הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ E13 עכברים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ מיתרי השדרה העובר ומתוחזק במבחנה או להשתלה או למחקר של שושלת oligodendrocytic.

Abstract

זהו פרוטוקול הגזירה של גליה מוגבלים (GRP) תאים מבשר של חוט השדרה של E13 עוברים עכבר. תאים אלה הם סימנים מקדימים המוקדמות בתוך השושלת תא oligodendrocytic. לאחרונה, תאים אלה נחקרו כמקור פוטנציאלי עבור טיפולים משקמות מחלות החומר הלבן. Leukomalacia periventricular (PVL) הוא הגורם המוביל של המחלה לא גנטית החומר הלבן בילדות ומשפיע עד 50% של פגים ביותר. הנתונים מראים רגישות מוגברת של המוח המתפתח כדי איסכמיה היפוקסיה, סטרס חמצוני excitotoxicity כי סלקטיבי מכוון בחומר הלבן המתהווה. מבשרי מוגבלים גליה (GRP), ובתאים oligodendrocyte (OPC) ו oligodendrocytes לא מפותחים (preOL) נראה כי שחקני מפתח בהתפתחות PVL והם הנושא של לימודי המשך. יתר על כן, מחקרים קודמים זיהו קבוצת משנה של רקמת מערכת העצבים המרכזית אשר עלתה הרגישות גלוטמט excitotoxicity כמוגם תבנית התפתחותית לרגישות זו. המעבדה שלנו חוקרים כעת את התפקיד של אבות oligodendrocyte בתאים PVL ושימוש בשלב GRP של התפתחות. אנו מנצלים את התאים האלה GRP הנגזרות פרדיגמות הניסוי לבדוק כמה תגובתם בחר מדגיש בקנה אחד עם PVL. תאים GRP ניתן להשפיע במבחנה אל OPCs ו preOL לניסויים השתלת עם מודלים העכבר PVL ו במודלים חוץ גופית של PVL כמו עלבונות, כולל איסכמיה היפוקסיה. באמצעות תאים בתרבית ו במבחנה מחקרים יש תקטן השונות בין ניסויים המאפשר פרשנות של הנתונים. תאים בתרבית מאפשרת גם העשרה של האוכלוסייה GRP תוך מזעור ההשפעה של זיהום תאים של הפנוטיפ לא GRP.

Protocol

הקדמה

בפרוטוקול זה אנו מראים כיצד לחלץ, לבחור צלחת גליה מוגבלים (GRP) תאים מבשר מן חוט השדרה של E13 עוברים עכבר. תאים אלה הם סימנים מקדימים המוקדמות בתוך שושלות תאים oligodendrocytic ו astrocytic ומוגדרות על ידי הביטוי שלהם A2B5. בתווך GRP השלימו עם FGF-2, את A2B5 GRPS + יתחיל להביע סמנים מוקדם oligodendrocytic שושלת PDGFαR ו NG2 ^1,2. תאים אלה השושלת oligodendrocyte לעבור דרך סדרה של שלבים מובחנים פנוטיפי, כל אחד מהם מאופיין על ידי שינויים מורפולוגיים, כמו גם ביטוי של סמנים בשלבים התפתחותיים ספציפיים.

תאים אלה מבשר כרגע הנלמד כמקור פוטנציאל מבוססי תאים גישות טיפוליות בהפרעות של החומר במערכת העצבים המרכזית, כולל טרשת לבן, leukodystrophies מרובים leukomalacia periventricular (PVL) ^3,4,5,6 6,7,8,9. תאים אלה מבשר גליה יש גם שימש במחקרים של אחרים לבנים מחלות מודלים משנה כגון פגיעה בחוט השדרה, טרשת לרוחב amyotrophic ^10,11,12,13.

