Summary
末梢感觉神经纤维亚型的免疫细胞化学鉴定（和蛋白表达其中的检测）底层外围感觉的分子机制的理解是关键。在这里，我们描述外设/内脏组织样本，特定的免疫外周感觉神经纤维，如皮肤和四肢骨骼的制备方法。
Abstract
检测和外周感觉神经纤维的物理，化学和热感官刺激的初级加工的关键是在动物和人类的感官知觉。这些外设的感觉神经纤维表达过多的受体和离子通道蛋白的检测，并启动具体的感官刺激。方法可用来描述末梢感觉神经支配的皮肤纤维，它也可以用来识别特定的离子通道蛋白在这些纤维的功能表达的电气性能。然而，类似的电生理方法是不可用的（和支配其他内脏器官，包括最具挑战性的组织，如骨的外周感觉神经纤维受体和离子通道蛋白的功能表达的检测也难以发展）。此外，这种电生理方法不能被用来确定非兴奋性蛋白的表达S的外周感觉神经纤维。因此，周边感觉神经fivers /内脏组织样本的免疫提供尽可能最好的方式，以确定这些神经纤维的利益的特定蛋白质的表达。到目前为止，大多数在感觉神经元蛋白表达的研究利用免疫程序在感觉神经节，其中的信息是有限的特定类型或感觉神经元亚群的细胞体在特定的蛋白质表达。在这里，我们报告的编制外周感觉神经纤维免疫外设/内脏组织样本的详细方法/协议。我们编制的皮肤或足底打孔活检和骨（股骨）从小鼠免疫外周感觉神经纤维的部分具体细节方法。这些方法不仅末梢感觉神经元蛋白表达的定性测定的关键，但也提供了定量分析方法确定特定类型或亚群的感觉纤维蛋白表达水平的变化，以及确定在感觉神经纤维的数量和密度在各种病理状态的形态和/或解剖变化。此外，这些方法并不局限于只感觉神经纤维的染色，但也可以使用任何类型的神经纤维染色的皮肤，骨骼和其他内脏。
Protocol
1。动物灌注
在这项研究中的所有动物进行的程序是机构动物护理和使用爱荷华大学委员会批准，并按照NIH的指导方针，在研究中使用动物。
- 在灌注前一天，准备1 L的磷酸盐缓冲液（0.2 M PB，pH值7.4双蒸H 2 O），并储存在4 ° C这将是用于灌注和后固定过程。
- 灌注一天，准备500毫升的4.0％多聚甲醛在0.1M PB（煤灰，pH值7.4）固定液，音量足够灌注2小鼠：微波200毫升的 DDH 2 O在玻璃烧杯，持续30秒或直到它接近沸点。与通风柜下不断搅拌烧杯中添加20克颗粒多聚甲醛（PFA）。加入5毫升的5 N NaOH下降明智和搅拌，直到溶液清除。当煤灰完全溶解，冷却至室温（RT）的解决方案。和Slowly加入250毫升的0.2 M PB，同时不断搅拌。使用逐步较弱盐酸解决方案（6 N到1 N到0.1 N的），调整pH值至7.4。调整最终体积至500毫升和冰浴。还准备从0.2 M的股票在DDH 2 O和寒意冰1:1稀释400毫升为0.1米PB 。
- 麻醉intraperitonial注射过量的麻醉（戊巴比妥钠，80毫克/公斤，与27G针管理）鼠标。
- 在灌注，50毫升0.1M的PB（稀释0.2 M PB股票1:1与DDH 2 O）和150毫升煤灰顺序被传递到老鼠的流通。蠕动泵，填补用PB管，一端固定在一个23 1 / 2 G蝴蝶针。油管的另一端浸入含有0.1中号PB的烧杯。通过设置足够的金额，以确保有管路中无气泡的一个解决方案的速度10毫升/分钟的蠕动泵和泵。
- 等待，直到在一个nesthetized鼠标不再显示任何反射活动，如脚趾/尾捏和眨眼反射。奠定一个夹层托盘腹侧通风柜内的动物和安全的爪子，用胶带。喷雾用70％乙醇的皮毛。通过皮肤，沿中线切口，显露胸腔和腹壁至上季度。然后，穿过腹壁，胸腔的基础。此切口后，膈肌和较低的胸骨年底应可见。通过膜片的保证金左到右，沿胸骨全长小心剪去，注意不要损害肺部。从胸骨在这个阶段的一些轻微出血是正常的，不会妥协的灌注。一旦切口沿胸骨已经取得了膜片切割，它应该是可以解除的肋骨向上和向外，这样暴露心脏是各占一半。移动预留的肺部如果有必要。胸腔的两个半在这个位置上使用止血夹子举行。插入的蝴蝶针（23 1 / 2 G）的蠕动泵进入左心室3-4毫米，动物的长轴平行。这安置最大限度地减少了针脱落的风险。做一个小切口右心房允许返回循环流动的心脏。
- 用0.1 M PB在开始灌注10毫升/分钟4-5分钟。如果仍然有显著的右心房，在这一点产生的血液量，继续，直到流是明确的。
- 停止PB的流量和交换机上蠕动泵入口到4％PFA解决方案。降低流速至5毫升/分钟和20-25分钟，恢复抽水煤灰解决方案。由于煤灰进入流通，肌肉痉挛，几分钟后，应当在动物字面意思是“固定”的位置。这种刚性可以轻轻推对hindpaws，照顾不搬动物测试ND打跑套管。良好灌注，防止肢体弯曲响应。一旦与煤灰灌注完成，插管和止血夹子可以断开连接，并准备组织剥离的尸体。夹层采用的方法取决于具体组织。
