Utledning av glial Begrensede Forstadier fra E13 mus

Summary

Denne protokollen beskriver avledning av glial Begrensede Forstadier fra foster ryggmargen og vedlikeholdes in vitro enten for transplantasjon eller for studiet av oligodendrocytic avstamning.

Abstract

Dette er en protokoll for avledning av glial begrensede forløper (GRP) celler fra ryggmargen av E13 mus fostre. Disse cellene er tidlige forløpere innen oligodendrocytic celle avstamning. Nylig har disse cellene blitt studert som potensiell kilde for restorative terapi i hvit substans sykdommer. Periventrikulær leukomalacia (PVL) er den ledende årsaken til ikke-genetiske sykdommer i hvit substans i barndommen og rammer opptil 50% av ekstremt premature barn. Dataene tyder på en økt mottakelighet for utviklingen av hjernen til hypoksi-iskemi, oksidativt stress og excitotoxicity som selektivt rettet mot gryende hvit substans. Glial begrensede forløpere (GRP), oligodendrocyte progenitorceller (OPC) og umodne oligodendrocytes (preOL) synes å være sentrale aktører i utviklingen av PVL og er gjenstand for fortsatte studier. Videre har tidligere studier identifisert en undergruppe av CNS vev som har økt mottakelighet for glutamat excitotoxicity somsamt en utviklingsmessig mønster til dette følsomhet. Vårt laboratorium for tiden undersøker hvilken rolle oligodendrocyte progenitors i PVL og bruk celler på GRP utviklingstrinn. Vi bruker disse avledet GRP cellene i flere eksperimentelle paradigmer for å teste deres reaksjon å velge påkjenninger konsistente med PVL. GRP cellene kan manipuleres in vitro inn OPCs og preOL for transplantasjon eksperimenter med mus PVL modeller og in vitro modeller av PVL-lignende fornærmelser inkludert hypoksi-iskemi. Ved å bruke dyrkede celler og in vitro studier der ville bli redusert variabilitet mellom eksperimenter som forenkler tolkning av dataene. Dyrkede celler tillater også for anrikning av GRP befolkningen samtidig minimere virkningen av forurensende celler av ikke-GRP fenotype.

Protocol

Innledning

I denne protokollen viser vi hvordan du kan hente, velge og plate glial begrensede forløper (GRP) celler fra ryggmargen av E13 mus fostre. Disse cellene er tidlige forløpere innen oligodendrocytic og astrocytic celle linjer og er definert av deres uttrykk for A2B5. I GRP medium supplert med FGF-2, vil A2B5 + GPR begynne uttrykker tidlig oligodendrocytic avstamning markører PDGFαR og NG2 ^1,2. Disse oligodendrocyte avstamning cellene passerer gjennom en rekke forskjellige fenotypiske stadier, hvert av dem preget av morfologiske endringer, samt uttrykk for markører til bestemte utviklingsstadier.

Disse forløper celler blir nå studert som en potensiell kilde for celle-baserte terapeutiske tilnærminger i lidelser i det sentrale nervesystemet hvit substans, blant annet multippel sklerose, leukodystrophies og periventrikulær leukomalacia (PVL) ^3,4,5,6 6,7,8,9. Disse glial forløper celler har også blitt brukt i studier av andre sykdommer i hvit substans modeller som ryggmargsskader og amyotrofisk lateral sklerose ^10,11,12,13.

Vårt laboratorium har utviklet en tidlig postnatal hypoksi-iskemi mus modell som vi vurderer effekten av disse ryggmargen avledet GRP celler som en oppkvikkende tilnærming i PVL, den ledende årsaken til cerebral parese ^14,15,16. Det er også en gnager hjerne avledet OPC-modellen som har blitt mye brukt for å studere hvit substans skade siden GRP celler har en tendens til å differensiere i astrocytic veien ^17. OPC fenotype har allerede kommet inn i oligodendrocyte avstamning veien, et fenomen som virker irreversible. Vi er imidlertid interessert i å vurdere responsen av et bredere spekter av oligodendrocyte progenitors inkludert GPR og muligens også den NEPS avledet ved E10.5. Av denne grunn har vi innført ryggmargen avledet GRP modell for arbeidet vårt.

