Preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades

Resumen

Identificación de inmuno periféricos subtipos de fibras nerviosas sensoriales (y la detección de la expresión de proteínas en ella) son fundamentales para la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la sensación periférica. A continuación se describen los métodos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral, como los huesos y la piel del miembro, por inmunotinción específica de las fibras nerviosas sensoriales periféricas.

Resumen

Detección y procesamiento primario de los físicos, químicos y térmicos estímulos sensoriales de las fibras nerviosas sensoriales periféricas es la clave para la percepción sensorial en animales y humanos. Estas fibras nerviosas sensoriales periféricas expresan una gran cantidad de receptores y las proteínas de los canales iónicos que detectan e iniciar los estímulos sensoriales específicos. Se dispone de métodos para caracterizar las propiedades eléctricas de las fibras nerviosas sensoriales periféricas que inervan la piel, que también puede ser utilizado para identificar la expresión funcional de proteínas específicas de canales de iones en estas fibras. Sin embargo, los métodos electrofisiológicos similares no están disponibles (y también son difíciles de desarrollar) para la detección de la expresión funcional de los receptores y las proteínas de los canales iónicos en las fibras nerviosas sensoriales periféricas que inervan otras vísceras, incluidos los tejidos más difíciles, como los huesos. Por otra parte, estos métodos electrofisiológicos no puede ser utilizado para determinar la expresión de la proteína no excitabless en las fibras nerviosas sensoriales periféricas. Por lo tanto, la inmunotinción de muestras de tejidos periféricos / visceral de horario de oficina nervio sensorial ofrece la mejor manera posible para determinar la expresión de proteínas específicas de interés en estas fibras nerviosas. Hasta ahora, la mayoría de los estudios de expresión de proteínas en las neuronas sensoriales han utilizado los procedimientos de tinción en los ganglios sensoriales, donde se limita la información a la expresión de proteínas específicas en el cuerpo celular de tipos específicos o subconjuntos de neuronas sensoriales. Aquí mostramos los métodos detallados / protocolos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral de la inmunotinción de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. En especial, detalle los métodos para la preparación de la piel o el plantar biopsia en sacabocados y hueso (fémur) secciones de los ratones de la inmunotinción de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. Estos métodos no sólo son clave para la determinación cualitativa de la expresión de proteínas en las neuronas sensoriales periféricas, sino que también proporcionan un método de análisis cuantitativo paradeterminar los cambios en los niveles de expresión de proteínas en los tipos o subconjuntos específicos de las fibras sensoriales, así como para determinar los cambios morfológicos y / o anatómicas en el número y la densidad de las fibras sensoriales en varios estados patológicos. Además, estos métodos no se limitan a la coloración de las fibras nerviosas sensoriales sólo, pero también puede ser utilizado para la tinción de los tipos de fibras nerviosas de la piel, los huesos y el tejido visceral otros.

Protocolo

1. Los animales fueron perfundidos

Todos los procedimientos con animales realizados en este estudio son aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad de Iowa, y seguir las pautas del NIH para el uso de animales en la investigación.

1. El día antes de la perfusión, preparar 1 litro de solución amortiguadora de fosfato (0,2 M PB en doble destilada H ₂ O, pH 7,4), y se almacenan a 4 ° C. Esto será utilizado para los procesos de la perfusión y posterior fijación.
2. En el día de la perfusión, preparar 500 ml de 4,0% de paraformaldehído en 0,1 M PB (PFA, pH 7,4), solución fijadora, u....

Discusión

Aquí hemos detallado los métodos para la preparación de la piel del ratón y las secciones de tejido óseo para la inmunotinción y detección de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. Las secciones producido a partir de biopsias por punción plantar contienen la piel lampiña y peludo, lo que significa que el protocolo puede ser utilizado en cualquier tipo de piel. Estas técnicas también pueden utilizarse para teñir otros tipos de células en estos tejidos (leucocitos, el endotelio vascular, músculo liso, entre otros)........

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del Material	Tipo	Empresa	Catálogo N º	Comentario
3mm Harris Micro-Punch	Material	Ted Pella	15094
Perfusión de la bomba	Material	VWR International	23609-170
Paraformaldehído	Reactivo	Fisher Scientific	T353
Ácido pícrico	Reactivo	Sigma-Aldrich	239801
Octubre compuesto incrustación	Reactivo	Tissue-Tek	4583
Cito-congelación criogénica en aerosol	Material	Control de la Compañía	3118
De suero de cabra	Reactivo	Sigma-Aldrich	G9023
Incubación de la bandeja y la tapa de inmunotinción (Grande)	Material	RPI Corp.	248270 (bandeja) 248270-A (la tapa)
ImmEdge pluma barrera hidrofóbica	Material	Vector Laboratories	H-4000
Pinceles de pelo de camello (# 1 espesor)	Material	Ted Pella	11859
Pro-Long Oro Medio de montaje	Reactivo	Invitrogen	P36930