- 准备4％PFA / 5％（V / V）苦味酸（PA;收集和固定后仅足底冲床）加入饱和苦味酸溶液，4％的煤灰。列入PA的显著提高抗原1在周围神经组织的可探测性
- 准备骨/软骨组织脱钙/冷冻保护剂的解决方案 - 0.1M的PB 10％EDTA，0.07％甘油和15％的蔗糖。 EDTA为基础的解决方案，同时保留表位 2除垢组织。
- 准备的冷冻保护剂的解决方案 - 30％在0.1 M PB蔗糖。
2。组织剥离/去除，后固定和切片
- 足底冲床
放置的灌注SED动物腹侧切割垫或其他坚固的表面上。抱足跖面，按打孔活检工具（3毫米直径;哈里斯微冲，特德佩拉公司）牢固地插入脚的中间。通过180度转动活检工具来回确认通过后爪全部切活检工具。从脚下轻轻地取出活检工具和退出到第2毫升无菌管组织，含有1毫升4％/ 5％煤灰PA解决方案。 - 肢体骨（如股骨）
沿骨盆水平的动物的回一个外侧切口，两侧后肢持续下降。切成骨盆周围的肌肉分开股骨，骨盆，而离开股骨近端头完好无损。胫/腓骨切离开远端头完好无损，消除骨干周围肌肉/骨膜。股骨放入2毫升中含1毫升4％PFA /管5％的PA解决方案。 - 修复后在4％/ 5％的煤灰PA解决方案的组织样本，轻轻混合16-18 h摇杆，在4 ° C
- 除垢的组织如下： 足底冲床 （除垢脚下的小骨头）地方与第2毫升在无菌管组织冲床，包含在0.1 M PB 1.5与0.07％甘油和15毫升10％EDTA溶液％的蔗糖。放在摇杆与轻度混合为16-18 h，在4 ° C。 对于四肢骨骼的地方组织与第2毫升在无菌管，10％EDTA溶液1.5毫升含0.07％的甘油在0.1 M PB与管15％的蔗糖。与轻度混合摇杆放在管6-7天，在4 ° C脱钙液应改为每24小时和一双镊子刚性损失监察组织。
- 转移到无菌的2 ml管组织第1.5毫升的冷冻保护剂溶液（30％在0.1 M PB蔗糖），放在摇杆瓦特管第i个轻度混合16-18小时于4 ° C。
- 准备组织切片的最佳切削温度的床体积（OCT）的化合物在低温恒温器安装组织块（樱花Finetek美国公司）和允许冻结在低温恒温器室（通常维持在-20 ° C）。 A低温气溶胶（细胞冻结，美国控制有限公司），也可以喷洒在华侨城加速冻结过程。放在床的华侨城组织标本，并与华侨城一层薄薄的额外覆盖。轻轻喷低温气溶胶华侨城，直到它已硬化和组织内冻结。允许将试样在低温恒温室到切割头和组织标本块切削温度平衡 - 至少1小时。试图以节时嵌入化合物仍是太冷结果脆性部分和组织损伤。
- 一旦组织已经达到了最佳的切削温度，开始切割试样，产生40微米的部分。
3。感觉神经纤维的免疫染色组织切片
3.1。足底冲床部分 - 浮动部分染色
- 使用刀片，切6-7毫米，从1毫升的微量提示。在0.1M的PB多次吸1％胎牛血清（FBS），（抑制坚持组织切片提示墙壁）的尖端内部前置条件。足底一拳部分转移到24孔组织培养板染色。一般8-10部分应染色，每口井，以确保高品质的几个部分，每免疫产生。
- 洗净用500μl0.1 M的PB每口井为大力在RT摇杆搅拌5分钟的足底冲床部分。重复2次以上。
- 倒掉洗涤液，封闭液，10％山羊血清和0.3在0.1％的Triton X - 100米PB（500μL封闭液，每孔）组成孵化足底冲床部分轻轻混合为1小时摇杆，在4 ° C
- 丢弃阻塞的解决方案，并组织切片孵育在小学antiboDY /抗体稀释温和混合摇杆为18-24 h，在250μL封闭液在4 ° C根据研究者的实验要求，单一的免疫标记（对一个特定的蛋白质或神经纤维标记抗体），或双免疫标记（对两种蛋白质或神经纤维标志的主要有两个抗体）可以在同一节。在执行双重免疫标记是很重要的，以验证使用的两个主要抗体是提出在不同的宿主物种（例如，一个在小鼠和兔提出提出），或者，纯化不同的免疫球蛋白G（IgG）的亚型（如单克隆抗体IgG1和IgG2a）都可以使用。可取的做法是，用封口膜密封板一夜之间孵化，以避免水分蒸发过快。为了周边感觉神经纤维染色，一些特异性抗体可以使用。对蛋白抗体神经丝蛋白200（NF200;西格玛）标签LARGE -直径的纤维，而降钙素基因相关肽（CGRP;西格玛）和瞬时受体电位香草1（TRPV1受体，Neuromics）标签肽，小直径的外周感觉神经纤维。所有末梢神经纤维也可与β3-微管蛋白抗体染色。皮肤，IV型胶原（Abcam公司）是用来描述分离的表皮从真皮的基底膜。作为一般规则，抗体需要培养的细胞为基础的免疫检测，通常在5-10微克/毫升的浓度，超过集中的5-10倍。
- 组织切片洗净与500μL封闭液（TRITON X - 100）每5分钟的剧烈混合在RT摇杆。重复3次以上。
- 丢弃在适当的荧光标记的二抗温和混合摇杆（通常稀释1:1000封闭液，500μL）的清洗液和孵化组织切片在4 ° C。板块亩被包裹在铝箔，以避免光漂白的荧光团。
