Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

Published: January 26, 2012 doi: 10.3791/3485
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pharmacology, The University of Iowa, 2Department of Anesthesia, Roy J. and Lucille A. Carver College of Medicine, The University of Iowa

Summary

זיהוי Immunocytochemical של הפריפריה תת סיב עצב תחושתי (גילוי של ביטוי החלבון בו) הם המפתח להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תחושה היקפית. כאן אנו מתארים שיטות להכנת דגימות רקמה היקפי / הקרביים, כגון עצמות עור הגפיים, immunostaining מסוים של סיבי עצב היקפי חושית.

Abstract

איתור ועיבוד ראשוני של חומר כימי, פיזי גירויים חושיים תרמי ההיקפיים על ידי סיבי עצב תחושתי היא המפתח תפיסה חושית בבעלי חיים ובבני אדם. אלה סיבי העצבים התחושתיים ההיקפיים להביע שפע של קולטנים ערוץ חלבונים יון אשר לזהות ליזום גירויים חושיים ספציפיים. שיטות זמינים כדי לאפיין את התכונות החשמליות של סיבי עצב היקפי חושי innervating את העור, אשר יכול גם להיות מנוצל כדי לזהות את הביטוי הפונקציונלי של חלבונים ספציפיים ערוץ יון בסיבים אלה. עם זאת, שיטות אלקטרו דומים אינם זמינים (והם גם קשה לפתח) לצורך זיהוי של הביטוי הפונקציונלי של קולטנים וחלבונים ערוץ יון בשנת היקפי סיבי עצב תחושתי innervating אברי בטן אחרים, כולל הרקמות המאתגרים ביותר, כגון עצם. יתר על כן, שיטות אלקטרו כזה לא יכול להיות מנוצל על מנת לקבוע את הביטוי של החלבון לא להתרגשים של הפריפריה סיבי עצב תחושתי. לכן, immunostaining של דגימות רקמה היקפי / הקרביים עבור חמישיות העצבים התחושתיים מספק את הדרך הטובה ביותר ניתן לקבוע את הביטוי של חלבונים ספציפיים של עניין אלה סיבי העצב. עד כה, רוב המחקרים ביטוי החלבון עצב סנסורי להיות מנוצל immunostaining ההליכים בגרעיני חושי, שבו מידע מוגבל הביטוי של חלבונים מסוימים בגוף התא של סוגים מסוימים או תת נוירונים חושיים. כאן אנו מדווחים שיטות מפורט / פרוטוקולים להכנת דגימות רקמה היקפי / הקרביים עבור immunostaining של סיבי עצב היקפי חושית. אנחנו במיוחד שיטות פרט להכנת העור או ביופסיה plantar אגרוף העצם (עצם הירך) סעיפים מעכברים עבור immunostaining של סיבי עצב היקפי חושית. שיטות אלה לא רק מפתח להגדרה האיכותי של ביטוי החלבון עצב סנסורי הפריפריה, אלא גם לספק שיטה assay כמותיקביעת שינויים בביטוי רמות החלבון או תת סוגים מסוימים של סיבים חושית, כמו גם לקביעת שינויים מורפולוגיים ו / או אנטומי במספר וצפיפות הסיבים החושית במהלך מצבים פתולוגיים שונים. יתר על כן, שיטות אלה אינם מוגבלים רק כתמים של סיבי עצב תחושתי, אבל יכול לשמש גם עבור צביעת כל סוגי סיבי עצב בעור, עצמות ורקמות הקרביים אחרים.

Protocol

1. בעלי חיים זלוף

הנהלים כל חיה שבוצעה במחקר זה מאושרים על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש מאוניברסיטת איווה, ו-NIH ההנחיות לשימוש בבעלי חיים במחקר.

