Summary
Ce protocole décrit la dérivation de précurseurs gliales fœtales restreintes de la moelle épinière et maintenues in vitro, soit à la transplantation ou à l'étude de la lignée oligodendrogliome.
Abstract
Il s'agit d'un protocole pour la dérivation de la gliales restreints précurseurs (GRP), les cellules de la moelle épinière de fœtus de souris E13. Ces cellules sont les signes précurseurs de la lignée cellulaire oligodendrogliome. Récemment, ces cellules ont été étudiées en tant que source potentielle de thérapies réparatrices dans les maladies de la substance blanche. Leucomalacie périventriculaire (PVL) est la principale cause de non-maladie génétique de la substance blanche dans l'enfance et touche jusqu'à 50% des grands prématurés. Les données suggèrent une sensibilité accrue du cerveau en développement à l'hypoxie-ischémie, le stress oxydatif et l'excitotoxicité qui cible sélectivement naissante de la substance blanche. Gliales précurseurs restreintes (GRP), des cellules progénitrices oligodendrocytes (OPC) et les oligodendrocytes immatures (preOL) semblent être des acteurs clés dans le développement de PVL et font l'objet de poursuite d'études. En outre, des études antérieures ont identifié un sous-ensemble du tissu du SNC qui a augmenté la sensibilité au glutamate excitotoxicité queainsi que d'un modèle de développement à cette sensibilité. Notre laboratoire étudie actuellement le rôle de progéniteurs d'oligodendrocytes dans les cellules PVL et l'utilisation à l'étape de GRP de développement. Nous utilisons ces cellules dérivées GRP dans plusieurs paradigmes expérimentaux pour tester leur réaction à sélectionner des contraintes compatibles avec PVL. Cellules GRP peut être manipulé in vitro dans les OPC et preOL pour des expériences de transplantation avec des modèles de souris et de PVL dans les modèles in vitro de PVL-comme les insultes, y compris l'hypoxie-ischémie. En utilisant des cellules en culture et dans les études in vitro il serait réduit la variabilité entre les expériences qui facilite l'interprétation des données. Les cellules cultivées permet également à l'enrichissement de la population GRP, tout en minimisant l'impact de contaminer les cellules de phénotype non-GRP.
Protocol
Introduction
Dans ce protocole, nous montrons comment extraire, sélectionnez et la plaque gliales restreints précurseurs (GRP), les cellules de la moelle épinière de fœtus de souris E13. Ces cellules sont les signes précurseurs au sein des lignées cellulaires oligodendrogliome et astrocytaire et sont définies par leur expression de A2B5. Dans le milieu de GRP complétée avec le FGF-2, les A2B5 GRP + seront commencer à exprimer au début des années oligodendrogliome lignée marqueurs PDGFαR et NG2 1,2. Ces cellules de la lignée des oligodendrocytes passer à travers une série de phases distinctes phénotypiques, chacun d'eux caractérise par des changements morphologiques, ainsi que l'expression de marqueurs spécifiques à des stades de développement.
Ces cellules précurseurs sont actuellement à l'étude comme une source potentielle pour la cellule à base approches thérapeutiques dans les troubles de la question du système nerveux central blanc, y compris la sclérose en plaques, les leucodystrophies et la leucomalacie périventriculaire (PVL) 3,4,5,6 6,7,8,9. Ces cellules précurseurs gliales ont aussi été utilisés dans les études d'autres modèles blancs maladie de la substance comme lésion de la moelle épinière et la sclérose latérale amyotrophique 10,11,12,13.
Notre laboratoire a mis au point un premier modèle de la souris postnatale hypoxie-ischémie avec laquelle nous évaluons l'efficacité de ces cellules dérivées moelle épinière GRP comme une approche réparatrice en PVL, la principale cause de la paralysie cérébrale 14,15,16. Il ya aussi un cerveau de rongeur modèle dérivé OPC qui a été largement utilisé pour l'étude des blessures de la substance blanche, car les cellules GRP ont tendance à se différencier en la voie astrocytaire 17. Le phénotype OPC est déjà entré dans la voie de la lignée des oligodendrocytes, un phénomène qui semble irreversible. Cependant, nous sommes intéressés à évaluer la réponse d'un spectre plus large de progéniteurs d'oligodendrocytes, y compris PEB et peut-être même les PES dérivés à E10.5. Pour cette raison, nous avons adopté la moelle épinière provenant modèle GRP pour notre travail.
