Summary
末梢感覚神経線維のサブタイプの免疫細胞化学的同定（とそこにタンパク質発現の検出）が末梢感覚の分子メカニズムの理解の鍵となります。ここでは、末梢感覚神経線維の特異的免疫染色のための皮膚や四肢骨などの周辺/内臓の組織サンプル、、の調製のための方法を説明します。
Abstract
末梢感覚神経線維によって検出し、物理的、化学的および熱的感覚刺激の主な処理は、動物とヒトの知覚に重要です。これらの末梢感覚神経線維は、特定の感覚刺激を検出し、開始する受容体やイオンチャネルタンパク質の茄多を表現する。方法はまた、これらの繊維の特定のイオンチャネルタンパク質の機能発現を同定するために利用することができる、皮膚を支配する末梢感覚神経線維の電気的特性を、特徴付けるために使用可能です。しかしながら、類似の電気生理学的手法は、骨などの最も挑戦的な組織を含む他の内臓器官を、支配する末梢感覚神経線維の受容体とイオンチャネルタンパク質の機能発現の検出のために（そしてまた、開発するのが難しい）は使用できません。さらに、そのような電気生理学的手法は、非興奮性タンパク質の発現を決定するために利用することはできない末梢感覚神経線維内のS。したがって、感覚神経のfivers用周辺/内臓の組織サンプルの免疫染色では、これらの神経線維に関心のある特定のタンパク質の発現を決定する最良の方法を提供します。これまでのところ、感覚ニューロンにおける蛋白質発現の研究のほとんどは、情報が特定のタイプまたは感覚ニューロンのサブセットの細胞体における特定のタンパク質の発現に限定されている知覚神経節、の手順を免疫染色に利用している。ここでは、末梢感覚神経線維の免疫染色のための周辺機器/内臓の組織サンプルの調製のための詳細な方法/プロトコルを報告する。我々は末梢感覚神経線維の免疫染色のためのマウスからの皮膚や足底のパンチ生検と骨（大腿骨）のセクションの準備のための具体的詳細の方法。これらのメソッドは、唯一の末梢感覚神経細胞におけるタンパク質発現の定性測定に重要なものではありませんが、またのための定量的なアッセイ方法を提供する感覚線維の特定のタイプまたはサブセットのタンパク質発現レベルの変化を決定するだけでなく、様々な病態時の感覚線維の数と密度の形態学的および/または解剖学的変化を決定するための。さらに、これらのメソッドは、感覚神経線維の染色に限定されないが、皮膚、骨や他の内臓組織における神経線維のいずれかのタイプの染色にも使用できます。
Protocol
1。動物の灌流
本研究で実行されるすべての動物の手順は、アイオワ大学の動物実験使用委員会によって承認、および研究における動物の使用のためにNIHのガイドラインに従ってくださいされています。
- 灌流の前日に、4℃で1リン酸緩衝液のL（蒸留H 2 O、pH7.4の0.2 M PB）、および店舗を準備これは、血流やポスト固定のプロセスに使用されます。
- 30秒のためのガラスビーカー中でマイクロ波のddH 2 200mlのO：血の日に、0.1M PBで4.0％のパラホルムアルデヒド（PFA、pH7.4）で固定溶液、2タイプのマウスの灌流のための十分な量の500mlを準備するまたはそれは沸騰に近づくまで。ヒュームフードの下に絶えず撹拌しながらビーカーに粒状パラホルムアルデヒド20gの（PFA）を追加します。滴下し、溶液が透明になるまでかき混ぜる5 NのNaOH 5 mlを追加します。 PFAが完全に溶解したら、室温（RT）への解決策を冷却する。 SLO連続的に撹拌しながらwly 0.2 M PB 250 mlを加える。次第に弱い塩酸溶液（0.1 N〜1 N〜6 N）を使用して、7.4にpHを調整する。 500mlと氷の上で寒さに最終的な音量を調整します。また、氷の上のddH 2 Oとチルで1:1に希釈して0.2 Mのストックから0.1 M PB 400mlのを準備。
- 麻酔薬の過剰摂取のintraperitonial注射（ペントバルビタールナトリウム、80 mg / kgの、27G針で投与）でマウスを麻酔。
- 灌流中に、0.1 M PB（のddH 2 Oで希釈した0.2 M PB株式1:1）とPFA 150ml中の50mlをマウスの循環に順次渡されます。 PBでチューブを充填し、一方の端で23 1 / 2 Gの蝶の針を固定することにより、蠕動ポンプを設定します。 0.1 M PBを含むビーカーにチューブのもう一方の端を浸し。 10ml /分、および配管内に気泡がないことを保証するソリューションの十分な量を介してポンプへの蠕動ポンプの速度を設定します。