I tillegg til bruk av GPR for celle erstatning, lar avledning av disse cellene fra villtype og transgene gnagere av hvit substans sykdommer videre studier i glial differensiering under normale og sykdom betingelser i en in vitro setting. Tidligere publikasjoner viser tegn til selektiv sårbarhet oligodendrocytic avstamning forløper celler til ulike eksterne stressfaktorer som modning avhengig glutamat excitotoxicity, oksidativt stress, og velg faktorer innblandet i neuroinflammation ^18,19. Våre studier har fokusert på å forstå de cellulære og molekylære mekanismer bak utviklingen av disse hvite substans skader, vurdere risikoen for at celler iden oligodendrocyte avstamning spektrum å fornærme samt analysere antatte terapeutiske tilnærminger.

Materialer

Alle prosedyrer som involverer dyr i henhold til PHS politikk og JHU IACUC. Alle prosedyrer skal utføres i en laminær hette for å opprettholde aseptiske forhold. Vanligvis disseksjoner utføres i en horisontal flyt hette og in vitro arbeid i en vertikal flyt hette. Alle medier som brukes kaldt under disseksjoner. Musene brukes i vår studie er en vill type CD-en belastning og en transgen GFP i en C57/BL6 bakgrunn. En CD-en mus dam gir typisk 10 + fostre som er nok til å seed 1-2 T25 kolber. Vanligvis blir to demninger ofret gangen og fosterets ryggmargen samles og belagt i en T25 kolbe per dam. Når cellene er avledet de kan utvides og karakteriseres in vitro for senere studier.

1. Utarbeidelse av Media og flakonger

• GRP lagermediet brukes som Dissection medium: DMEM / F12 01:01 (Invitrogen) + B27 (50x, Invitrogen) N2 (100x; Invitrogen) Kosttilskudd og Bovine serum albumin (BSA, 0,5% w / v).
• Dissosiasjon medium: samme som disseksjon medium.
• Kultur medium: glassfiber lager medium + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) og heparin (1 mikrogram / ml, Sigma).
• PLL / laminin belagt 75 cm ² eller 25 cm ² kolber (T75 eller T25).
• Vevskulturstudier kolber (75 cm ^2, Falcon) ble belagt med 15-20μg/ml Poly-L-lysin (PLL; Sigma) i destillert H ₂ O, inkuberes ved 37 ° C i 1 time da aspirert. Kolber vaskes 1X med PBS så belagt med 15-20 mikrogram / ml Laminin (Sigma) i PBS ved 37 ° C i 1 time, deretter aspireres og frisk PBS eller media lagt til cellene er klar til å være belagt. Etter belegg, bør flaskene aldri få lov til å tørke, men kan holdes i PBS eller media ved 4 ° C i korte perioder før bruk.

2. Instrumenter og Other Material

• Petriskåler: 4 per Mor: 3 petriskåler for disseksjon (75 mm), en 20 mm parabolen for å samle de høstes ryggmargen.
• Store sakser (43 mm Operativsystemet saks, Roboz) og vev Forceps for å åpne demningen s magen.
• Liten saks for dissekere livmoren og fjerne fostre (15 mm Micro dissekere saks, Roboz).
• Micro dissekere spring saks (6 mm) for å dissekere ryggmargen av fostrene.
• Micro Dissecting vinklede tang for forankring demningen og fosterets kropp under operasjonen og senere fjernet ryggmargen når de utsettes.
• 40 eller 70 mikrometer celle sil for å fjerne celleavfall før platekledning.
• 0,05% Trypsin prewarmed til 37 ° C.
• 10 mg / ml DNAse 1 (Sigma), utarbeidet som en 100x aksje (1 g / ml).
• Bio-fare bag for dyrelik.
• 15 og 50 ml sentrifugerør for behandling ekstrahert ryggmargen.