En plus de l'utilisation de PEB pour le remplacement des cellules, la dérivation de ces cellules de type sauvage et des modèles de rongeurs transgéniques des maladies de la substance blanche permet une étude plus approfondie dans la différenciation gliale dans des conditions normales et la maladie lors d'un réglage in vitro. Les publications précédentes montrent des signes de vulnérabilité sélective des cellules précurseurs oligodendrogliome lignée à divers facteurs de stress extérieurs tels que l'excitotoxicité du glutamate de maturation dépend, stress oxydatif, et les facteurs impliqués dans certains neuroinflammation 18,19. Nos études ont porté sur la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendent le développement de ces blessures de la substance blanche, d'évaluer la sensibilité des cellules àle spectre lignée oligodendrocyte d'insulter ainsi que l'analyse des approches thérapeutiques putatifs.
Matériels
Toutes les procédures impliquant des animaux conformes à la politique du PHS et le JHU IACUC. Toutes les procédures doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire afin de maintenir des conditions d'asepsie. Couramment dissection sont réalisées dans une hotte à écoulement horizontal et dans travail vitro dans une hotte à écoulement vertical. Tous les médias utilisés à froid pendant des dissections. Les souris utilisées dans notre étude sont d'un type sauvage souche CD-1 et une GFP transgénique dans un contexte C57/BL6. Un CD-1 du barrage de la souris donne généralement de 10 foetus + qui sont suffisants pour semences 1-2 flacons T25. En règle générale, deux barrages sont sacrifiés à la fois et la moelle épinière du fœtus en commun et étalées dans 1 flacon T25 par barrage. Une fois que les cellules ont été obtenues, ils peuvent être étendues et caractérisées in vitro pour des études ultérieures.
1. Préparation des milieux et des flacons
- GRPmilieu est utilisé comme milieu de dissection: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x; Invitrogen) N2 (100x; Invitrogen) Suppléments et l'albumine sérique bovine (BSA; 0,5% p / v).
- Du milieu de dissociation: même milieu de dissection.
- Le milieu de culture: milieu de stock de GRP + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) et l'héparine (1 pg / ml; Sigma).
- PLL / laminine enrobés 75 cm 2 ou 25 cm 2 flacons (T75 ou T25).
- Flacons de culture cellulaire (75 cm 2, Falcon) ont été recouvertes de 15-20μg/ml poly-L-lysine (PLL; Sigma) dans H 2 O distillée, incubées à 37 ° C pendant 1 heure puis aspiré. Flacons sont lavées avec du PBS 1X, puis recouverte d'pg 15-20 / ml laminine (Sigma) dans du PBS à 37 ° C pendant 1 heure, ensuite aspiré et du PBS frais ou les médias ajouté jusqu'à ce que les cellules sont prêtes à être plaquée. Après revêtement, flacons ne devraient jamais être autorisés à sécher, mais peuvent être conservés dans du PBS ou des médias à 4 ° C pendant de brèves périodes avant de les utiliser.
2. Instruments et M Autreatériel
- Des boîtes de Pétri: 4 par des barrages: 3 boîtes de Pétri pour dissection (75 mm), un plat de 20 mm pour la collecte des cordes récoltées épinière.
- Grands ciseaux (43 mm de ciseaux d'exploitation, Roboz) et une pince pour ouvrir l'abdomen tissus du barrage s.
- Petit ciseaux pour disséquer l'utérus et d'éliminer les fœtus (15 mm Micro Ciseaux à dissection, Roboz).
- Micro ciseaux printemps dissection (6 mm) pour disséquer la moelle épinière des fœtus.
- Micro Pinces à disséquer angle pour l'ancrage du corps du barrage et du foetus pendant la chirurgie et plus tard de retirer la moelle épinière une fois exposé.
- 40 ou 70 tamis cellulaire micromètre pour éliminer les débris cellulaires avant l'ensemencement.
- Trypsine 0,05% préchauffé à 37 ° C.
- 10 mg / ml de DNAse 1 (Sigma), préparé comme un stock 100x (1 g / ml).
- Bio-Hazard sac pour cadavres d'animaux.
- 15 et 50 tubes à centrifuger ml pour le traitement des extraits de la moelle épinière.