  1. ביום שלפני זלוף, להכין 1 ליטר של חיץ פוספט (0.2 מ 'PB ב כפול מזוקקים H 2 O, pH 7.4), וכן חנות ב 4 ° C. זה ישמש עבור תהליכים זלוף ופוסט קיבעון.
  2. ביום זלוף, להכין 500 מ"ל של paraformaldehyde 4.0% ב 0.1M PB (PFA, pH 7.4) פתרון מקבע, נפח מספיק זלוף של 2 עכברים: מיקרוגל 200 מ"ל של DDH 2 O בכוס זכוכית למשך 30 שניות או עד גישות רותחים. מוסיפים 20 גרם של גרגירי paraformaldehyde (PFA) אל כוס עם בחישה מתמדת מתחת למכסה המנוע קטר. הוסף 5 מ"ל של 5 N NaOH ירידה מבחינת ומערבבים עד פתרון מנקה. כאשר PFA נמס לגמרי, מגניב הפתרון בטמפרטורת החדר (RT). Slowly להוסיף 250 מ"ל של 0.2 מ 'PB תוך ערבוב רצוף. שימוש ונחלש פתרונות HCl (6 N ל N 1 ל 0.1 N), כדי להתאים את ה-pH 7.4. התאמת עוצמת השמע הסופי 500 מ"ל ומקררים על קרח. כמו כן להכין 400 מ"ל של 0.1 מ 'PB ממלאי M 0.2 ידי דילול 01:01 ב DDH 2 O ומקררים על קרח.
  3. להרדים את העכבר בזריקה intraperitonial ממנת יתר של חומר הרדמה (pentobarbital נתרן, 80 מ"ג / ק"ג, מנוהל באמצעות מחט 27G).
  4. במהלך זלוף, 50 מ"ל של 0.1 מ 'PB (לדלל 0.2 מ' מניות PB 01:01 עם DDH 2 O) ו - 150 מ"ל של PFA יועברו למחזור ברצף העכבר. הגדר את המשאבה peristaltic ידי מילוי צינור עם PB ותיקון מחט 23 02/01 G פרפר בקצה אחד. לטבול את הקצה השני של הצינור לתוך מבחנה המכילה 0.1 מ PB. קבע את המהירות של המשאבה peristaltic ל 10 מ"ל / דקה, ומשאבה באמצעות כמות מספקת של הפתרון כדי לוודא שאין בועות אוויר בצינור.
  5. המתן עדעכבר nesthetized כבר לא מראה כל פעילות רפלקס, כמו צביטה הבוהן / זנב רפלקס למצמץ. הנח את החיה בצד לנתיחה מגש הגחון בתוך ברדס קטר ולאבטח את הכפות עם הקלטת. תרסיס פרווה עם 70% אתנול. עושים חתך דרך העור לאורך קו האמצע כדי לחשוף את החזה ואת הרבעון העליון של דופן הבטן. לאחר מכן, לחתוך דרך דופן הבטן בבסיסו של בית החזה. לאחר ביצוע החתך הזה, את הסרעפת ואת הקצה התחתון של עצם החזה צריך להיות גלוי. לחתוך