Udledning af Glia begrænsede prækursorer fra E13 mus

Summary

Denne protokol beskrives udledning af glial begrænsede prækursorer fra føtale rygmarv og holdes in vitro enten transplantation eller til undersøgelse af oligodendrocytic afstamning.

Abstract

Dette er en protokol til afledning af gliale begrænsede prækursorer (GRP) celler fra rygmarven af ​​E13 musefostre. Disse celler er tidlige forstadier i oligodendrocytic cellelinie. For nylig er disse celler blevet undersøgt som potentiel kilde til genoprettende behandlinger i hvide substans sygdomme. Periventricular leukomalacia (PVL) er den førende årsag til ikke-genetiske hvid substans-sygdom i barndommen og påvirker op til 50% af ekstremt tidligt fødte spædbørn. De data, der tyder på en øget følsomhed over for at udvikle hjernen til hypoxi-iskæmi, oxidativ stress og excitotoxicity der selektivt er rettet mod spirende hvide substans. Gliale begrænsede prækursorer (GRP), oligodendrocyt stamceller (OPC) og umodne oligodendrocytter (preOL) synes at være centrale aktører i udviklingen af ​​PVL, og er genstand for fortsatte undersøgelser. Endvidere har tidligere undersøgelser identificerede en delmængde af CNS-væv, der har øget modtagelighed for glutamat-excitotoksicitet, somsamt en udviklingsmæssig mønster denne modtagelighed. Vores laboratorium undersøger i øjeblikket rolle oligodendrocyt stamfædre i PVL og brug celler på GRP udviklingstrin. Vi benytter disse afledte GRP celler i flere eksperimentelle paradigmer til at teste deres svar at vælge spændinger i overensstemmelse med PVL. GRP celler kan manipuleres in vitro i OPCs og preOL til transplantationsformål eksperimenter med muse pVL modeller og in vitro modeller for PVL-lignende fornærmelser herunder hypoxi-iskæmi. Ved anvendelse af dyrkede celler og in vitro-undersøgelser der ville blive reduceret variation mellem eksperimenter, hvilket letter fortolkning af dataene. Dyrkede celler giver også mulighed for berigelse af GRP befolkningen og samtidig minimere virkningen af ​​kontaminerende celler af ikke-GRP fænotype.

Protocol

Indledning

I denne protokol vi vise, hvordan man uddrage, udvælge og plade gliale begrænsede forløber (GRP) celler fra rygmarven af ​​E13 musefostre. Disse celler er tidlige forstadier i de oligodendrocytic og astrocytisk cellelinier og er defineret ved deres ekspression af A2B5. I GRP medium suppleret med FGF-2, vil A2B5 + GRP begynder at udtrykke den tidlige oligodendrocytic linie markører PDGFαR og NG2 ^1,2. Disse oligodendrocytceller afstamningsceller celler passerer gennem en serie af særskilte fænotypiske faser, som hver af dem er kendetegnet ved morfologiske ændringer, såvel som ekspression af markører til specifikke udviklingsstadier.

Disse precursorceller øjeblikket undersøgt som en potentiel kilde for celle-baserede terapeutiske tilgange i sygdomme i centralnervesystemet hvidt stof, herunder dissemineret sklerose, leukodystrophies og periventricular leukomalacia (PVL) ^3,4,5,6 6,7,8,9. Disse gliale precursorceller er også blevet anvendt i undersøgelser af andre hvid substans-sygdom modeller såsom rygmarvslæsion og amyotrofisk lateral sklerose ^10,11,12,13.

Vores laboratorium har udviklet en tidlig postnatal hypoxi-iskæmi musemodel, som vi evaluerer effekten af disse rygmarven afledt GRP celler som en styrkende tilgang i PVL, den førende årsag til cerebral parese ^14,15,16. Der er også en gnaverhjerne afledt OPC model, der er almindeligt anvendt til at studere hvidt stof skade, da GRP celler har en tendens til at differentiere ind i astrocytisk pathway ^17. OPC fænotype har allerede indtastet oligodendrocyt afstamning vej, et fænomen, der synes irreversible. Men vi er interesseret i at vurdere respons på et bredere spektrum af oligodendrocyt stamfædre, herunder GRP og måske endda NEPS afledt ved E10.5. Af denne grund har vi vedtaget rygmarven afledt GRP model for vores arbejde.

