 큰 복부 농도에도 불구하고 수확한다. 그러나 GRP 매체 GRP 표현형 위해 선정하고 해당 인구는 A2B5 immunopanning에 의해 극대화된다. 척수 조직을 도금 후의 체외 배양은 두 구절이나 일주일 incubated됩니다. 문화 2 일 후에 다른 morphologies의 세포는 이종을 나타내는 조직 문화 flasks에서 관찰할 수있다인구는하지만 GRP 매체 geneity은 GRP 표현형 위해 선택합니다. 이러한 세포는 A2B5의 조합 + GRP, e-NCAM +의 연결을 제한 엽 성의 전구 물질 (NRP)와 nestin + A2B5-neuroepithelial 세포 그리고 아마도 fibronectin + meningeal 세포입니다. 또한,보다 성숙한 phenotypes가 시작 이기종 수영장 (그림 1A)에서 고도로 GRP 농축 인구를 극대화하기 위해서는 doublecortin와의 연결을 혈통에 대한 Tuj1, astrocytes에 대한 GFAP 및 oligo의 혈통에 대한 PDGFaR 및 GalC 포함한 현재의 표현 마커가 될 수도 셀 수 세포 밀도가 T75 flasks의 confluency 85-90 % 정도로 증가되면 A2B5 위해 선택 다음에 E-NCAM + 셀 + GRP 인구를 선택하고 제거를 두 번 immunopanned 수 있습니다. 이러한 GRP 전지는 후속 A2B5 immunopanning이 매우 풍부 GRP 인구를 유지하는 데 필요한 수 있도록 oligodendrocyte 표현형위한 선택 배지에 임에도 불구하고 astrocytes가 될 수있는 능력을 유지합니다. Immunopanning gener앨리 수확량 최대 95% A2B5 + 셀하지만 더욱 수율을 위해 A2B5 복합 자석 구슬 (Miltenyi Biotec 주식 회사)가 최대 97 % 수율을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 정기적인 미디어의 변경 등의 유지 보수 GRP 문화에 관심이 아닌 GRP 세포 유형의 확산을 최소화합니다. 비록이없는 상태에서 BMP-4 astrocytes가 여전히 발견 고갈 수 있습니다 특히 미디어 astrocytic 표현형로 분화를 유도하는 것 같습니다. B27 보충제는 트라이 iodothyronine 호르몬을 (T3)가 포함되어 있지만,이 현상이 발생 T3보다 높은 수준이 중간에 추가되는 경우에만, GRP 인구의 oligodendrocytes으로 차별화 할 관찰된 경향도 가본 적이있다. 성숙 oligodendrocytes (그림 1B)에 의한 오염에 대한 우려가있는 경우에는 T3 무료 B27 보충제가 대체하실 수 있습니다. 이러한 GRP 전지는 쉽게 2 ~ 3 짧은 프로세스를 통해 작은 소마들의 형태가 있지만 다른 세포 유형이 존재할 수, IM을위한 화면으로 확인할 수 있습니다munocytochemistry는 이전에 명명된 일반적인 발달 및 세포 유형의 특정 마커에 대해 수행할 수 있습니다. 일반적으로 neuroepithelial (NEP)과 GRP 또는 NRP 중 하나가 될 수 있습니다 A2B5-세포의 작은 영구 인구가 될 것입니다. 다행히 더 이상 세포는 매체가 GRP의 표현형을 선택 것이라는 가능성 GRP 매체에 보관됩니다.
그림은 1.)는 이기종 형태의 도금 척수 세포는 문화가 2 일 후에 관찰된다. 나) Immunopanning가 시작 이기종 풀에서 높은 GRP 강화 인구 극대화.
Discussion
Disclosures
이 연구는 국립 건강 연구소 [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF) 및 R01NS028208 (MVJ)] 및 아동 신경과 재단에 의해 후원되었다. 이 보고서의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 건강의 국립 연구소, DHHS의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 저자들은 본 연구와 관련된 관심 아무런 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 GRP 세포의 사용에 그의 통찰력과 의견 박사 데빈 게리 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/ F12 1:1 | Invitrogen | 11320033 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| rH-FGF-basic | Invitrogen | PHG0026 | |
| Trypsin (0.05%) EDTA | Quality Biological, Inc. | 118-087-721 | |
| POLY-L-LYSINE HBr | Sigma-Aldrich | P1274-25MG | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| Dnase 1 | Sigma-Aldrich | DN25 |
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