בזהירות משמאל לימין דרך השוליים של הסרעפת, ולאורך מלא של עצם החזה, נזהר שלא לגרום נזק לריאות. יש דימום מינורי מעצם החזה בשלב זה הוא נורמלי ולא תתפשר זלוף. לאחר החתך לאורך עצם החזה נעשה ואת לחתוך הסרעפת, זה צריך להיות אפשרי להרים את כל חצי של בית החזה כלפי מעלה וגם כלפי חוץ, כך הלב חשוף. הזז הצידה את הריאות במידת הצורך. שני חצאים של בית החזה יכולשיתקיים עמדה זו תוך שימוש מלחציים עוצר דמום. הכנס את מחט פרפר (23 02/01 G) מחוברת מ"מ המשאבה peristaltic 3-4 לתוך החדר השמאלי, מקביל לציר הארוך של החיה. מיקום זה ממזער את הסיכון של המחט המועתקת. ביצוע חתך קטן העלייה הימנית כדי לאפשר את זרימת לחזור לזרום החוצה של הלב.
  6. בגין זלוף עם 0.1 מ 'PB ב 10 מ"ל / דקה במשך 4-5 דקות. אם יש עדיין כמות משמעותית של דם שמקורם אטריום הזכות בשלב זה, להמשיך עד זרימה ברור.
  7. עצור את הזרימה של PB והמתג מפרצון על המשאבה peristaltic לפתרון PFA 4%. הפחת את קצב הזרימה עד 5 מ"ל / דקה ולהמשיך שאיבה פתרון PFA דקות 20-25. כפי PFA נכנס במחזור, השרירים נכנסים לעווית, ואחרי כמה דקות, בעל החיים צריך להיות ממש "קבוע" בתפקיד. קשיחות זו, ניתן לבדוק על ידי בעדינות דוחף נגד hindpaws, נזהרת שלא להזיז את חיהnd לעקור את הצינורית. זלוף טוב ימנע את איבר מן הפגנת בתגובה. לאחר זלוף עם PFA תושלם, הצינורית ואת מהדק עוצר דמום יכול להיות מנותקים הגופה לנתיחה מוכן רקמות. הגישה לנתיחה בשימוש תלוי ברקמה ספציפית.
  8. הכן 4% PFA / 5% (v / v) חומצה picric (רש"פ; לאיסוף שלאחר קיבוע של אגרוף plantar בלבד) על ידי הוספת חומצה רווי פתרון picric כדי PFA 4%. הכללה של הרשות משפר באופן משמעותי detectability אנטיגן ברקמות העצבית ההיקפית 1
  9. הכן העצם / סחוס פתרון רקמות decalcifying / cryoprotectant - EDTA 10% 0.1 M PB עם גליצרול 0.07% ו 15% סוכרוז. EDTA פתרונות מבוססי decalcify רקמות תוך שמירה epitopes 2.
  10. הכן את הפתרון cryoprotectant - סוכרוז 30% ב 0.1 M PB.