Ud over anvendelsen af GRP til celle udskiftning tillader udledning af disse celler fra vild type og transgene gnavermodeller af hvide substans sygdomme yderligere undersøgelse glial differentiering under normale tilstande og sygdomstilstande i en in vitro miljø. Tidligere publikationer viser tegn på selektiv sårbarhed oligodendrocytic afstamning præcursorceller til forskellige eksterne stressfaktorer såsom modning afhænger glutamatexcitotoksicitet, oxidativ stress, og vælg faktorer impliceret i neuroinflammation ^18,19. Vores undersøgelser har fokuseret på at forstå de cellulære og molekylære mekanismer bag udviklingen af ​​disse hvide substans skader, vurdere følsomheden af ​​celler iden oligodendrocyt afstamning spektret at fornærme samt analysere formodede terapeutiske tilgange.

Materialer

Alle procedurer, der involverer dyr i overensstemmelse med PHS politik og JHU IACUC. Alle procedurer bør udføres i et laminært stinkskab for at opretholde aseptiske forhold. Almindeligvis dissektioner udføres i en horisontal strømning hætte og in vitro arbejde i en lodret strømning hætte. Alle medier bruges koldt under dissektioner. Musene anvendt i vores undersøgelse er en vildtype CD-1 stammen og en transgen GFP i en C57/BL6 baggrund. En CD-1 mus dæmning typisk giver 10 + fostre, som er nok til at frø 1-2 T25 kolber. Typisk anvendes to dæmninger aflives på et tidspunkt og føtale rygmarv puljet og udpladet i en T25 kolbe pr dæmningen. Når cellerne er blevet udledt de kan udvides og karakteriseres in vitro til efterfølgende undersøgelser.

1. Udarbejdelse af medier og kolber

• GRP lagermedium anvendes som dissektionsmedium: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x, Invitrogen) n2 (100x; Invitrogen) kosttilskud og bovint serumalbumin (BSA, 0,5% w / v).
• Dissociation medium: Samme som dissektion medium.
• Dyrkningsmedium: GRP lager medium + FGF-2 (10-20 ng / ml Invitrogen) og heparin (1 ug / ml, Sigma).
• PLL / laminin overtrukne 75 ^cm2 eller 25 ^cm2 kolber (T75 eller T25).
• Vævskulturkolber (75 ^cm2, Falcon) blev coatet med 15-20μg/ml Poly-L-lysin (PLL, Sigma) i destilleret _H2O, inkuberet ved 37 ° C i 1 time og derefter aspireret. Kolberne blev vasket 1 gang med PBS og derefter coatet med 15-20 ug / ml laminin (Sigma) i PBS ved 37 ° C i 1 time, derefter aspireret, og frisk PBS eller medium tilsættes, indtil cellerne er klar til at blive belagt. Efter coating bør kolber aldrig tilladt at tørre, men kan holdes i PBS eller medium ved 4 ° C i korte perioder før brug.

2. Instrumenter og Other Material

• Petriskåle: 4 per Dam: 3 petriskåle til dissektion (75 mm), en 20 mm skål til opsamling af de høstede rygmarven.
• Store sakse (43 mm Operativsystemer saks, Roboz) og væv pincet for at åbne dæmningen s maven.
• Lille saks for dissekere livmoderen og fjernelse af fostrene (15 mm Micro dissekere Saks, Roboz).
• Micro dissekere foråret sakse (6 mm) til at dissekere rygmarven af ​​fostrene.
• Micro dissekere vinklede Tang til forankring dæmningen og fostervægt under operationen og senere fjerne rygmarven gang udsat.
• 40 eller 70 mikrometer celle si til fjernelse af cellerester før udpladning.
• 0,05% trypsin forvarmet til 37 ° C.
• 10 mg / ml DNAse 1 (Sigma), fremstillet som en 100X stamopløsning (1 g / ml).
• Bio-fare taske til dyrekadavere.
• 15 og 50 ml centrifugerør til forarbejdning udvindes rygmarven.