- まで待ちますnesthetizedマウスは、もはやそのようなつま先/テールピンチと瞬目反射などの反射活動を、示していません。ヒュームフードの内側までの解剖トレイ腹側に動物を置き、テープで足を固定します。 70％エタノールで毛皮を吹き付けます。腹壁の胸郭と最四半期を公開するために正中線に沿って皮膚を通して切開を加えます。その後、胸郭の底で腹壁を介してカット。この切開を行った後、ダイアフラムと胸骨の下端が表示されるはずです。注意深く肺を損傷しないように注意しながら、ダイアフラムのマージンを介して、および胸骨の全長に沿って左から右に急ハンドルを切る。この段階での胸骨からいくつかのマイナーな出血は正常であり、血流が損なわれません。胸骨に沿って切開が行われた後で、ダイアフラムのカット、それは心臓が露出するように、胸郭上方と外側の各半分を持ち上げることができるはずです。必要に応じて肺を脇に移動。胸郭の両半分ができます止血クランプを使用することでこの位置に保持される。動物の長軸に平行な左心室に蠕動ポンプ3〜4ミリメートル、に接続されている蝶の針（23 1 / 2 G）を挿入します。この配置では、針が外れないのリスクを最小限に抑えることができます。戻り循環は心臓の外に流れるように右心房に小さな切開を加えます。
- 4〜5分間、10ml /分で0.1 M PBで灌流を開始します。この時点で、右心房から出る血液のかなりの量がまだあれば流れが透明になるまで、継続する。
- PBの流れを停止し、4％PFA液に蠕動ポンプの吸気口を切り替えます。 5ml /分に流量を減少させ、20〜25分のためにPFA液をポンピング再開。 PFAは、循環に入ると、筋肉が数分後に、けいれん状態になると、動物は、文字通りの位置に"固定"されるべきである。この剛性は、動物を移動しないように注意しながら、ゆっくりと後足と押してテストすることができます。NDは、カニューレを取り除く。良い血流が反応して屈曲から手足を防止します。 PFAで灌流が完了すると、カニューレと止血クランプを切断し、死体は組織解剖のために調製することができる。使用される解剖のアプローチは、特定の組織に依存します。
- 4％PFAに飽和ピクリン酸溶液を加えることにより、4％PFA / 5％（v / v）のピクリン酸（のみ底パンチの収集とポスト固定用PA）を準備する。 PAを含めることは、末梢神経組織1の抗原の検出能が大幅に向上
- 0.07％グリセロール、15％スクロースと0.1 M PBで10％EDTA - 骨/軟骨組織脱灰の/凍結保護溶液を調製します。 EDTAベースのソリューションは、エピトープ2を維持しながら組織を脱灰する。
- 0.1 M PBで30％ショ糖 - 凍結保護溶液を調製します。
2。組織の解剖/除去、後固定し、セクショニング
- 足底パンチ
perfuを配置ダウンカッティングマットや頑丈な表面上のsed動物腹側。足の真ん中に、足底は表面上、パンチ生検ツール（ハリスマイクロパンチ、テッドペラ社3 mm径）でしっかりと押しつけます。生検のツールは、後足の全体を通じて削減したことを確認するために180度前後に生検ツールを回します。ゆっくりと足から生検のツールを削除し、4％PFA / 5％PA溶液1mlを含む、キャップを滅菌2 mlチューブに組織を取り出してください。 - 四肢の骨（例：大腿骨）
両方の後肢に沿って継続して、骨盤のレベルでの動物の背面に沿って横方向の切開を加えます。骨盤と大腿骨の近位頭をそのまま残しながら骨盤から大腿骨を分離するために周囲の筋肉にカット。骨軸から周囲の筋肉/骨膜を除去し、遠位ヘッドはそのままにしておく脛骨/腓骨にカット。 4％PFA / 1 mlを含む2 mlチューブに大腿骨を配置5パーセントPAソリューション。 - 4℃で16〜18時間ロッカーで穏やかに混合し、4％PFA / 5％PAの溶液中で組織サンプルを、ポスト修正° C
- 次のように組織を石灰を除去する： 足パンチ （足の小さな骨を脱灰するために）場所はキャップ付き滅菌2 mlチューブに組織のパンチは、0.07％グリセロール、15で0.1 M PBで10％EDTA溶液1.5 mlを含む％スクロース。 4℃16〜18時間軽度のミキシングとロッカー℃の四肢の骨が 0.07％のグリセロールを0.1 M PBで10％EDTA溶液の1.5mlを含む、キャップを滅菌2 mlチューブに組織を配置するためにチューブをセットおよび15％ショ糖。 4℃6-7日℃でマイルドな混合とロッカー上にチューブを置きます脱灰液は24時間ごとやピンセットで剛性の損失のために監視組織を変更する必要があります。
- 凍結保護溶液1.5ml（0.1 M PBで30％ショ糖）とキャップと滅菌2 mlチューブに組織を移す、とロッカーwの上にチューブを置きます4℃16〜18時間℃でのi番目の軽度のミキシング