המעבדה שלנו פיתחה מודל מוקדם לאחר הלידה היפוקסיה, איסכמיה העכבר שבה אנו בוחנים את היעילות של חוט השדרה אלה נגזר תאים GRP כגישה שיקומית ב PVL, הגורם המוביל של שיתוק מוחין ^14,15,16. יש גם מוח המכרסם נגזר מודל ה-OPC, שבו נעשה שימוש נרחב לחקר פגיעה בחומר הלבן מאז התאים GRP יש נטייה להתמיין מסלול astrocytic ^17. פנוטיפ OPC חתמה כבר מסלול שושלת oligodendrocyte, תופעה שנראית irreversible. עם זאת, אנו מעוניינים להעריך את התגובה של ספקטרום רחב יותר של אבות oligodendrocyte כולל GRPS ואולי אף את NEPs הנגזרים על E10.5. לכן אימצנו את חוט השדרה נגזר מודל GRP לעבודה שלנו.

בנוסף לשימוש GRPS להחלפת תאים, גזירה של תאים אלה מסוג פרוע מודלים מכרסם מהונדס של מחלות החומר הלבן מאפשר מחקר נוסף תוך בידול גליה בתנאים רגילים ומחלות בסביבה חוץ גופית. בפרסומים קודמים הראו ראיות הפגיעות סלקטיבי של תאים מבשר oligodendrocytic השושלת ללחצים חיצוניים שונים כמו excitotoxicity ההבשלה תלויה גלוטמט, סטרס חמצוני, וגורמים בחר מעורבים neuroinflammation ^18,19. המחקרים שלנו מתמקדים בהבנת המנגנונים תאית ומולקולרית מאחורי הפיתוח של אלה פציעות החומר הלבן, להעריך את הרגישות של התאיםקשת שושלת oligodendrocyte להעליב, כמו גם ניתוח גישות טיפוליות המשוער.

חומרים

כל הנהלים הקשורים לבעלי חיים להתאים את המדיניות PHS ו IACUC JHU. הנהלים כל יש לבצע במנדף זרימה למינרית על מנת לשמור על תנאים אספטיים. בדרך כלל והניתוחים מבוצעים בשכונה זרימה אופקית בעבודה חוץ גופית בשכונה זרימה אנכית. התקשורת כל פעם קרה בזמן נתיחות מתים. העכברים השתמשו במחקר שלנו הם סוג בר CD-1 זן ו-GFP מהונדס ברקע C57/BL6. אחת CD-1 סכר העכבר בדרך כלל מניבה 10 + עוברים שהם מספיק 1-2 זרעים T25 צלוחיות. בדרך כלל, שני סכרים מוקרבים בכל פעם, מיתרי השדרה העובר ונקווה ו מצופה לתוך הבקבוק 1 T25 לכל הסכר. לאחר התאים כבר נגזר שהם ניתן להרחיב ומאופיינת במבחנה ללימודי הבאים.

1. הכנת Media וצפחות

• GRP המניותבינוני משמש כמדיום Dissection: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50X, Invitrogen) N2 (100x, Invitrogen) תוספי מזון שור אלבומין סרום (BSA, 0.5% w / v).
• דיסוציאציה בינונית: כמו בינוני לנתיחה.
• בינונית תרבות: בינוני + GRP המניות FGF-2 (10-20 נ"ג / מ"ל; Invitrogen) ו הפרין (1 מיקרוגרם / מ"ל; Sigma).
• PLL / laminin מצופה 75 ס"מ או 25 ס"מ ^{2 2} צלוחיות (T75 או T25).
• תרביות רקמה צלוחיות (75 ס"מ ^2, פלקון) היו מצופים 15-20μg/ml פולי-L-ליזין (PLL, Sigma) ב מזוקקים H ₂ O, מודגרות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 להישאף אז. צלוחיות נשטפים 1X עם PBS מצופה מכן ב 37 מעלות צלזיוס עם 15-20 מיקרוגרם / מ"ל ​​Laminin (Sigma) ב PBS עבור שעה 1, להישאף אז PBS טרי או אמצעי נוסף עד תאים מוכנים להיות מצופה. לאחר ציפוי, צלוחיות אסור להתייבש אבל אפשר לשמור PBS או מדיה ב 4 ° C למשך זמן קצר לפני השימוש.