2. רקמות Dissection / הסרה, לאחר קיבוע ו חתך

  1. Plantar Punch
    מניחים את perfuבעלי חיים sed בצד הגחון על מחצלת חיתוך או משטח יציב אחר. החזקת plantar רגל פני למעלה, ולחץ בחוזקה כלפי מטה עם ביופסיה כלי (3 בקוטר מ"מ; האריס מיקרו אגרוף, טד פלה Inc) לאמצע כף הרגל. הפעל את הכלי ביופסיה הלוך ושוב דרך 180 מעלות כדי לאשר את כלי ביופסיה יש לחתוך את מכלול הכף האחוריות. להסיר בעדינות את הכלי ביופסיה של כף הרגל להוציא את הרקמה לתוך צינור סטרילי 2 מ"ל עם מכסה, המכילה 1 מ"ל של 4% PFA / 5% פתרון הרשות.
  2. לימב העצמות (עצם הירך דוגמה)
    ביצוע חתך רוחבי לאורך הגב של החיה ברמה של האגן, ממשיך לאורך שתי הגפיים האחוריות. גזור לתוך האגן, השרירים המקיפים להפריד את הירך מהאגן תוך השארת הראש הפרוקסימלי של עצם הירך ללא פגע. גזור לתוך השוקה / שוקית לעזוב את הראש הדיסטלי שלם, הסרת השריר שמסביב / periosteum מן הפיר העצם. מניחים את הירך לתוך צינור 2 מ"ל המכילה 1 מ"ל של 4% PFA /5% הרשות פתרון.
  3. פוסט לתקן את דגימות רקמה של 4% PFA / 5% הפתרון הרשות הפלסטינית, עם ערבוב עדין על כיסא נדנדה עבור שעות 16-18 ב 4 ° C
  4. Decalcify רקמת כדלקמן: עבור מקום plantar (עד decalcify העצמות הקטנות של כף הרגל) אגרוף המחץ רקמה צינורית סטרילית 2 מ"ל עם מכסה, המכיל 1.5 מ"ל של תמיסת EDTA 10% 0.1 M PB עם גליצרול 0.07% ו - 15 % סוכרוז. מניחים את הצינור על כיסא נדנדה עם ערבוב עדין במשך 16-18 שעות ב 4 ° C. עבור עצמות הגפיים במקום רקמה צינורית סטרילית 2 מ"ל עם מכסה, המכיל 1.5 מ"ל של תמיסת EDTA 10% 0.1 M PB עם גליצרול 0.07% ו 15% סוכרוז. מניחים את הצינור על כיסא נדנדה עם ערבוב עדין במשך 6-7 ימים 4 ° C. הפתרון decalcification יש לשנות את כל 24 שעות ואת רקמת פיקוח על אובדן של קשיחות עם זוג מלקחיים.
  5. העברת רקמה לתוך צינור סטרילי 2 מ"ל עם מכסה עם 1.5 מ"ל של תמיסת cryoprotectant (30% סוכרוז ב 0.1 M PB), והמקום צינור w על כיסא נדנדהith ערבוב עדין במשך 16-18 שעות ב 4 ° C.
  6. הכן רקמה חתך: מקום למיטה נפח טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) מתחם (סאקורה Finetek ארה"ב Inc) על בלוק cryostat רקמות הרכבה ולאפשר להקפיא בתא cryostat (נשמר בדרך כלל -20 ° C). תרסיס קירור (Cyto-להקפיא, בקרת ושות ארה"ב) יכול להיות גם ריססו על אוקטובר להאיץ את תהליך ההקפאה. רקמה מקום הדגימה על המיטה הזאת של אוקטובר ומכסים בשכבה דקה נוספת של אוקטובר בעדינות עם תרסיס זה אוקטובר תרסיס קירור עד שהוא קשוח הרקמה בתוך הקפיאה. הדגימה מקום על ראשו חיתוך בחדר cryostat ולאפשר לחסום הדגימה רקמות לאזן את הטמפרטורה חיתוך - לפחות 1 שעה. מנסה סעיף כאשר המתחם הטבעה הוא עדיין קר מדי תוצאות בסעיפים פריך נזק לרקמות.
  7. לאחר הרקמה הגיעה הטמפרטורה האופטימלית חיתוך, גזירה להתחיל את הדגימה וליצור סעיפים 40 מיקרומטר.
    8. עבור אגרוף plantar לאסוף את cryosections תוך 12-היטב בתרבות צלחות רקמה המכילה 0.1 מ 'PB עם אזיד הנתרן 10 מ"מ. ודא כי סעיפים להישאר שקוע בפתרון זה ב 4 ° C. מדורים יכול להיות מאוחסן באופן זה עד 4-6 חודשים לצורך immunostaining. לחילופין, ריחוף ללא סעיפים ניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל בתמיסה cryoprotectant ב -20 ° C (500 מ"ל 0.1 M PBS, pH 7.2, סוכרוז 30 גרם, 10 גרם PVP40, אתילן גליקול 300 מ"ל). כוונן את עוצמת הקול הסופית 1 ליטר עם מים מזוקקים) 3. עבור עצמות הגפיים לאסוף את cryosections ישירות על גבי שקופיות מראש מצופה ג'לטין (או Superfrost מגלשות בנוסף, פישר סיינטיפיק) ולאפשר לאוויר יבש עבור 1 שעה, לפני אחסון ב -20 ° C. סעיפים עצם בשקופיות מאוחסן בדרך זו יכול לשמש למטרות immunostaining בתוך 2-3 חודשים.