3. Déterminer Timed Pregnancy
Barrages de souris enceintes sont soit commandés auprès de sources commerciales précisant la livraison le jour embryonnaire E12 ou E13 du développement du fœtus ou de grossesse constatée dans la maison. En bref, deux femelles sont placés ensemble avec un mâle dans l'après-midi et laissé une nuit ensemble. Le lendemain, les femelles sont observées pour la présence du bouchon muqueux situé par voie vaginale. Le bouchon muqueux est seulement une indication que l'accouplement a eu lieu pour que les animaux sont ensuite pesés quotidiennement pour surveiller le rythme d'augmentation du poids. Le jour où le bouchon muqueux est observé est défini comme jour embryonnaire un (E1).
4. Dérivation des tissus
- Travailler sous une hotte à flux horizontal pour maintenir des conditions aseptiques.
- Vaporiser en bas de la hotte et la zone de travail avec de l'éthanol 70%.
- Instruments autoclave ou pulvérisation généreusement avec de l'éthanol 70%.
- Préparer les instruments, les médias et d'un microscope à l'emploi.
- Verser 20 ml de milieu de dissection froide dans Petri stérile dish.
- Anesthésier animal avec l'hydrate de chloral (500 mg / kg) administré par voie intrapéritonéale (IP), suivie par dislocation cervicale ou décapitation.
- Vaporisez la région abdominale de la mère avec de l'éthanol à 70-90% (désinfection)
- Ouvrez l'abdomen avec des ciseaux et des pinces grande.
- En CD1 et C57/BL6 souches: Habituellement 8 à 14 fœtus sera à l'intérieur de l'utérus. Le nombre de fœtus est la souche dépendante.
- Extrait de l'utérus de souris, y compris les bébés et les placer dans un milieu de dissection douce froide dans un boîte de Petri propre pour se laver du sang et des débris de tissus du foetus.
- Extrait chaque fœtus de la corne utérine et les séparer de la sac embryonnaire et le placenta à l'aide des petits ciseaux. Transfert des foetus extraits dans le milieu de dissection frais dans un nouveau plat de Petri.
- Milieu de dissection devrait être à basse température pour réduire l'activité métabolique et préserver la viabilité des cellules dérivées.
- Travailler à partir de maintenant avec deux pinces etmicro dissection printemps-ciseaux.
- De travail sous le microscope de dissection, couper la peau le long de la moelle épinière avec des ciseaux chirurgicaux micro et la peau peler pour exposer la moelle épinière.
- Sectionner la moelle épinière avec les ciseaux de microchirurgie à environ C1 et au début de la queue.
- Retirer la moelle épinière avec le forceps émoussé, s'assurer que tous les os et le cartilage sont enlevés et de transférer au 3 boîtes de Pétri de disséquer moyennes.
- Pour prévenir la prolifération de tissu méningé dans les cultures cellulaires ultérieures essayer d'enlever une grande partie des méninges que possible de la moelle épinière. En raison des nerfs périphériques naissantes saillantes ce qui est plus difficile que l'élimination du tissu méningé de cerveau extrait.
- Une fois méninges ont été enlevés, le transfert de la moelle épinière à 20 mm boîte de Pétri
- Nettoyez à fond par la pulvérisation de la zone avec de l'éthanol à 70-90%.
- Les étapes suivantes pour la dissociation doit être fait rapidement pour maintenirune viabilité élevée de la moelle épinière dérivée.
5. Mise en place de la culture
- La trypsine doit être préchauffée pendant au moins 30 min à 37 ° CH 2 O-bain. Une partie aliquote appropriée devrait être retiré du stock afin de réduire l'exposition de stock aux variations de température.
- Transférer les cordons médullaires récoltés dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 10 ml préchauffé trypsine (0,05%; qualité des produits biologiques) et 100 ul DNAse (10 mg / ml) et triturer brièvement.
- Incuber à 37 ° CH 2 O-marie pendant 10 minutes.
- Triturer et incuber pendant encore 10 min.
- Ajouter 5 ml GRP moyen (défini ci-dessus) et centrifuger pendant 5 min à 1000 RPM.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension culot avec 10 ml de GRP moyen et ajouter DNAse-1 (10 mg / ml; Sigma).
- Incuber à 37 ° CH 2 O-marie pendant 10 minutes.
- Centrifuger 5 min à 1000 RPM et aspirer le surnageant.
- Resuspendre le culot avec fréquencesh GRP moyen, puis les débris du filtre avec un 40 à 70 um tamis cellulaire.
- Plaque sur PLL / laminine revêtu flacons de 25 cm2 (T25) et incuber à 37 ° C, humidité 95% et 5% de CO 2.
- 100% des médias changer à la suite de la journée.
- À ce stade, GRP ont attachés et ont commencé à étendre les processus.
6. Immunopanning la population GRP
- Tissus de la moelle épinière dans la plaque PLL / laminine flacons revêtu jusqu'à flacon est de 85-90% de confluence, soit environ une semaine.
- Cellules de récolte par grattage ballon avec une spatule en caoutchouc ou avec de la trypsine 0,05%, triturer à fond, mais doucement, centrifuger à 1000 tours par minute pendant 5 minutes et de manière approfondie Resuspendre le culot avec 3 ml GRP moyen.
- Transférer 1 ml de chaque à 3 flacons T25 ou 3 ml à 1 flacon T75 ajouter des volumes appropriés du milieu pour couvrir complètement les cellules et permettre flacons pour atteindre la confluence de 80-90%.
- Changer les médias tous les jours, plus tôt si le support épuise rapidement.
- Manteau bactériologiques Peplats tri (75 mm) une nuit à 4 ° C avec un anticorps anti-IgM de souris (Southern Biotech), 10 ug / ml dans du PBS.
- Aspirer le tampon en excès et se laver les boîtes de Pétri 3x avec du PBS.
- Ajouter A2B5 anticorps (Millipore) à une concentration de 5 ug / ml dilué dans du PBS et laisser incuber pendant 1 heure à température ambiante (RT).
- Laver les plaques avec du PBS à nouveau 3x puis ajoutez 8 ml de milieu GRP pour éviter le dessèchement de la plaque.
- Transférer 5 ml de milieu de GRP à partir des boîtes de Pétri et les cellules GRP récolte en grattant flacons avec une spatule en caoutchouc pour détacher toutes les cellules
- Triturer suspension cellulaire brièvement pour briser les mottes et de transférer 5 ml de suspension cellulaire aux A2B5 enduits bactériologiques des boîtes de Pétri.
- Incuber 1 h à température ambiante sans agitation.
- Après 1 h aspirés médias et des plaques de lavage avec du PBS 8x.
- Grattez délicatement les cellules avec une spatule en caoutchouc en 2 médias ml GRP puis transfert à PLL / laminine plaques revêtues ou flacons avec le volume approprié de milieu GRP.
7. Congélation et de stockage de cellules dérivées
- Les cellules sont récoltées à partir d'un 85-90% de confluence T25 ou T75 flacon avec 2 ml de trypsine 0,05%.
- La trypsine est dilué et inactivé avec un milieu de 8ml de stock GRP et centrifugé à 1000 tours par minute pendant 5 min.
- Pellets de flacons T25 sont remises en suspension dans 1 ml de milieu de congélation GRP, (moyenne de stock GRP supplémenté avec 10% (v / v) de DMSO et, éventuellement, FBS 20%). Les granulés de grands flacons T75 sont dilué deux fois.
- Des suspensions cellulaires de 1,5 - 3 x 10 10,11,12,13 cellules sont transférés dans des flacons cryogéniques (Nalgene) et stockée pendant la nuit dans un récipient cryogénique (Nalgene) contenant de l'isopropanol à -80 ° C à geler toute la nuit lentement.
- Après une nuit de gel cellules sont reportées dans les cases de congélation et stockées 6 mois à 1 an à -80 ° C ou à plus long terme en N (l). Les cellules décongelées sont généralement 60-80% viable dépend en grande partie sur la qualité du revêtement PLL / laminine. 8. Les résultats représentatifs
CO 2 n'est pas utilisé pour anesthésier l'animal en raison de l'effet possible en aval sur la viabilité des fœtus et, finalement, les cellules dérivées. En outre, il sera très difficile d'éliminer totalement les méninges de la moelle épinière au cours de la procédure de dérivation, mais la combinaison de milieu GRP et immunopanning permettra d'éliminer ces cellules à croissance rapide. De même, le cordon médullaire est récolté toute en dépit d'une plus grande concentration ventrale de la population GRP en raison de sa originaires de la moelle épinière ventrale et dorsale migration 20. Toutefois, le milieu de GRP sélectionne pour le phénotype GRP et que la population est maximisée par A2B5 immunopanning. Après étalement des tissus de la moelle épinière, les cultures in vitro sont incubées pendant deux passages, soit environ une semaine. Après 2 jours de culture, les cellules de morphologies différentes peuvent être observées dans les flacons de culture tissulaire indiquant l'hétérohétérogénéité de la population, mais le milieu de GRP sélectionne pour le phénotype GRP. Ces cellules sont une combinaison de A2B5 + de fibre de verre, E-NCAM + de neuronales précurseurs restreintes (PNR) et nestine +, des cellules neuro-A2B5 et éventuellement la fibronectine + méningés cellules. En outre, les phénotypes les plus matures peuvent être présents y compris les marqueurs exprimant doublecortine et Tuj1 pour la lignée neuronale, GFAP pour les astrocytes et PDGFaR et GalC pour la lignée oligo Afin de maximiser hautement enrichi GRP de la population de la piscine à partir hétérogène (figure 1A), les cellules peuvent être à double-immunopanned pour sélectionner et d'éliminer les E-NCAM + de cellules suivie par la sélection pour la A2B5 + de la population GRP fois la densité des cellules a augmenté à environ 85-90% de confluence dans des flacons T75. Ces cellules GRP maintenir leur capacité à devenir des astrocytes en dépit d'être dans un milieu qui sélectionne pour le phénotype des oligodendrocytes afin ultérieure A2B5 immunopanning peut être nécessaire pour maintenir une population hautement enrichi GRP. Immunopanning GENERrendements allié jusqu'à 95% A2B5 + de cellules, mais pour le rendement encore plus A2B5 billes magnétiques conjuguées (Miltenyi Biotec Inc) peut être utilisé pour fournir un rendement de jusqu'à 97%. Vigilance dans les cultures GRP de maintenance telles que les changements de supports réguliers permettra de minimiser la prolifération des types de cellules non-GRP. Même en l'absence de la BMP-4 astrocytes peuvent encore être trouvés et appauvri les médias, en particulier, semble induire la différenciation d'un phénotype astrocytaire. Bien que le supplément B27 contient l'hormone de tri-iodothyronine (T3), il n'y a pas la tendance observée à se différencier en oligodendrocytes dans la population GRP, uniquement lorsque des niveaux plus élevés de T3 sont ajoutés au milieu de ce phénomène ne se produit. Toutefois, un T3 libre B27 supplément peut être substitué si il ya une préoccupation pour la contamination par les oligodendrocytes matures (figure 1B). Ces cellules GRP peuvent être facilement identifiés par leur morphologie du soma petite avec 2 ou 3 processus courts, mais à l'écran pour d'autres types cellulaires qui peuvent être présents, immunocytochemistry peut être effectuée que pour les communes précédemment cités marqueurs de type de développement et de la cellule spécifiques. Il y aura généralement une petite population persistante de A2B5 des cellules qui sont neuroépithéliale (NEP) et capable de devenir soit GRP ou PNR. Heureusement, les cellules les plus longues sont maintenues dans le milieu GRP plus il est probable que le milieu sera sélectionné pour le phénotype GRP.
Figure 1. A) plaqué cellules de la moelle épinière de morphologie hétérogène sont observées après 2 jours de culture. B) Immunopanning maximise une très GRP enrichi la population de la piscine à partir hétérogène.
Discussion
Disclosures
Cette étude a été financée par le National Institute of Health [P30HD024061 NICHD (AWP), NINDS K08NS063956 (AF), et R01NS028208 (MVJ)] et la Fondation Child Neurology. Le contenu de ce rapport n'engagent que la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national de la Santé, DHHS. Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt pertinent pour cette étude.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Gary Devin pour sa perspicacité et une rétroaction sur l'utilisation de cellules GRP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/ F12 1:1 | Invitrogen | 11320033 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| rH-FGF-basic | Invitrogen | PHG0026 | |
| Trypsin (0.05%) EDTA | Quality Biological, Inc. | 118-087-721 | |
| POLY-L-LYSINE HBr | Sigma-Aldrich | P1274-25MG | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| Dnase 1 | Sigma-Aldrich | DN25 |
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