2. מכשירים ו-M אחרaterial

• פטרי מנות: 4 לכל הסכר: 3 צלחות פטרי לנתיחה (75 מ"מ), מנה 20 מ"מ לאיסוף מיתרי השדרה שנקטפו.
• מספריים גדולים (43 מ"מ הפעלה מספריים, Roboz) ו מלקחיים רקמות לפתיחת הבטן של הסכר.
• מספריים קטן לנתח את הרחם ואת הסרת עוברים (15 מיקרו מ"מ מספריים הניתוחים, Roboz).
• מיקרו מספריים האביב המבתרים (6 מ"מ) לנתח את חוט השדרה של עוברים את.
• מיקרו הביתור מלקחיים בזווית לעיגון גוף הסכר העובר במהלך הניתוח ולאחר מכן להסיר את חוט השדרה חשוף פעם אחת.
• 40 או 70 תאים מיקרומטר מסננת להסרת פסולת התא לפני ציפוי.
• טריפסין 0.05% prewarmed ל 37 ° C.
• 10 מ"ג / מ"ל ​​DNAse 1 (Sigma), מוכן כמו מניה 100x (1 גרם / מ"ל).
• ביו סיכון התיק על גופות של בעלי חיים.
• 15 ו 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות לעיבוד חילוץ מיתרי השדרה.

3. קביעת יחסי ציבור מתוזמןegnancy

סכרים עכבר הרות מסודרות או ממקורות מסחריים המפרטים משלוח ביום עובריים E12 או E13 של התפתחות העובר או ההריון נקבע בתוך הבית. בקצרה, שתי נקבות ממוקמים יחד עם זכר 1 בשעות אחר הצהריים המאוחרות והשאיר לילה ביחד. למחרת הנקבות נצפות את קיומו של תוסף ריר ממוקם נרתיקית. התוספת ריר רק סימן לכך התרחשה הזדווגות בעלי חיים כך שקל לאחר מכן מדי יום כדי לעקוב אחר קצב הגידול במשקל. יום plug ריר הוא ציין מוגדר היום עובריים 1 (E1).

4. רקמת גזירת

1. לעבוד תחת מכסה המנוע כדי לשמור על זרימת אופקי תנאים אספטיים.
2. לרסס את מכסה המנוע ואזור עבודה עם אתנול 70%.
3. החיטוי מכשירים או ספריי בנדיבות עם אתנול 70%.
4. להכין כלים, התקשורת מיקרוסקופ לשימוש.
5. יוצקים 20 מ"ל של מדיום לנתיחה קר אל פטרי סטרילית דיש.
6. להרדים חיה עם הידרט (500 מ"ג / ק"ג) מנוהל intraperitoneally (IP) ואחריו העקירה עריפת ראש או צוואר הרחם.
7. לרסס את אזור הבטן של הסכר עם אתנול 70-90% (חיטוי)
8. פתיחת הבטן עם מספריים ו מלקחיים גדולים.
   1. ב CD1 ו C57/BL6 זנים: בדרך כלל בין 8 ל 14 עוברים יהיה בתוך הרחם. מספר עוברים הוא זן תלויים.
9. חלץ את הרחם העכבר כולל את הגורים ומכניסים בינוני טרי לנתיחה קר בצלחת פטרי נקי לשטוף דם ופסולת רקמה העובר.
10. חלץ כל העובר מקרן הרחם ולהפריד אותם שק העובר לשליה באמצעות מספריים קטנים. להעביר את העוברים חילוץ לתוך המדיום לנתיחה טרי בצלחת פטרי חדשה.
    1. בינוני לנתיחה צריך להיות בטמפרטורה נמוכה כדי להוריד את פעילות חילוף החומרים ולשמור על יכולת הקיום של תאים הנגזרים.
    2. לעבוד מעתה עם שני מלקחיים ומיקרו לנתח קפיץ מספריים.
11. עבודה תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לחתוך את העור לאורך חוט השדרה עם מספריים כירורגיות מיקרו העור לקלף בחזרה לחשוף את חוט השדרה.
12. Transect חוט השדרה עם מספריים microsurgical בבית על C1 ובתחילת הזנב.
13. להסיר את חוט השדרה עם מלקחיים קהים, להבטיח את כל עצם וסחוס מוסרים ומעבירים לצלחת פטרי 3 ^rd של לנתח בינוני.
14. כדי למנוע צמיחת יתר של רקמת meningeal בתרביות תאים לאחר מכן לנסות להסיר כמה של קרומי המוח ככל האפשר של חוט השדרה. בגלל העצבים ההיקפיים בולטים המתהווה זה קשה יותר להסיר רקמות meningeal מן המוח חילוץ.
15. לאחר קרומי המוח הוסרו, להעביר את מיתרי השדרה לצלחת פטרי 20 מ"מ
16. לנקות באופן יסודי על ידי ריסוס באזור עם 70-90% אתנול.
17. השלבים הבאים על הניתוק צריך להיעשות במהירות כדי לשמור עלכדאיות גבוהה של רקמת חוט השדרה הנגזרות.