- 洗净阻塞的解决方案，每以及10分钟的剧烈混合在RT摇杆与500μL组织切片。大力为在室温下10分钟搅拌，然后用500μL0.1 M的PB。最后，用500μL0.05 M PB大力为在室温下10分钟搅拌。
- FBS的治疗头（从末端切6-7毫米）使用1毫升微量的，吸的部分，从组织培养板和转移到SuperFrost 加上显微镜玻片上。安排的部分，并用细的画笔吸收多余的洗涤缓冲液。避免长时间暴露在光线下。在室温下孵育的幻灯片，为了让部分干上滑动的部分（5-30分钟）。
- 申请安装介质（ProLongGold，Vectashield或类似）数滴，慢慢地放到部分玻璃盖玻片。允许的幻灯片，在黑暗中坐5分钟，然后密封盖玻片边缘透明的指甲波兰。允许空气干燥15-20分钟。幻灯片现在可以没有任何显著的荧光损失几年的可视化或储存在-20 ° C。
3.2。肢体骨部分 - 幻灯片染色
- 允许的幻灯片返回到RT从-20 ° C储存。使用疏水性障碍笔（超巴氏液体阻塞钢笔，特德佩拉公司）circumscribe该地区的含骨与解决方案的慷慨层染色切片的幻灯片。允许空气干燥10-15分钟。
- 洗骨部分与250μL0.1 M的PB每张幻灯片为5分钟，重复2次以上。
- 弃洗涤液，封闭液，10％的山羊血清和0.3％的Triton X - 100的在0.1中号PB阻止每张幻灯片的解决方案（250μL）1小时4 ° C。组成孵化骨节
- 丢弃阻塞的解决方案，并在主抗体（或初级抗体结合孵育骨部分，在案件根据3.1.4中提到的双重免疫标记）稀释250μL封闭液18-24 h，在4 ° C。这是非常重要的需要注意的幻灯片必须放置在一个密封的盖子湿盒，以避免初级抗体溶液干燥。为了周边感觉神经纤维染色，上述设置（见3.1.4节）的抗体，可以用类似的工作浓度。
- 每250μL封闭液在室温下15分钟的幻灯片（TRITON X - 100）组织切片洗净，重复3次以上。
- 弃洗涤液，骨部分在适当的共轭荧光抗体（通常稀释于封闭液，250μL1:1000）孵育4 ° C。染色室必须包裹在铝箔，以避免光漂白的荧光团。为方便起见，最好是使用深色的染色商会（如幻灯片孵化托盘/盒，RPI的公司）。
- W灰堵在室温为15分钟，每张幻灯片的解决方案与250μL的骨骼部分。在室温为15分钟，然后用500μL0.1 M的PB。最后，用500μL0.05 M PB在室温下15分钟。浸在DDH 2 O简要冲洗幻灯片，然后在室温下孵育，为了让骨部分空气干燥（5-30分钟） 。避免长时间暴露在光线下。
- 申请安装介质（ProLongGold或类似）数滴，慢慢地放到部分玻璃盖玻片。让幻灯片站在黑暗5分钟，然后用透明的指甲油密封盖玻片的边缘。允许干燥15-20分钟。幻灯片可存放数年无荧光的损失，在-20 ° C。
4。代表性的成果
4.1。足底冲床组别
足底冲床组织切片可以epifluorescence显微镜下，或共聚焦显微镜下一个10X，40X或63X的目标。
图1。广告显示基底膜IV型胶原抗体（绿色）染色，在表皮真皮交界处的软骨和肌肉，。许多CGRP -（AB，红色）和NF200阳性纤维（CD，红）是分布在整个足底地区的老鼠的皮肤（箭头）。 β3-微管蛋白是泛神经元标记（E，红色），而辣椒素染色（红色）主要限于小直径的纤维也CGRP的阳性（绿色;箭头）。 A和C是10倍的目标（比例尺-500微米）的epifluorescence图像，B，D，E和F下采取的一个60X的目标（规模11影像在2微米的增量Z - Stack的共聚焦图像生成的复合材料酒吧 - 50微米）。
4.2。四肢骨节
肢体骨组织切片也可以可视化epifluorescence显微镜下，或下焦microscopE一个10X，40X或63X的目标。
图2显示了免疫与抗- CGRP（AB，红色;箭头），抗- NF200（CD，红色;箭头），抗β3-微管蛋白（E，红色）和反辣椒素（F，红）合作染抗- CGRP的抗体（绿色箭头）。这些图像显示的感觉神经纤维分布在小鼠股骨的海绵头地区的骨基质的亚型。 A和C是10倍的目标（比例尺-500微米）的epifluorescence图像，B，D，E和F下采取的一个60X的目标（规模11影像在2微米的增量Z - Stack的共聚焦图像生成的复合材料酒吧 - 50微米）。
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Discussion
在这里，我们有详细的老鼠的皮肤和外周感觉神经纤维的免疫组化和检测骨组织切片的制备方法。从足底打孔活检产生的部分包含皮肤光洁，毛，这意味着可用于任何皮肤类型的协议。这些技术也可以在这些组织染色的其他类型的细胞（如白细胞，血管内皮细胞，平滑肌等等）。这些方法提供之间最佳的超微结构保存很好的折衷（这是由戊二醛固定实现，但经常在表位的破坏和削弱免疫组化染色质量结果）和免疫探测，如果遵循的程序是一个严谨的态度一步一步。