3. Bestemme Tidsinnstilt Pregnancy

Gravide mus demninger er enten bestilt fra kommersielle kilder angir levering på embryonale dag E12 eller E13 av fosterets utvikling eller graviditet bestemmes internt. Kort, er to hunner plassert sammen med en mannlig sent på ettermiddagen og dro over natten sammen. Dagen hunnene er observert for tilstedeværelse av vaginalt lokalisert slim plugg. Slimet pluggen er bare en indikasjon på at parringen skjedde så dyr blir senere veid daglig for å overvåke frekvensen av vektøkning. Dagen slimet pluggen er observert er definert som embryonale dag én (E1).

4. Tissue Derivasjon

1. Arbeid under en horisontal flyt hette for å opprettholde aseptiske forhold.
2. Spray ned panseret og arbeidsområde med 70% etanol.
3. Autoclave instrumenter eller Spray rikelig med 70% etanol.
4. Forbered instrumenter, media og mikroskop for bruk.
5. Hell 20 ml kald disseksjon medium inn i sterile Petri dish.
6. Anesthetize dyr med Chloral hydrat (500 mg / kg) administrert intraperitonealt (IP) etterfulgt av livmorhalskreft forvridning eller halshogging.
7. Spray mageområdet av dam med 70-90% etanol (desinfeksjon)
8. Åpne buken med stor saks og pinsett.
   1. I CD1 og C57/BL6 stammer: Vanligvis 8 til 14 fostre vil være inne i livmoren. Den antall fostre er belastning avhengig.
9. Pakk musen livmoren inkludert valpene og plasser i friskt kaldt disseksjon medium i en ren petriskål å vaske blod og vev rusk fra fosteret.
10. Utdrag hvert foster fra livmor horn og skille dem fra embryonale sac og morkake bruke de små saks. Overfør utpakkede fostrene i frisk disseksjon medium i en ny petriskål.
    1. Disseksjon medium bør være lav temperatur for å senke metabolsk aktivitet og bevare levedyktighet av sekundære celler.
    2. Arbeid fra nå av med to tang ogmikro dissekere spring saks.
11. Arbeider under disseksjon mikroskop, kutt i huden langs ryggmargen med mikro kirurgiske sakser og skrelle huden tilbake utsette ryggmargen.
12. Transekt ryggmargen med mikrokirurgiske saksen på om C1 og i begynnelsen av halen.
13. Fjern ryggmargen med butte tang, sikre alle bein og brusk fjernes og overføres til ^3. petriskål av dissekere medium.
14. For å hindre gjengroing av meningeal vev i påfølgende cellekulturer prøver å fjerne så mye av hjernehinnene som mulig fra ryggmargen. På grunn av den gryende utstikkende perifere nerver dette er vanskeligere enn å fjerne meningeal vev fra ekstrahert cerebrum.
15. Når hjernehinnene har blitt fjernet, overføre ryggmargen til 20 mm petriskål
16. Rydd opp etter grundig sprøyting området med 70-90% etanol.
17. Følgende trinn for dissosiasjon bør gjøres raskt for å opprettholdeen høy levedyktighet avledet ryggmargen vev.