5. תרבות הקמת

1. טריפסין יש מראש התחמם דקות לפחות 30 ב-O אמבטיה 37 ° CH _2. Aliquot המתאים יש להסיר מן המלאי כדי להקטין את החשיפה של המניות תנודות הטמפרטורה.
2. להעביר את מיתרי השדרה שנקטפו לצינור צנטריפוגות 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל מחומם מראש טריפסין (0.05%, איכות ביולוגיות) ו 100 DNAse μl (10 מ"ג / מ"ל) ו triturate בקצרה.
3. דגירה של 37 ° CH ₂ O-באמבטיה במשך 10 דקות.
4. Triturate ו דגירה דקות אחר 10.
5. הוסף 5 מ"ל GRP בינוני (כהגדרתו לעיל) צנטריפוגות במשך 5 דקות על סל"ד 1000.
6. Aspirate supernatant ו resuspend גלולה בינוני עם 10 GRP מ"ל ולהוסיף DNAse-1 (10 מ"ג / מ"ל, Sigma).
7. דגירה של 37 ° CH ₂ O-באמבטיה במשך 10 דקות.
8. סרכזת 5 דקות בסל"ד 1000 ו לשאוב supernatant.
9. Resuspend גלולה עם freהמדיום ש GRP ואז פסולת מסנן עם 40-70 תא מסננת מיקרומטר.
10. הצלחת על PLL / laminin ס"מ מצופה 25 ² צלוחיות (T25) ו - דגירה על 37 מעלות צלזיוס, לחות 95% ו 5% CO _2.
11. Media 100% השינוי בעקבות יום.
12. בשלב זה, GRPS מצורף והחל להרחיב תהליכים.

6. Immunopanning אוכלוסייה GRP

1. חוט השדרה פלייט רקמות PLL / laminin צלוחיות מצופים עד הבקבוק הוא 85-90% confluent או כשבוע.
2. תאים קציר על ידי גירוד בקבוק עם שוטר גומי או עם טריפסין 0.05%, triturate ביסודיות אך בעדינות, צנטריפוגה בסל"ד 1000 דקות 5 וביסודיות resuspend גלולה בינוני עם 3 GRP מ"ל.
3. להעביר 1 מ"ל כל 3 T25 צלוחיות או 3 מ"ל עד 1 T75 הבקבוק להוסיף כמויות מתאימות של המדיום כדי לכסות לחלוטין התאים ולאפשר צלוחיות להגיע מפגש 80-90%.
4. לשנות את התקשורת בכל יום אחר, במוקדם אם בינוני מכלה במהירות.
5. מעיל בקטריולוגית Peכלים תלת (75 מ"מ) לינה 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים IgM העכבר נגד (דרום ביוטק), 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב PBS.
6. Aspirate חיץ עודף לשטוף צלחות פטרי פי 3 עם PBS.
7. הוסף A2B5 נוגדנים (Millipore) בריכוז של 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​מדולל PBS ו דגירה של שעה 1 בטמפרטורת החדר (RT).
8. לשטוף צלחות פי 3 שוב עם PBS ולאחר מכן להוסיף 8 מ"ל של מדיום GRP כדי למנוע התייבשות של צלחת.
9. העברת 5 מ"ל של מדיום GRP מ צלחות פטרי ו GRP תאים הקציר על ידי גירוד צלוחיות עם שוטר גומי לנתק את כל התאים
10. Triturate ההשעיה התא לזמן קצר כדי לשבור את הגושים ולהעביר ההשעיה התא 5 מ"ל ל A2B5 מנות בקטריולוגי מצופה פטרי.
11. דגירה 1 שעות בטמפרטורת החדר מבלי לרעוד.
12. לאחר 1 מדיה משאבי אנוש aspirate וצלחות לשטוף 8x עם PBS.
13. בעדינות לגרד תאים עם שוטר גומי 2 מ"ל GRP התקשורת ואז להעביר PLL / laminin צלחות או צלוחיות מצופה עם נפח מתאים של המדיום GRP.

    7. הקפאה ואחסון של בתאים שמקורם

    1. התאים נקצרים מן הבקבוק 85-90% T25 או T75 confluent עם טריפסין מ"ל 2 0.05%.
    2. טריפסין הוא מדולל ו מובטל עם המדיום המניות GRP 8ml ו centrifuged בסל"ד 1000 דקות 5.
    3. כדורי מ T25 צלוחיות הם resuspended במדיום 1 GRP הקפאת מ"ל, (בינוני GRP המניות השלימו עם 10% (V / V) DMSO ובאופן אופציונלי, FBS 20%). כדורי גדולים יותר מ T75 צלוחיות הם בדילול כפולה.
    4. המתלים התא של 1.5 - 3 x 10 ^10,11,12,13 תאים מועברים צלוחיות קריוגני (Nalgene) ומאוחסן לילה במיכל קריוגני (Nalgene) המכיל isopropanol ב -80 ° C עד לאט להקפיא למשך הלילה.
    5. בעקבות הקפאת תאים לילה מועברים תיבות הקפאה ומאוחסנים 6 חודשים עד 1 yr ב -80 ° C או בטווח הארוך יותר ב N _(l). תאים מופשר הם בדרך כלל 60-80% קיימא תלוי במידה רבה על איכות הציפוי PLL / laminin.
    8. נציג תוצאות