在这些组织中的感觉神经纤维的检测可以帮助我们了解周围突起生长调节和发芽4，小号以及在不同病理条件下的外周感觉传入的解剖变化。此外，神经递质，受体，离子通道或其他正常发育或病理条件下的表型标记的表达的变化也可以进行研究3,5-10。随着适当的电生理，生化和行为测试，周边感觉神经元染色模式的这种变化，可以用来测试相关的各种疼痛状态6,9 11，炎症和神经病变5,12的假设。总之，这些技术提供了一种在体内的数据，补充和加强其他解剖，通过其他办法获得的数据结构和功能，进一步加强我们在健康和疾病的周边感觉神经纤维的可塑性的调节和收购的认识的宝贵源泉。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢他的帮助下，尤里M · Usachev博士/鼠标足底冲床活检免疫共聚焦显微镜成像的初步标准化;和唐娜L。哈蒙德博士为她继续在这项工作中的帮助和建设性的批评。这项工作是由从NINDS / NIH（NS069898）的赠款，并从国防部前列腺癌研究计划署（DOD - PCRP 101096）的一个想法发展到DPM的补助金
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 3mm Harris Micro-Punch | Material | Ted Pella, Inc. | 15094 | |
| Perfusion pump | Material | VWR international | 23609-170 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Fisher Scientific | T353 | |
| Picric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 239801 | |
| OCT Embedding compound | Reagent | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray | Material | Control Company | 3118 | |
| Goat Serum | Reagent | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) | Material | Research Products International Corp. | 248270 (tray) 248270-A (lid) | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Material | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) | Material | Ted Pella, Inc. | 11859 | |
| Pro‐Long Gold Mounting medium | Reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
- Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
- Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
- Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
- Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
- Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
- Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
- Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
- Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
- Persson, A. -K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
- Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
- Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).