3. Bestemmelse Tidsindstillet Pregnancy

Gravide mus dæmninger er enten bestilles fra kommercielle kilder angiver levering på fosterdag E12 eller E13 på fosterudvikling eller graviditet bestemt in-house. Kort fortalt er to hunner placeres sammen med en mand i den sene eftermiddag og efterladt natten sammen. Den næste dag hunner iagttages for tilstedeværelsen af ​​vaginalt placeret slim prop. Den slim stik er kun en indikation af, at parring fandt sted så dyrene efterfølgende vejes dagligt for at overvåge hastigheden af ​​vægtforøgelse. Dagen slim proppen iagttages er defineret som embryonisk dag (E1).

4. Tissue Udledning

1. Arbejdet skal foregå under et horisontalt flow hætte for at opretholde aseptiske betingelser.
2. Spray ned hætte og arbejdsområde med 70% ethanol.
3. Autoklave instrumenter eller spray rigeligt med 70% ethanol.
4. Forbered instrumenter, medier og mikroskop til brug.
5. Hæld 20 ml kold dissektionsmedium i sterilt Petri dish.
6. Bedøve dyret med chloralhydrat (500 mg / kg) administreret intraperitonealt (IP) efterfulgt af cervikal dislokation eller halshugning.
7. Spray abdominale område af dæmningen med 70-90% ethanol (desinfektion)
8. Åbn maven med stor saks og pincet.
   1. I CD1 og C57/BL6 stammer: Normalt 8 til 14 fostre vil være inde i livmoderen. Antallet af fostre er stammeafhængig.
9. Uddrag musen livmoderen, herunder hvalpene og anbringes i frisk koldt dissektionsmedium i en ren petriskål til at vaske blod og væv snavs fra foster.
10. Uddrag hver fosteret fra livmoderhorn og adskille dem fra den embryonale SAC og placenta ved hjælp af en lille saks. Overfør de udtrukne fostrene i frisk dissektionsmedium i en ny petriskål.
    1. Dissektionsmedium være ved lav temperatur til at sænke metabolisk aktivitet og bevare levedygtigheden af ​​afledte celler.
    2. Arbejdet fra nu af med to pincet ogmikro dissekere forår-saks.
11. Arbejde under dissektion mikroskop, skære huden langs rygmarven med mikro-kirurgiske sakse og skræl hud tilbage for at afdække rygmarven.
12. Tværsnit rygmarven med mikrokirurgiske saksen ved ca C1 og ved begyndelsen af ​​halen.
13. Fjerne rygmarv med stumpe pincet, at alle knogler og brusk fjernes og overføres til ^3. petriskålen dissekere medium.
14. For at forhindre overvækst af meningeal væv i efterfølgende cellekulturer forsøger at fjerne så meget af meninges som muligt fra rygmarven. På grund af de fremspirende udragende perifere nerver er vanskeligere end at fjerne meningeal væv fra ekstraheret cerebrum.
15. Når meninges er blevet fjernet, overføre rygmarve til 20 mm petriskål
16. Oprensning ved grundigt at sprøjte området med 70-90% ethanol.
17. Følgende trin til adskillelse skal gøres hurtigt for at opretholdeen høj levedygtighed afledte rygmarv.

5. Kultur Etablering

1. Trypsin bør forvarmes i mindst 30 minutter i et 37 ° _CH2O-bad. En passende alikvot bør fjernes fra bestanden til at reducere eksponeringen af ​​bestanden for temperatursvingninger.
2. Overføre de høstede rygmarv til et 50 ml centrifugerør indeholdende 10 ml forvarmet trypsin (0,05%; kvalitet Biologicals) og 100 pi DNAse (10 mg / ml) og tritureres kortvarigt.
3. Inkuber i 37 ° _CH2O-bad i 10 minutter.
4. Udrives og inkuber i yderligere 10 minutter.
5. Tilsæt 5 ml GRP medium (defineret ovenfor) og centrifugeres i 5 minutter ved 1000 RPM.
6. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml GRP medium, og der tilsættes DNAse-1 (10 mg / ml, Sigma).
7. Inkuber i 37 ° _CH2O-bad i 10 minutter.
8. Centrifugeres i 5 minutter ved 1000 opm og aspirere supernatant.
9. Resuspender pellet med fresh GRP medium og derefter filter snavs med en 40 til 70 um celle si.
10. Plade på PLL / laminin coatede 25 ^cm2 kolber (T25) og inkuber ved 37 ° C, 95% fugtighed og _5% CO2.
11. 100% medier ændre på følgende dag.
12. På dette tidspunkt, har GRP monteret og begyndte at udvide processer.

6. Immunopanning GRP Befolkning

1. Pladen rygmarv i PLL / laminin overtrukne kolber indtil kolbe er 85-90% sammenflydende eller omkring en uge.
2. Høst celler ved skrabning kolbe med en gummispatel og med 0,05% trypsin, tritureres grundigt, men forsigtigt, centrifugeres ved 1000 rpm i 5 minutter og grundigt resuspender pelleten med 3 ml GRP medium.
3. Overfør 1 ml hver til 3 T25 kolber eller 3 ml til en T75 kolbe tilsættes passende rumfang medium til fuldstændigt at dække celler og tillade kolber for at nå 80-90% konfluens.
4. Skift medier hver anden dag, tidligere, hvis mediet opbruger hurtigt.
5. Coat Bakteriologisk Petri retter (75 mm) natten over ved 4 ° C med et anti-muse-IgM-antistof (Southern Biotech), 10 ug / ml i PBS.
6. Aspirer overskydende buffer og vask petriskåle 3x med PBS.
7. Tilsættes A2B5-antistoffet (Millipore) ved en koncentration på 5 ug / ml fortyndet i PBS og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur (RT).
8. Pladerne skylles igen 3x med PBS derefter tilsættes 8 ml GRP medium for at forhindre udtørring af pladen.
9. Overfør 5 ml GRP medium fra petriskåle og høst GRP celler ved skrabning kolber med en gummispatel for at frigøre alle celler
10. Tritureres cellesuspension kortvarigt at opbryde klumper og overføre 5ml cellesuspension til A2B5 overtrukne bakteriologiske Petriskåle.
11. Inkuber 1 time ved stuetemperatur uden omrystning.
12. Efter 1 time Aspirer medier og Pladerne skylles 8x med PBS.
13. Forsigtigt skrabe celler med en gummi politimand i 2 ml GRP medier og derefter overføre til PLL / laminin plader eller kolber med passende mængde GRP medium.

    7. Frysning og opbevaring af afledte celler

    1. Celler høstes fra en 85-90% konfluente T25 eller T75 kolbe med 2 ml 0,05% trypsin.
    2. Trypsin fortyndes og inaktiveres med 8 ml GRP lager medium og centrifugeret ved 1000 rpm i 5 min.
    3. Pellets fra T25 kolber resuspenderet i 1 ml GRP frysemedium (GRP lager medium suppleret med 10% (v / v) DMSO og eventuelt 20% FBS). De større pellets fra T75 kolber fortyndes to gange.
    4. Cellesuspensioner af 1,5 - 3 x 10 ^10,11,12,13 celler overføres til kryogene hætteglas (Nalgene) og opbevaret natten over i en kryogen beholder (Nalgene) indeholdende isopropanol ved -80 ° C langsomt fryse natten over.
    5. Efter natten fryse celler overføres til fryser kasser og opbevares 6 måneder til 1 år ved -80 ° C eller længere sigt i N _(l). Optøede celler er typisk 60-80% levedygtige stort set afhængigt af kvaliteten af ​​PLL / laminin coating.
    8. Repræsentative resultater

    CO ₂ ikke anvendes til bedøvelse af dyret på grund af den mulige nedstrøms effekt på levedygtigheden af fostre og i sidste ende de afledte celler. Endvidere vil det være meget vanskeligt at fuldstændig fjerne meninges fra rygmarv under udledningen procedure, men kombinationen af ​​GRP medium og immunopanning vil eliminere disse hurtigt voksende celler. Tilsvarende er hele rygmarven høstet trods større ventral koncentration af GRP population på grund af sin oprindelse i det ventrale rygmarv og migrerer dorsalt ^20. Men GRP mediet vælger for GRP fænotype, og at befolkningen er maksimeres ved A2B5 immunopanning. Efter udpladning rygmarvsvæv, er in vitro-kulturer inkuberet i to passager eller omkring en uge. Efter 2 dage i kultur, kan celler af forskellige morfologier kan observeres i vævskulturkolber angiver heterohomogent befolkningen, men GRP medium selekterer for GRP fænotype. Disse celler er en kombination af A2B5 + GRP, E-NCAM + neuronale begrænsede forstadier (NRP) og Nestinmarkøren + og A2B5-neuroepitelceller og eventuelt fibronektin + meningeal celler. Derudover kan mere modne fænotyper være til stede som udtrykker markører, herunder doublecortin og Tuj1 for neuronal afstamning, GFAP for astrocytter og PDGFaR og GalC for oligo linie for at maksimere en yderst GRP beriget population af udgangsmaterialet heterogene pool (figur 1A), celler kan være dobbeltstrenget immunopanned at udvælge og fjerne de E-NCAM +-celler efterfulgt af selektion for A2B5 + GRP population, når celledensiteten er steget til ca 85-90% konfluens i T75-kolber. Disse GRP celler bevarer deres evne til at blive astrocytter selvom det er i et medium, der selekterer for oligodendrocyt fænotype så efterfølgende A2B5 immunopanning kan være nødvendigt at opretholde et højt beriget GRP population. Immunopanning geneallierede udbytter op til 95% A2B5 +-celler, men endnu større udbytte A2B5 konjugerede magnetiske perler (Miltenyi Biotec Inc.) kan anvendes til at tilvejebringe et udbytte på op til 97%. Årvågenhed i forbindelse med vedligeholdelse GRP kulturer såsom regelmæssige medier ændringer vil minimere spredning af ikke-GRP celletyper. Selv i fravær af BMP-4 astrocytter stadig kan findes, og depleteret medier især synes at inducere differentiering til en astrocytisk fænotype. Selv om B27 supplement indeholder tri-iodthyronin hormon (T3), har der ikke været observeret tendens til at differentiere til oligodendrocytter i GRP populationen, når højere niveauer af T3 tilsættes til mediet betyder dette fænomen forekommer. Imidlertid kan en T3 frit B27 supplement kan være substitueret, hvis der er et problem for kontaminering af modne oligodendrocytter (figur 1B). Disse GRP celler kan let identificeres ved deres morfologi af små soma med 2 eller 3 korte processer, men at screene for andre celletyper, der kan være til stede, immunocytochemistry kan udføres for de tidligere nævnte fælles udviklingsmæssige og celletype-specifikke markører. Der vil sædvanligvis være en lille vedvarende population af A2B5-celler, som er neuroepitel (NEP), og som kan blive enten GRP eller NRP. Heldigvis er de længere cellerne opretholdt i GRP medium mere sandsynligt, at mediet kan vælges til GRP fænotype.

    

    Figur 1. A) belagte rygmarv celler heterogene morfologi observeret efter 2 dage i kultur. B) Immunopanning maksimerer en meget GRP-beriget population fra udgangsmaterialet heterogene pool.

Discussion

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/ F12 1:1	Invitrogen	11320033
B27	Invitrogen	17504044
N2	Invitrogen	17502048
rH-FGF-basic	Invitrogen	PHG0026
Trypsin (0.05%) EDTA	Quality Biological, Inc.	118-087-721
POLY-L-LYSINE HBr	Sigma-Aldrich	P1274-25MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
Dnase 1	Sigma-Aldrich	DN25