    CO ₂ אינו משמש anesthetizing בעלי חיים בגלל ההשפעה במורד אפשרית לקיומה של עוברים, ובסופו של דבר התאים הנגזרות. יתר על כן, יהיה קשה מאוד להסיר לחלוטין את קרומי המוח של חוט השדרה במהלך ההליך הגזירה, אך שילוב של בינוני GRP ו immunopanning יבטל תאים אלה גדל במהירות. כמו כן, חוט השדרה כולו נאסף למרות ריכוז הגחון הגדול באוכלוסייה GRP בשל שמקורם שלה בחוט השדרה הגחון ועל המעבר dorsally ^20. עם זאת בינוני GRP בוחר עבור הפנוטיפ GRP וכי האוכלוסייה מוגדל על ידי immunopanning A2B5. לאחר ציפוי רקמות בעמוד השדרה, התרבויות במבחנה מודגרת לשני קטעים או כשבוע. אחרי 2 ימים בתרבית, תאים של מורפולוגיות שונות ניתן לראות את תרבות צלוחיות רקמות המצביעים הטרוgeneity מהאוכלוסייה אבל בינוני GRP בוחר עבור הפנוטיפ GRP. תאים אלה הם שילוב של A2B5 + GRP, E-NCAM + ומבשרי מוגבלים עצביים (מפד"ל) ו nestin +, A2B5-neuroepithelial תאים fibronectin ואולי + דלקת קרום המוח תאים. בנוסף, פנוטיפים בוגרים יותר עשויים להיות סמנים המבטאים הנוכחי כולל doublecortin ו Tuj1 על השושלת העצבית, GFAP על האסטרוציטים ו PDGFaR ו GalC על השושלת oligo על מנת למקסם את האוכלוסייה GRP מאוד מועשר ממאגר הטרוגנית המוצא (איור 1 א), תאים יכולים להיות פעמיים immunopanned לבחור לחסל את E-NCAM + תאים ואחריו מבחר של A2B5 + אוכלוסייה GRP פעם צפיפות התאים עלה ל 85-90% על confluency ב T75 צלוחיות. תאים אלה GRP לשמור על היכולת שלהם להיות האסטרוציטים למרות היותו בתווך הבוחר על הפנוטיפ oligodendrocyte כך immunopanning לאחר A2B5 עשוי להיות נחוץ כדי לשמור על האוכלוסייה מועשר GRP. Immunopanning generהתשואות בריתו עד 95% A2B5 + תאים אבל התשואה גדולה עוד יותר A2B5 חרוזים מגנטיים מצומדות (Miltenyi BIOTEC Inc) ניתן להשתמש כדי לספק תשואה של% עד 97. ערנות של GRP תרבויות תחזוקה כגון שינויים מדיה רגילים יהיה למזער את שגשוג בלתי GRP סוגי תאים. גם בהיעדר של BMP-4 האסטרוציטים, עדיין עשויים להימצא מדולדל התקשורת בפרט נראה בידול כדי לגרום פנוטיפ astrocytic. למרות תוספת B27 מכיל תלת iodothyronine הורמונים (T3), לא היה שום נטייה הנצפה להתמיין oligodendrocytes באוכלוסייה GRP, רק כאשר רמות גבוהות של T3 מתווספים המדיום אינו תופעה זו להתרחש. עם זאת, תוסף T3 חינם B27 ניתן להחליף אם יש חשש לזיהום על ידי oligodendrocytes בוגרים (1B איור). תאים אלה GRP ניתן לזהות בקלות על ידי המורפולוגיה שלהם סומה קטן עם 2 או 3 תהליכים קצרים אבל למסך של סוגי תאים אחרים שעשויים להיות נוכח, immunocytochemistry ניתן לבצע עבור סמנים נפוצים בעבר בשם סוג התפתחותיים תאים ספציפיים. יהיו בדרך כלל להיות אוכלוסייה קבועה קטנה של A2B5-תאים הנמצאים neuroepithelial (הנא"פ) ומסוגל להפוך גם GRP או המפד"ל. למרבה המזל, התאים יותר נשמרות בינוני GRP סביר יותר להניח כי המדיום יבחר עבור הפנוטיפ GRP.

    

    איור 1.) מצופים בתאים בחוט השדרה של מורפולוגיה הטרוגנית הם נצפו אחרי 2 ימים בתרבית. ב) Immunopanning למקסימום האוכלוסייה GRP מועשר ביותר ממאגר הטרוגנית החל.

Discussion

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/ F12 1:1	Invitrogen	11320033
B27	Invitrogen	17504044
N2	Invitrogen	17502048
rH-FGF-basic	Invitrogen	PHG0026
Trypsin (0.05%) EDTA	Quality Biological, Inc.	118-087-721
POLY-L-LYSINE HBr	Sigma-Aldrich	P1274-25MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
Dnase 1	Sigma-Aldrich	DN25