- セクショニングのための組織の準備：クライオスタットの組織取り付けブロックの場所に最適な切削温度（OCT）コンパウンド（サクラファインテック米国株）のベッドボリュームとクリオスタットチャンバー（通常-20℃に維持℃）で凍結することができます。極低温エアロゾル（CYTO -凍結、コントロール社、米国）も、凍結のプロセスを加速に、OCTに噴霧することができる。このOCTのベッドとOCTの追加の薄層とカバーの上に置いて組織標本。それは硬化しており、内の組織が凍結するまでゆっくりと極低温のエアロゾルをこのOCTをスプレー。場所のクリオスタットチャンバーのカッティングヘッドに試料と最先端の温度に平衡組織標本のブロックを許可する - 少なくとも1時間。埋め込み化合物はまだ脆いセクションと組織の損傷で寒すぎる結果のときにセクションしよう。
- 組織は、最適な切削温度に達すると、試料の切断を開始し、40μmのセクションを生成します。
3。感覚神経線維のために組織切片の免疫染色
3.1。足底パンチセクション - フローティングセクションの染色
- カミソリの刃を使用して、1mlのピペットチップの先端から6〜7ミリメートルを切る。前提条件0.1 M PB中のウシ胎児血清（FBS）を何度か（これは先端の壁に組織切片の付着阻害）が1％を吸引することにより先端の内側。 24ウェル組織培養プレートに染色される足底のパンチセクションを転送する。通常は80から10のセクションはいくつかの高品質のセクションは免疫染色ごとに生成されるように、ウェル当たり染色されるべきである。
- 室温でロッカーに混合活発で5分間ウェルあたり0.1 M PBの500μlと足底パンチのセクションを洗ってください。さらに2回繰り返します。
- 洗浄溶液を捨て、1時間のロッカーで穏やかに混合し、10％ヤギ血清と0.3％トリトン0.1 X - 100 M PB（ウェルあたりブロッキング溶液を500μl）で構成され、ブロッキング溶液で足底のパンチセクションをインキュベート4℃
- ブロッキング溶液を捨て、主antiboで組織切片をインキュベート4でロッカーで穏やかに混合しながら18〜24時間250μlのブロッキング溶液中に希釈DY /抗体℃の研究者の実験的な要件は、単一の免疫標識（特定のタンパク質または神経線維のマーカーに対抗するひとり一次抗体を使用）、または二重免疫標識（二つのタンパク質や神経線維のマーカーに対して2次抗体を持つ）に基づいて、同じセクションで行うことができます。二重免疫標識を実行している間は、使用される2つの主要な抗体は（例えば、1つは、マウスおよびウサギでの発生のいずれかで発生）別のホストの種で育った、あるいは、異なる免疫グロブリンG（IgG）のアイソタイプ（例えばのモノクローナル抗体を精製していることを確認することが重要ですone IgG1の一IgG2aの）を使用することができる。過度の蒸発を避けるために、一晩のインキュベーションのためにパラフィルムでプレートをシールすることをお勧めします。末梢感覚神経線維を染色するためには、いくつかの特異的な抗体を使用することができます。 LARラベル、タンパク質のニューロフィラメント200（シグマNF200）に対する抗体GE -直径の繊維、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP、Sigma）を、一方および一過性受容体電位バニロイド1（TRPV1、Neuromics）ラベルペプチド性、小口径の末梢感覚線維。すべての末梢神経線維はまた、β3-チューブリンに対する抗体で染色することができます。皮膚では、コラーゲンIV（アブカム）は真皮から表皮を分離する基底膜の輪郭を描くために使用されます。一般的なルールとして、抗体は、通常、5〜10μg/ mlのワーキング濃度で培養細胞ベースの免疫蛍光アッセイ、より多くの集中5〜10倍にする必要があります。
- ブロッキング溶液の500μlの（トリトンX - 100付き）ウェル当たりRTでロッカーで激しく混合すると5分で組織切片を洗浄してください。さらに3回繰り返します。
- 洗浄溶液を捨て、4℃でロッカーで穏やかに混合して適切なフルオロフォア標識二次抗体（通常はブロッキング溶液で1:1000に希釈、500μlの）で組織切片をインキュベート℃にプレートMUStは、フルオロフォアの光退色を避けるためにアルミホイルで包まれる。
- RTでのロッカーで激しく混合すると10分間、ウェルあたりブロッキング溶液の500μlの組織切片を洗浄してください。その後、室温で10分間、激しく混合しながら、0.1M PB中の500μlの洗浄。最後に、室温で10分間激しく混合すると0.05 M PBの500μlの洗浄。
- FBS処理チップ（端から6〜7ミリメートルを切る）1 mlのマイクロピペットを用いて、SuperFrostに組織培養プレートと転送からセクションを吸引プラス顕微鏡スライド。セクションを配置し、細かいブラシで余分な洗浄バッファーを吸収する。光に長時間さらさないようにしてください。のセクションでは、スライド（5〜30分）上のセクションを乾燥することを可能にするために、室温でスライドをインキュベートする。
- マウンティング培地（ProLongGold、Vectashieldまたは類似の）数滴を適用し、徐々にセクションの上にカバーガラスを配置。スライドを5分間暗闇に座って、[透明な爪でカバースリップの端をシールすることができます磨く。 15〜20分間、空気乾燥できるように。スライドは、現在、蛍光のいずれかをあまり失うことなく、数年前から視覚化または-20℃で保存することができます。
3.2。四肢の骨のセクション - オン - スライドの染色
- スライドは、-20℃の貯蔵からRTに戻ることができます。疎水性のバリアーペンを（スーパーパパニコロウ液体ブロッキングペン、テッドペラ社）を使用すると、ソリューションの豊富な層で染色することが骨の切片を含むスライド上の領域を外接。 10〜15分間風乾する。
- 5分間スライドあたり0.1 M PBを250μlと骨のセクションを洗い、さらに2回繰り返す。
- 洗浄溶液を捨て、ブロッキング溶液で骨のセクションをインキュベート、10％ヤギ血清と0.3％トリトンX - 100 4で1時間0.1 M PB（スライドあたりブロッキング溶液の250μlの）℃でで構成される
- 、ブロッキング溶液を捨て、一次抗体（または一次抗体の組み合わせで骨のセクションをインキュベートする場合に二重免疫標識の3.1.4で述べたように）4で18〜24時間250μlのブロッキング溶液℃で希釈しそれは、スライドは一次抗体溶液の乾燥を避けるために、密閉蓋付加湿チャンバー内に配置する必要があることに注意することは非常に重要です。末梢感覚神経線維を染色するためには、上記抗体のセットは、（セクション3.1.4を参照）同様の使用濃度で使用することができます。
- 室温で15分間、スライドごとにブロッキング溶液を250μl（トリトンX - 100で）で組織切片を洗浄し、さらに3回繰り返す。
- 洗浄溶液を捨て、4℃、適切なフルオロフォア標識二次抗体（通常はブロッキング溶液、250μlので1:1000に希釈）で骨のセクションをインキュベート℃に染色槽は、フルオロフォアの光退色を避けるためにアルミホイルで包まれている必要があります。利便性のために、それは暗い色の染色槽（例えばスライドのインキュベーショントレイ/ボックス、RPI社）を使用することをお勧めします。
- W室温で15分間スライドごとにブロッキング溶液を250μlと灰は骨のセクション。その後、室温で15分間、0.1M PB中の500μlの洗浄。最後に、室温で15分間、0.05 M PBの500μlの洗浄。のddH 2 Oで泳い簡単にスライドをリンスし、風乾（5-30分）に骨のセクションを可能にするために、室温でインキュベートする。光に長時間さらさないようにしてください。
- マウンティング培地（ProLongGoldまたは類似の）数滴を適用すると徐々にセクションの上にカバーガラスを配置。スライドを5分間暗闇に立って、その後透明なマニキュアでカバースリップの端をシールしてみましょう。 15〜20分の乾燥が可能です。スライドは蛍光を失うことなく、数年間は-20℃で保存することができます。
4。代表的な結果
4.1。足底パンチセクション
足底パンチの組織切片は、落射蛍光顕微鏡下で、または10X、40Xまたは63Xを目的とした共焦点顕微鏡下で可視化することができる。
図1 ADは、表皮真皮境界部で、軟骨や筋肉で、基底膜のIV型コラーゲン抗体（緑）で染色を示す。多数のCGRP -（AB、赤）およびNF200陽性繊維は（CD、赤）足底の領域（矢印）にマウスの皮膚全体に分散されています。 （;赤F）主にまた（;矢印緑色）CGRP陽性の小径線維に限局しているTRPV1染色が、一方β3-チューブリンは、汎神経マーカー（E、赤）です。とCは10倍目標（スケールバー-500ミクロン）で撮影した落射蛍光画像であり、B、D、EとFは60X客観的（規模で2μm刻みで撮影した11画像のz -スタックから生成された共焦点画像の複合材料です。バー - 50μm）を。
4.2。四肢の骨のセクション
四肢の骨の組織切片でも落射蛍光顕微鏡下で、または共焦点microscop下で可視化することができる10X、40Xまたは63Xを目的とした電子。
、抗NF200（CD、赤、矢印）、抗-β3-チューブリン（E、赤）および抗酸化TRPV1（F、赤）の共染色した。抗CGRP（矢印AB、赤）で免疫染色を図2に示す抗CGRP抗体（;アローズグリーン）付き。これらの画像は、マウスの大腿骨の海綿状の頭部の骨基質全体に分散感覚神経線維のサブタイプを示しています。とCは10倍目標（スケールバー-500ミクロン）で撮影した落射蛍光画像であり、B、D、EとFは60X客観的（規模で2μm刻みで撮影した11画像のz -スタックから生成された共焦点画像の複合材料です。バー - 50μm）を。