3. Immunostaining סעיפים רקמות על סיבי עצב תחושתי

3.1. Plantar אגרוףקטעים - מכתים סעיף צף

  1. בעזרת סכין גילוח, חתך 6-7 מ"מ מקצה טיפ 1 micropipette מ"ל. טרום המצב הפנימי של קצה על ידי aspirating 1% בסרום שור עוברית (FBS) של 0.1 מ 'PB מספר פעמים (זה מעכב דבק הסעיפים רקמה על הקירות של קצה). העברת חלקים אגרוף plantar להיות מוכתם על צלחת 24 גם בתרבית רקמה. בדרך כלל 8-10 סעיפים צריך להיות מוכתם לכל היטב כדי להבטיח כמה באיכות גבוהה סעיפים נוצרים לכל immunostaining.
  2. לשטוף חלקים אגרוף plantar עם 500 μl של 0.1 מ 'PB לכל היטב במשך 5 דקות עם ערבוב נמרץ על כיסא נדנדה ב RT. חזור על 2 יותר פעמים.
  3. מחק את הפתרון כביסה דגירה בסעיפים אגרוף plantar בחסימת הפתרון, המורכב בסרום עיזים 10% ו - 0.3% טריטון X-100 ב 0.1 M PB (500 μl של חסימת לכל פתרון טוב), עם ערבוב עדין על כיסא נדנדה עד 1 ש ' ב 4 ° C.
  4. מחק את פתרון חסימת דגירה בסעיפים רקמות antibo העיקריdy / נוגדנים בתמיסה מדוללת 250 μl חסימת עבור שעות 18-24 עם ערבוב עדין על כיסא נדנדה ב 4 ° C. בהתבסס על דרישות הניסוי של החוקר, immunolabeling יחיד (עם נוגדן ראשוני אחד כנגד חלבון מסוים או סיבים סמן עצב), או immunolabeling כפול (עם שני נוגדנים העיקרי נגד שני חלבונים או סמנים סיבי עצב) יכול להתבצע על סעיף דומה. בזמן ביצוע immunolabeling כפול חשוב לוודא כי שני נוגדנים העיקרי בשימוש גדלים מינים שונים מארח (למשל אחת שהורמה ​​עכבר אחד וגדל ארנב), או לחילופין, מטוהרים נוגדנים חד שבטיים שונים של אימונוגלובולין G (IgG) isotypes (למשל one IgG1 אחד IgG2a) ניתן להשתמש בו. רצוי לאטום את הצלחת עם Parafilm עבור incubations לילה, כדי למנוע התאדות מופרזת. על מנת להכתים את סיבי העצבים התחושתיים ההיקפיים, מספר נוגדנים ספציפיים ניתן להשתמש בו. נוגדנים נגד neurofilament החלבון 200 (NF200, Sigma) תווית large בקוטר הסיבים, בעוד קלציטונין גן הקשורות פפטיד (CGRP: Sigma) peptidergic ו הקולטן חולף vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) פוטנציאל התווית, בקוטר קטן סיבים חושית היקפי. כל סיבי העצבים ההיקפית יכולים גם להיות מוכתם נוגדנים כנגד טובולין-β3. בעור, קולגן IV (Abcam) משמש כדי לשרטט את קרום במרתף המפריד בין האפידרמיס של הדרמיס. ככלל, נוגדנים צריך להיות 5-10 פעמים מרוכזים יותר עבור מבוססי תאים בתרבית מבחני immunofluorescence, בדרך כלל ריכוז העבודה של 5-10 מיקרוגרם / מ"ל.
  5. שטפו את החלקים עם רקמות 500 μl של פתרון לחסימת (עם טריטון X-100) לכל היטב במשך 5 דקות עם ערבוב נמרץ על כיסא נדנדה ב RT. חזור 3 פעמים יותר.
  6. מחק את הפתרון כביסה וחתכים רקמות דגירה ב-fluorophore מצומדות נוגדנים מתאימים משני (בדילול מלא בדרך כלל 1:1000 לבלום, פתרון 500 μl) עם ערבוב עדין על כיסא נדנדה ב 4 ° C. MUS צלחתלא להיות עטוף בנייר אלומיניום, כדי למנוע photobleaching של fluorophores.
  7. שטפו את החלקים עם רקמות 500 μl של פתרון לחסימת לכל היטב במשך 10 דקות עם ערבוב נמרץ על כיסא נדנדה ב RT. לאחר מכן לשטוף עם 500 μl של 0.1 מ 'PB עם ערבוב נמרץ במשך 10 דקות ב RT. לבסוף, לשטוף עם 500 μl של 0.05 מ 'PB עם ערבוב נמרץ במשך 10 דקות ב RT.
  8. שימוש micropipette 1 מ"ל עם קצה FBS שטופלו (חתך 6-7 מ"מ מהקצה), לשאוב את הסעיפים מהצלחת רקמת התרבות על העברת SuperFrost בנוסף שקופיות מיקרוסקופ. סדר הסעיפים ולספוג חיץ לשטוף עודפי עם מכחול דק. המנעו מחשיפה ממושכת לאור. דגירה השקופיות ב RT, על מנת לאפשר סעיפים לייבש חלקים בשקופית (50-30 דקות).
  9. החל מספר טיפות של מדיום הרכבה (ProLongGold, Vectashield או דומה), לאט לאט למקום coverslip זכוכית על הסעיפים. אפשר השקופיות לשבת בחושך במשך 5 דקות, ואז לאטום את הקצוות עם מסמר coverslip שקוףלק. לאפשר ייבוש באוויר במשך 15-20 דקות. השקופיות ניתן כעת דמיינו או מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שנים ללא אובדן משמעותי של הקרינה.

