Summary
وصفت وسيلة سريعة لإجراء immunostaining القلب الجنينية الزرد. بالمقارنة مع نهج جبل immunostaining كله ، هذا الأسلوب يزيد بشكل كبير من انتشار الأجسام المضادة ، والذي يسمح بالحصول على صور عالية الدقة التي تكشف عن الهياكل الخلوية / التحت خلوية في القلب في غضون فترة زمنية أقل بكثير التجهيز.
Abstract
الزرد الجنين تصبح شعبية في الفقاريات نموذج الجسم الحي لدراسة التنمية القلب وأمراض القلب البشري بسبب علم الأجنة وعلم الوراثة لها فائدة 1،2. حوالي 100-200 الأجنة متوفرة في كل أسبوع من زوج واحد من السمك الكبار. الأجنة الشفافة التي وضع الرحم السابقين يجعلها مثالية لتقييم عيوب القلب 3. ويمكن التلاعب بها على التعبير عن أي الجينات عبر تقنية الحمض النووي الريبي morpholino أو الحقن 4. علاوة على ذلك ، لقد ولدت قدما شاشات الوراثية بالفعل قائمة من المسوخ التي تؤثر على وجهات نظر مختلفة لتخلق القلب 5.
جبل immunostaining كله هو أسلوب هام في هذا النموذج الحيواني للكشف عن نمط التعبير عن هذا البروتين إلى الأنسجة المستهدفة خاصة 6. ومع ذلك ، فقد كانت الصور ذات الدقة العالية التي يمكن أن تكشف عن الهياكل الخلوية أو التحت خلوية الصعبة ، ويرجع ذلك أساسا إلى locat البدنيةايون القلب وتغلغل الفقيرة من الأجسام المضادة.
هنا ، نقدم طريقة لمعالجة هذه الاختناقات التي تشريح قلبية للمرة الأولى وإجراء عملية التلوين ثم على سطح شريحة المجهر. لمنع فقدان العينات الصغيرة والقلب لتسهيل التعامل مع حل ، ونحن يقتصر عينات القلب ضمن دائرة على سطح المجهر الشرائح التي رسمها قلم immEdge. بعد التلوين ، ويمكن للاشارات مباشرة عن طريق الملاحظة مضان المجهر المركب.
لدينا وسيلة جديدة تحسن كبير في اختراق للأضداد ، لأن القلب من الأسماك الجنينية يتكون فقط من طبقات الخلايا قليلة. ويمكن الحصول على صور ذات جودة عالية من قلوب سليمة ضمن الموكب الكثير من الوقت لخفض الأجنة الزرد الذين تتراوح أعمارهم بين يوم 2 إلى 6 أيام. يمكن أن يكون لدينا وسيلة لتمديد يحتمل صمة تشريح الأجهزة الأخرى سواء من الزرد أو الحيوانات الصغيرة الأخرى.
Protocol
1. إعداد الشرائح وغرفة ترطيب
- يمكن جعل غرفة ترطيب من مربع مثل مربع تلميح تفرغ. التفاف كل من الغرفة وتغطية برقائق الألومنيوم لحماية العينات بعيدا عن الضوء.
- داخل الغرفة ، ووضع كومة من المناشف الورقية الرطبة للحفاظ على الرطوبة داخل الغرفة ، والتي سوف يمنع عينات من القلب التجفيف. تعيين microplate صغيرة على الجزء العلوي من منشفة ورقية كما رف للشرائح.
- رسم خطوط أو دوائر إما على سطح شريحة المجهر باستخدام القلم immEdge جعل الآبار للحصول على عينات من القلب مع البعد عن 5x5 ملم. السماح للشرائح الجافة.
- وضع الشرائح في غرفة ترطيب وإضافة جديدة 50ul الفورمالديهايد 4 ٪ في كل بئر.
2. تشريح القلب الجنينية
- تخدير الجنين الأسماك في المياه التي تحتوي على البيض E3 7 tricaine 0.4 ٪ لمدة دقيقة تقريبا حتى 1 الأسماك وقف حركة الجسم ولكن لا يزال القلب الطبيعيالضرب.
- وضع شريحة المجهر مقعرة على مرحلة مجهر تشريح. نقل الأجنة إلى البئر concaved.
- ضبط تركيبة ضوء مجهر تشريح لتكشف بوضوح القلب. اعتمادا على تفضيل شخصي ، قد يكون إما حقل مظلم أو مدينة دبي للإنترنت ، مثل حالة الضوء المستقطب.
- محاقن نظيفة الأنسولين مع اثنين من الايثانول 75 ٪ ، ثم الجافة.
- ضبط مجهر تشريح لارتفاع التكبير والتركيز على القلب. الإصلاح جسديا الجنين عن طريق إدخال إبرة في طرف واحد الحدود صفار البيض الجسيدة قريبة من الرأس. ادخال آخر قريب الإبرة إلى منطقة القلب وسحب القلب بسرعة. إذا لم يتم فصلها تماما عن قلب الجنين ، قطع الأنسجة المتبقية المتصلة بين القلب وصفار البيض و.
- ضبط المجهر لخفض التكبير والتركيز على القلب المشتتة. استخدام pipetteman 10μl وتعيينها إلى حجم 1μl. تطبيق غيض من pipetteman لرسم أو لمسقلب العينة ، بحيث ستكون معزولة القلب سواء داخل أو تعلق على سطح الحافة.
- تراجع غيض ماصة في محلول الفورمالديهايد 4 ٪ على شرائح معدة وتضغط على المكبس ماصة للافراج عن القلب إلى حل. التوتر على سطح الماء يساعد أيضا على إطلاق سراح القلب من ماصة الحافة إلى الحل. وضع أقل من 3 في قلوب كل بئر.
3. Immunostaining
- إغلاق الغرفة ووضعها على شاكر مع حركة هزاز لطيف. الإصلاح العينة القلب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تمحو الماء على الجزء الخلفي من الشرائح ووضع الشرائح على مسرح المجهر تشريح لتبادل العازلة.
- تراجع غيض من pipetteman 10μl في منطقة فارغة في كل بئر والحفاظ على تلميح إلى أقصى حد ممكن من عينات القلب. أخذ يحذر لتجنب القلب المترتبة على الحافة ، حيث يمكن أن تتحرك قلوب مع تدفق المياه عندما يوجه الى حل غيض. تغييرتوطين الطرف ، إذا لزم الأمر.
- تخلص من حل على منديل ورقي وتجنب إنتاج أي فقاعات في الطرف منذ يضيع بسهولة العينة القلب في وجود فقاعات الهواء. يمكن الحفاظ على العينات القلب الجافة جزئيا لفترة قصيرة تساعد على قلوب البقاء تعلق على الشرائح.
- إضافة 50μl PBST لتغطية عينة القلب واحتضان في غرفة ترطيب في حركة بطيئة هزاز لمدة 5 دقائق. تكرار شطف مرة أخرى. بعد هذه الخطوة ، يمكن تخزين العينات القلب في غرفة ترطيب تصل إلى 1 في الاسبوع 4 درجات مئوية.
- كتلة العينة القلب مع مصل الأغنام 10 ٪ في PBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان العينة القلب مع الأجسام المضادة الأولية ، مثل تخفيف 1:200 β - catenin الأضداد و1:200 تخفيف mef2 الضد محددة ، في الأغنام 10 ٪ مصل / PBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل القلب مع عينة مرات PBST الثلاثة (5 دقائق. لكل منهما) في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان العينة مع الثانويالأضداد ، مثل تخفيف 1:1000 اليكسا الموسومة الماوس المضادة و / أو الأجسام المضادة المقاومة للأرنب ، في PBST عن 0.5 ساعة.
- يغسل القلب مع عينات مرات PBST الثلاثة (5 دقائق. لكل منهما) في درجة حرارة الغرفة.
4. التصوير
- إزالة PBST وإضافة 10 ميكرولتر متوسطة متزايدة لكل بئر. صخرة الغرفة لعدة دقائق حتى يصبح الحل واضحا.
- إزالة معظم المتوسطة التركيب وتغطية جميع الآبار في شريحة واحدة مع ميكروسكوب الغطاء (24x50).
- صورة القلب الأسماك باستخدام مجهر زايس Axioplan 2 مجهزة ApoTome (كارل زايس).
5. ممثل النتائج
ويظهر مثال الصورة التي تكشف الغشاء ونوى جميع العضلية الزرد في الشكل. 1. واستخدمت والأضداد mef2c β catenin معا لصبغ العينات القلب تشريح الجنين من 52 HPF الزرد. بينما بقع الضد mef2c نوى الخلايا العضلية ، β - cateninالضد يكشف حدود كل خلية 80-10. عن طريق ضبط مرحلة من مراحل المجهر المركب ، يمكن تعديلها صورا لعينات من القلب الى التوجه نفسه ، والتي سوف تسمح للمراقبة انحناء الخارجي والداخلي انحناء في القلب 11. ويمكن بعد ذلك عدد cardiomyocyte مجموع cardiomyocyte حجم الخلية ، ويمكن قياس دائرية.
مثال آخر هو مبين الذي يكشف عن بنية sarcomeric من القلب الجنينية في الشكل. 2. أجرينا immunostaining باستخدام F59 ، وهو جسم الميوسين ، في قلب جنينية تشريح. ويمكن للشبكة myofibril في قلب جنينية كشفت بوضوح كامل في أقل التكبير ، بينما يمكن كشف الفرقة المخططة من خيوط سميكة على أعلى التكبير (الشكل رقم 2) 6.
الشكل 1. Immunostaining من mef2 (الحمراء) ، وβ - catenin (الخضراء) لإظهار النوى وoutlإيناس الخلايا العضلية في البطين الزرد. شريط مقياس = 10μm
الشكل 2. Immnostaining من الميوسين لاظهار خيوط سميكة في البطين الزرد إما في التكبير المنخفض (أ) أو تكبير عالية (B). شريط مقياس = 10μm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بالمقارنة مع الأساليب الكلاسيكية كلها immunostaining جبل ، لدينا وسيلة لديه المزايا التالية. أولا ، يمكن الفلورسنت أقوى بكثير الإشارات التي تم الحصول عليها باستمرار نظرا لتغلغل المحسنة. في أسلوب جبل immunostaining كله ، وأنسجة الجلد الكثيفة المحيطة القلب إلى خفض كبير في اختراق العديد من الأجسام المضادة ، مما أدى إلى ارتفاع الخلفية في الجسم كله. هذه المشكلة الحادة وخاصة بالنسبة للأجنة مضى عليها أكثر من 3 أيام بعد الإخصاب (DPF). في المقابل ، فإن قلوب تشريح تتألف فقط من طبقات الخلايا قليلة ، مما يجعل الاختراق أفضل بكثير. وثانيا ، بسبب انتشار وتحسنت كثيرا ، ويمكن تخفيض هذه العملية برمتها من 1 immunostaining اليوم لعدة ساعات فقط. خفضنا بنجاح فترة حضانة من 1 ساعة و 30 دقيقة لبعض الأجسام المضادة مثل Actinin ، Integin مرتبطة كيناز (أمثاله) ، و β - catenin أضداد محددة. ويمكن الثالث ، صور عالية الدقة التي تم الحصول عليها باستمرار من قلوب سليمةلتكشف عن معلومات الخلوية / التحت خلوية. بسبب الترجمة من القلب داخل كيس التامورية التي تقع بجوار صفار ، لا يمكن أن أعلى عدسات التكبير موضوعية يمكن استخدامها لأجنة صورة سليمة. ولذلك ، فإن القلب تحتاج إلى تشريح إذا كانت هناك حاجة لقلب الصور سليمة. ومع ذلك ، مثل المنظفات 100 تريتون السينية التي تستخدم لتحسين الاختراق الداخلي في جبل تلطيخ كله يضعف الأجنة. نتيجة لذلك ، يتم كسر قلوب بسهولة أثناء إجراء تشريح. في المقابل ، يعيش في القلب أقوى بكثير ، والتي يمكن فصلها بسهولة من الأنسجة المجاورة لها. لذلك ، يتم بسهولة أكبر حافظت التشكل سليمة باستخدام الطريقة المقترحة. على الرغم من أن تشريح القلب الزرد الصغيرة قد تبدو صعبة ، يمكن لمعظم الناس بسهولة سلوك هذا الإجراء بعد عدة ممارسات.
وقد استخدمت هذه الطريقة لأننا صمة قلوب الذين تتراوح أعمارهم من 2 إلى 6 DPF DPF. بسبب موقعه الفعلي ، وقلوب من ايرل حتىنظمت هيئة الإنصاف والمصالحة الأجنة يصعب تشريح. يبقى أن يحدد ما إذا كان يمكن تعديل هذه الطريقة ليرقة أو قلوب الكبار. فمن المفيد أن نشير إلى أن الضرر المحلي إلى القلب قد يؤدي أثناء عملية التشريح ، والذي ينطوي على القوة البدنية. ويمكن التغلب على هذه المضاعفات من خلال تقييم قلوب عدة ، ومن ثم اختيار الصور مع نتائج متسقة وأفضل التشكل الحفاظ عليها.
بسبب تحسن كثيرا القرار ، ويمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن الهياكل الخلوية والتحت خلوية من قلب الزرد النامية. على سبيل المثال ، لقد طبقنا بالفعل هذا الأسلوب لحساب عدد الخلايا العضلية ، لتقدير حجم cardiomyocyte الفردية ، لتقييم انتشار وموت الخلايا المبرمج ، والكشف عن عملية التجميع 6،12 قسيم عضلي. جنبا إلى جنب مع الأدوات وراثية فريدة من نوعها في الزرد ، فإن الطريقة الحالية تيسير دراسة بيولوجيا القلب والأوعية الدموية في هذا النموذج في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر Beninio Jomok لمساعدته في تربية الزرد. ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL81753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
|||
| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E.
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A.
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