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Discussion
ここでは、末梢感覚神経線維の免疫染色と検出のためのマウスの皮膚と骨の組織切片の調製のための方法を紹介しています。足底パンチ生検から生成セクションは、両方の無毛と有毛皮膚を含む、これはプロトコルがどんな肌タイプに使用できることを意味します。これらの技術はまた、これらの組織内の他の細胞型（例えば、白血球、血管内皮、特に平滑筋）を染色するために用いることができる。これらのメソッドは、優れた最適な微細構造の保全との間の妥協（グルタルアルデヒド固定することによって達成されていますが、頻繁にエピトープと減少免疫染色の染色質の混乱の結果）と免疫細胞化学的検出能、厳密な方法で、手順に従っていれば、このステップバイステップを提供しています。
これらの組織における知覚神経線維の検出は、末梢神経突起伸長の調節の我々の理解を助けると4を発芽することができますよく別の病理学的条件下での末梢感覚求心性神経の解剖学的変化としての。さらに、正常な発達や病理学的状態における神経伝達物質、受容体、イオンチャネルや他の表現型マーカーの発現の変化はまた3,5-10を研究することができる。適切な、電気生理学的、生化学的および行動試験とともに、末梢感覚神経の染色パターンのような変化は、様々な痛みの状態6,9、炎症11および神経障害5,12に関連する仮説を検証するために使用することができます。結論として、これらの技術は、健康と病気における末梢感覚神経線維における規制と可塑性の獲得の私達の理解を深める他の解剖学的、付加的なアプローチを通じて取得した構造的、機能的データを、補完し補強するin vivoデータの貴重な情報源を提供しています。
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Disclosures
利害の競合が宣言されない。
Acknowledgments
彼女の継続的なヘルプと、この作業で建設的な批判のために博士とドナL.ハモンド、我々は、マウス足底パンチ生検の免疫染色の共焦点顕微鏡/イメージングの初期の標準化で彼の助けのための博士ユーリーM. Usachevに感謝。この作品は、NINDS / NIH（NS069898）からの補助金、およびDPMへの防衛前立腺がんの研究プログラムの国防総省（DoD - PCRP - 101096）からのアイデアの開発グラント賞によって資金を供給された
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 3mm Harris Micro-Punch | Material | Ted Pella, Inc. | 15094 | |
| Perfusion pump | Material | VWR international | 23609-170 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Fisher Scientific | T353 | |
| Picric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 239801 | |
| OCT Embedding compound | Reagent | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray | Material | Control Company | 3118 | |
| Goat Serum | Reagent | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) | Material | Research Products International Corp. | 248270 (tray) 248270-A (lid) | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Material | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) | Material | Ted Pella, Inc. | 11859 | |
| Pro‐Long Gold Mounting medium | Reagent | Invitrogen | P36930 |
References
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