3.2. עצם סעיפים לימב - על שקופית מכתים

  1. אפשר השקופיות לחזור RT מ אחסון -20 ° C. באמצעות עט מחסום הידרופובי (פאפ סופר נוזלי פן חסימה, טד פלה Inc) להותיר את האזור על השקופית המכילה את קטעי העצם להיות מוכתם בשכבה נדיבה של פתרון. אפשר לייבוש באוויר במשך 10-15 דקות.
  2. שטפו את החלקים עם עצם 250 μl של 0.1 מ 'PB לכל שקופית 5 דקות וחזור על פי 2.
  3. מחק את הפתרון כביסה דגירה בסעיפים עצם חסימת הפתרון, המורכב בסרום עיזים 10% ו 0.3% טריטון X-100 ב 0.1 M PB (250 μl של חסימת פתרון לכל שקופית) עבור 1 ש 'ב 4 ° C.
  4. מחק את פתרון חסימת דגירה בסעיפים העצם הנוגדן הראשוני (או שילוב של נוגדנים העיקרי, במקרהשל immunolabeling כפול כאמור תחת 3.1.4) מדולל פתרון חסימת μl 250 עבור 18-24 שעות ב 4 ° C. חשוב מאוד לציין את השקופיות יש להציב בתא humidified עם מכסה אטום, על מנת למנוע ייבוש של פתרון נוגדן ראשוני. על מנת להכתים את סיבי העצבים התחושתיים ההיקפיים, הנ"ל קבוצה של נוגדנים (ראה סעיף 3.1.4) ניתן להשתמש עם ריכוזי עובדים דומה.
  5. שטפו את החלקים עם רקמות 250 μl של פתרון לחסימת (עם טריטון X-100) לכל שקופית במשך 15 דקות ב RT וחזור במשך 3 פעמים.
  6. מחק את הפתרון כביסה דגירה סעיפים העצם fluorophore-מצומדות נוגדנים מתאימים משני (בדילול מלא בדרך כלל 1:1000 פתרון חוסם, 250 μl) בשעה 4 ° C. החדר מכתים חייב להיות עטוף בנייר אלומיניום, כדי למנוע photobleaching של fluorophores. לנוחיות, מומלץ להשתמש בצבע כהה לתאי מכתים (למשל הדגירה שקופיות תיבת מגש /, RPI קורפ).
  7. Wאפר בסעיפים עצם עם 250 μl של חסימת פתרון לכל שקופית במשך 15 דקות ב RT. לאחר מכן לשטוף עם 500 μl של 0.1 מ 'PB במשך 15 דקות ב RT. לבסוף, לשטוף עם 500 μl של 0.05 מ 'PB במשך 15 דקות ב RT. טובלים לרגע DDH 2 O לשטוף שקופיות ולאחר מכן לדגור על RT כדי לאפשר את הסעיפים העצם (50-30 דקות) אוויר יבש. המנעו מחשיפה ממושכת לאור.
  8. החל מספר טיפות של מדיום הרכבה (ProLongGold או דומה) ולאט לאט למקום coverslip זכוכית על הסעיפים. בואו השקופיות לעמוד בחשיכה 5 דקות, ואז לאטום את הקצוות coverslip עם לק שקוף. לאפשר ייבוש במשך 15-20 דקות. שקופיות ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שנים ללא הפסד של הקרינה.

4. נציג תוצאות

4.1. Plantar אגרוף בסעיפים

Plantar סעיפים אגרוף רקמה ניתן דמיינו epifluorescence תחת מיקרוסקופ או תחת מיקרוסקופ confocal עם מטרה, 10X 40X או 63X.

איור 1
באיור 1. מכתים להציג את המודעה עם קולגן IV נוגדן (ירוק) בממברנות במרתף, בצומת אפידרמיס-עורי והן סחוס ושרירים. רבים CGRP-(AB, אדום) ו-NF200 חיובי סיבים (CD, אדום) מופצים ברחבי העור העכבר באזור הפלנטרי (חיצים). β3-טובולין הוא סמן הפאן העצבית (E, אדום), ואילו TRPV1 מכתים (F; אדום) מוגבל בעיקר סיבים בקוטר קטן, כי הם גם CGRP חיובי (ירוק, ראשי חץ). A ו-C הם תמונות שצולמו עם epifluorescence מטרה 10X (סרגל קנה מידה -500 מיקרומטר); B, D, E ו-F הם חומרים מרוכבים תמונה confocal שנוצר מחסנית-z 11-תמונה נלקחה ב 2 מיקרומטר במרווחים תחת מטרה 60x (בסולם בר - 50 מיקרומטר).