5. Kultur Etablering

1. Trypsin bør forvarmes i minst 30 min i en 37 ° CH ₂ O-bad. En passende delmengde bør fjernes fra bestanden for å redusere eksponeringen av lager til temperatursvingninger.
2. Overfør høstes ryggmargen til en 50 ml sentrifugerør inneholder 10ml forvarmes trypsin (0,05%; Kvalitet Biologicals) og 100 mL DNAse (10 mg / ml) og triturate kort.
3. Inkuber i 37 ° CH ₂ O-bad i 10 minutter.
4. Triturate og inkuber for ytterligere 10 min.
5. Tilsett 5 ml GRP medium (definert ovenfor) og sentrifuger i 5 min ved 1000 RPM.
6. Aspirer supernatanten og resuspender pellet med 10 ml GRP medium og tilsett DNAse-1 (10 mg / ml, Sigma).
7. Inkuber i 37 ° CH ₂ O-bad i 10 minutter.
8. Sentrifuger 5 min ved 1000 RPM og aspirer supernatanten.
9. Resuspender pellet med fresh GRP medium da filter rusk med en 40-70 mikrometer celle sil.
10. Plate på PLL / laminin belagt 25 cm ² kolber (T25) og inkuber ved 37 ° C, 95% luftfuktighet og 5% CO _2.
11. 100% media endres på neste dag.
12. På dette punktet har GPR festet og begynte å utvide prosesser.

6. Immunopanning GRP Befolkning

1. Plate ryggmargen vev i PLL / laminin belagte kolber inntil kolben er 85-90% konfluent eller om en uke.
2. Harvests celler ved å skrape kolbe med en gummi politimann eller med 0,05% trypsin, triturate grundig men forsiktig, sentrifuger ved 1000 RPM for 5 min og grundig resuspender pellet med 3 ml GRP medium.
3. Overfør 1 ml hver 3 T25 flasker eller 3 ml til 1 T75 kolbe legge til passende mengder medium å fullstendig dekke celler og la kolbene å nå 80-90% samløpet.
4. Endre media annenhver dag, tidligere hvis medium depletes raskt.
5. Coat Bakteriologisk Petri retter (75 mm) over natten ved 4 ° C med en anti-mus IgM antistoff (Southern Biotech), 10 mikrogram / ml i PBS.
6. Aspirer overflødig buffer og vaske petriskåler 3x med PBS.
7. Legg A2B5 antistoff (Millipore) ved en konsentrasjon på 5 mg / ml fortynnes i PBS og inkuber 1 time ved romtemperatur (RT).
8. Vask platene igjen 3x med PBS deretter legge 8 ml av GRP medium for å hindre uttørring av plate.
9. Overfør 5 ml av GRP medium fra petriskåler og høster GRP celler ved å skrape kolber med en gummi politimann for å løsne alle celler
10. Triturate cellesuspensjon kort for å bryte opp klumper og overføre 5ml cellesuspensjon til A2B5 belagte bakteriologiske petriskåler.
11. Inkuber 1 time i romtemperatur uten risting.
12. Etter 1 time aspirer media og vask plater 8x med PBS.
13. Forsiktig skrape celler med en gummi politimann i 2 ml GRP media deretter overføre til PLL / laminin belagte plater eller kolber med passende volum av GRP medium.

    7. Frysing og lagring av sekundære celler

    1. Cellene høstes fra en 85-90% konfluent T25 eller T75 kolbe med 2 ml 0,05% trypsin.
    2. Trypsin fortynnes og inaktiveres med 8ml GRP lager medium og sentrifugeres ved 1000 RPM i 5 min.
    3. Pellets fra T25 kolbene er resuspendert i 1 ml GRP frysing medium, (GRP lager medium supplert med 10% (v / v) DMSO og eventuelt 20% FBS). De større pellets fra T75 kolber fortynnes todelt.
    4. Cellesuspensjoner på 1,5 - 3 x 10 ^10,11,12,13 celler blir overført til kryogene hetteglass (Nalgene) og lagret over natten i en kryogenisk beholder (Nalgene) inneholder isopropanol ved -80 ° C til sakte fryse natten.
    5. Etter overnatting frysepunktet cellene blir overført til fryseboks bokser og lagres fra 6 måneder til 1 år ved -80 ° C eller lengre sikt i N _(l). Tint celler er typisk 60-80% levedyktig avhengig stor grad av kvaliteten på PLL / laminin belegg.
    8. Representative Resultater

    CO ₂ er ikke brukt til bedøvelse dyret på grunn av den mulige nedstrøms effekt på livskraft for fostre og til slutt den deriverte celler. Videre vil det være svært vanskelig å helt fjerne hjernehinnene fra ryggmargen under utledningen prosedyren, men kombinasjonen av GRP medium og immunopanning vil eliminere disse raskt voksende celler. Tilsvarende er hele ryggmargen høstes til tross for en større ventral konsentrasjon av GRP befolkningen på grunn av sin opprinnelse i det ventrale ryggmargen og migrere dorsally ^20. Men GRP medium velger for GRP fenotype og at befolkningen blir maksimert ved A2B5 immunopanning. Etter platekledning ryggmargen vev, er in vitro kulturer inkubert i to passeringer eller om en uke. Etter 2 dager i kultur, kan celler av ulike morfologi bli observert i vevet kultur kolbene indikerer heterogeneity av befolkningen, men GRP medium velger for GRP fenotype. Disse cellene er en kombinasjon av A2B5 + GRP, E-NCAM + nevrale bundne prekursorer (NRP) og nestin + og A2B5-neuroepithelial celler og muligens fibronectin + meningeal celler. I tillegg kan mer modne fenotyper være tilstede uttrykker markører, inkludert doublecortin og Tuj1 for nevrale avstamning, GFAP for astrocytes og PDGFaR og GalC for oligo avstamning For å maksimere en svært GRP anriket befolkningen fra start heterogene bassenget (figur 1A), celler kan være dobbelt-immunopanned å velge og eliminere E-NCAM + celler etterfulgt av utvalg for A2B5 + GRP befolkningen når celle tetthet har økt til om lag 85-90% confluency i T75 kolber. Disse GRP cellene opprettholde deres evne til å bli astrocytes tross i et medium som velger for oligodendrocyte fenotypen så påfølgende A2B5 immunopanning kan være nødvendig for å opprettholde en høyanriket GRP befolkningen. Immunopanning genealliert gir opptil 95% A2B5 + celler, men for enda større avkastning A2B5 konjugerte magnetiske kuler (Miltenyi Biotec Inc.) kan brukes til å gi en avkastning på opptil 97%. Årvåkenhet i vedlikehold GRP kulturer som vanlige media endringene vil redusere spredning av ikke-GRP celletyper. Selv i fravær av BMP-4 astrocytes kan fortsatt bli funnet og utarmet media særlig synes å indusere differensiering til en astrocytic fenotype. Selv om B27 supplement inneholder tri-iodothyronine hormon (T3), har det ikke vært observert tendens til å differensiere i oligodendrocytes i GRP befolkningen, bare når høyere nivåer av T3 er lagt til medium forekommer dette fenomenet. Imidlertid kan en T3 gratis B27 supplement erstattes hvis det er en bekymring for forurensning av modne oligodendrocytes (figur 1b). Disse GRP celler kan lett identifiseres ved sin morfologi lille Soma med 2 eller 3 korte prosesser, men å screene for andre celletyper som kan være til stede, immunocytochemistry kan utføres for de tidligere kalt felles utviklings-og celletype spesifikke markører. Det vil ofte være en liten vedvarende bestand av A2B5-celler som er neuroepithelial (NEP) og i stand til å bli enten GRP eller NRP. Heldigvis blir de lengre cellene opprettholdes i GRP medium jo mer sannsynlig at medium vil velge for GRP fenotype.

    

    Figur 1. A) Platekonstruksjoner ryggmargen celler av heterogen morfologi er observert etter 2 dager i kultur. B) Immunopanning maksimerer en svært GRP-beriket befolkningen fra start heterogene bassenget.

Discussion

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/ F12 1:1	Invitrogen	11320033
B27	Invitrogen	17504044
N2	Invitrogen	17502048
rH-FGF-basic	Invitrogen	PHG0026
Trypsin (0.05%) EDTA	Quality Biological, Inc.	118-087-721
POLY-L-LYSINE HBr	Sigma-Aldrich	P1274-25MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
Dnase 1	Sigma-Aldrich	DN25