4.2. עצם לימב בסעיפים

עצם לימב סעיפים רקמה יכולה גם להיות דמיינו epifluorescence תחת מיקרוסקופ או תחת microscop confocalדואר עם מטרה, 10X 40X או 63X.

איור 2
. איור 2 מראה immunostaining עם אנטי CGRP (AB, אדום, חיצים), אנטי NF200 (CD, אדום, חיצים), אנטי β3-טובולין (E; אדום) ואנטי TRPV1 (F; אדום) שיתוף מוכתם עם נוגדן אנטי CGRP (ירוק, חיצים). תמונות אלו מראות תת של סיבי עצב תחושתי בפריסה המטריצה ​​עצם באזור ראש עצם הירך הספוגית של העכבר. A ו-C הם תמונות שצולמו עם epifluorescence מטרה 10X (סרגל קנה מידה -500 מיקרומטר); B, D, E ו-F הם חומרים מרוכבים תמונה confocal שנוצר מחסנית-z 11-תמונה נלקחה ב 2 מיקרומטר במרווחים תחת מטרה 60x (בסולם בר - 50 מיקרומטר).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן יש לנו את השיטות מפורט להכנת העור העכבר רקמת העצם חלקים עבור immunostaining וזיהוי של סיבי עצב היקפי חושית. הסעיפים המופק plantar ביופסיות אגרוף להכיל העור glabrous ושעיר, כלומר פרוטוקול ניתן להשתמש על כל סוג העור. טכניקות אלה יכולים גם להיות מועסק להכתים סוגי תאים אחרים ברקמות אלה (לויקוציטים למשל, כלי הדם endothelia, שריר חלק, בין השאר). שיטות אלה מספקים פשרה מעולה בין שימור ultrastructural אופטימלי (אשר מושגת על ידי קיבוע glutaraldehyde, אבל לעתים קרובות התוצאות שיבוש epitopes ואיכות פחתה מכתים immunostaining) ו detectability immunocytochemical, אם הנהלים הם אחריו צעד אחר צעד באופן קפדני.

איתור של סיבי עצב תחושתי ברקמות אלו יכולים לסייע להבנת הסדרת תולדה neurite הפריפריה הנבטה 4,זה גם שינויים אנטומיים ב afferents חושית היקפי בתנאים פתולוגיים שונים. יתר על כן, שינויים בביטוי של נוירוטרנסמיטורים, רצפטורים, תעלות יונים או סמנים אחרים פנוטיפי בתנאים התפתחותי נורמלי או פתולוגי יכול להיות גם למד 3,5-10. יחד עם בדיקות אלקטרו, ביוכימיים והתנהגותיים המתאים, שינויים כאלה היקפי דפוסי מכתים חושי נוירון יכול לשמש כדי לבחון את ההשערות הקשורות מדינות כאבים שונים 6,9, 11 ו דלקת neuropathies 5,12. לסיכום, טכניקות אלו מספקים מקור רב ערך של בנתונים vivo משלים ומחזק אנטומיים אחרים, נתונים מבניים ותפקודיים רכשה באמצעות גישות נוספות, לקדם את ההבנה שלנו של התקנה ורכישה של פלסטיות של סיבי עצב היקפי חושית בריאות ומחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר יורי מ Usachev על עזרתו סטנדרטיזציה הראשונית של מיקרוסקופיה confocal / הדמיה של עכבר plantar immunostaining ביופסיה; וד"ר דונה ל המונד לעזרה המשיך אותה ביקורת בונה בעבודה זו. עבודה זו מומנה על ידי תרומות של NINDS / NIH (NS069898), ואת פיתוח רעיון הענקת פרס מהמחלקה תוכנית הביטחון מחקרים סרטן הערמונית (DoD-PCRP-101096) כדי DPM

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella, Inc. 15094
Perfusion pump Material VWR international 23609-170
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material Research Products International Corp. 248270 (tray) 248270-A (lid)
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella, Inc. 11859
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
  2. Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
  3. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
  4. Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
  5. Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
  6. Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
  7. Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
  8. Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
  9. Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
  10. Persson, A. -K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
  11. Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
  12. Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).

Tags

Neuroscience גיליון 59 כאב immunostaining סיבי העצב התחושתיים עור עצם אגרוף plantar CGRP NF200 TRPV1 טובולין
רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P.… More

Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter