Summary
एक तेजी से zebrafish भ्रूण दिल की immunostaining आचरण में वर्णित है. पूरे माउंट immunostaining दृष्टिकोण की तुलना में, इस विधि नाटकीय रूप से एंटीबॉडी, जो उच्च संकल्प छवियों है कि दिल में एक बहुत कम प्रसंस्करण समय के भीतर सेलुलर / subcellular संरचनाओं प्रकट प्राप्त करने की अनुमति देता है की पहुंच बढ़ जाती है.
Abstract
Zebrafish भ्रूण हृदय विकास और मानव हृदय अपने फायदेमंद भ्रूणविज्ञान और 1,2 आनुवंशिकी के कारण रोगों का अध्ययन करने के लिए vivo हड्डीवाला मॉडल में लोकप्रिय हो जाता है. 100-200 भ्रूण के बारे में आसानी से उपलब्ध वयस्क मछली की एक जोड़ी से हर हफ्ते हैं. पारदर्शी भ्रूण कि पूर्व utero विकसित उन्हें हृदय दोष 3 आकलन के लिए आदर्श बनाते हैं. किसी भी जीन की अभिव्यक्ति morpholino प्रौद्योगिकी या शाही सेना इंजेक्शन 4 के माध्यम से चालाकी से किया जा सकता है. इसके अलावा, आगे आनुवंशिक स्क्रीन पहले से ही म्यूटेंट की एक सूची है कि 5 कार्डियोजेनेसिस के अलग अलग दृष्टिकोण को प्रभावित उत्पन्न किया है.
पूरे माउंट immunostaining इस पशु मॉडल में एक महत्वपूर्ण तकनीक के लिए एक विशेष ऊतकों को 6 लक्षित प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न पता चलता है . हालांकि, उच्च संकल्प छवियों है कि सेलुलर या subcellular संरचनाओं प्रकट कर सकते हैं मुश्किल हो गया है, मुख्य रूप से शारीरिक locat के कारणदिल और एंटीबॉडी के गरीब पैठ आयन.
यहाँ, हम हृदय विदारक पहली बार और फिर एक खुर्दबीन स्लाइड की सतह पर धुंधला हो जाना प्रक्रिया का आयोजन द्वारा इन बाधाओं को पता करने के लिए करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. छोटे दिल के नमूने की हानि को रोकने के लिए और समाधान से निपटने की सुविधा के लिए, हम एक सर्कल के भीतर माइक्रोस्कोप के सतह स्लाइड एक immEdge कलम द्वारा तैयार पर दिल के नमूने प्रतिबंधित. धुंधला के बाद, प्रतिदीप्ति संकेतों सीधे एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी द्वारा मनाया जा सकता है.
हमारी नई विधि में काफी एंटीबॉडी के लिए प्रवेश में सुधार के बाद से एक भ्रूण मछली से एक दिल केवल कुछ सेल परतों के होते हैं. बरकरार दिल से उच्च गुणवत्ता छवियों zebrafish भ्रूण दिन 2 से 6 दिन के लिए आयु वर्ग के लिए एक बहुत कम बारात समय के भीतर प्राप्त किया जा सकता है. हमारी विधि संभावित अन्य अंगों या तो zebrafish या अन्य छोटे जानवरों से dissected दाग विस्तारित कर सकते हैं.
Protocol
1. स्लाइड्स की तैयारी और humidified कक्ष
- humidified कक्ष एक एक खाली टिप बॉक्स जैसे बॉक्स से बनाया जा सकता है है. दोनों कक्ष और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करने के लिए प्रकाश से नमूनों की रक्षा लपेटें.
- चैम्बर के अंदर, गीला कागज तौलिये के एक ढेर पर डाल करने के लिए कक्ष के भीतर नमी है, जो सूखने से दिल के नमूनों को रोकने जाएगा बनाए रखने. स्लाइड्स के लिए एक रैक के रूप में कागज तौलिया के शीर्ष पर एक छोटे microplate सेट.
- एक खुर्दबीन स्लाइड immEdge कलम का उपयोग करने के लिए 5x5 मिमी के बारे में एक आयाम के साथ दिल के नमूने के लिए कुओं की सतह पर या तो लाइनों या हलकों ड्रा. स्लाइड्स सूखी चलो.
- Humidified कक्ष में स्लाइड्स रखो और 50ul प्रत्येक कुएं में ताजा 4% formaldehyde जोड़ें.
2. भ्रूण दिल के विच्छेदन
- E3 अंडे 7 पानी जब तक मछली रोकने के शरीर आंदोलन के बारे में 1 मिनट के लिए 0.4% tricaine युक्त में मछली भ्रूण anesthetize लेकिन अभी भी सामान्य दिलधड़क रहा है.
- विच्छेदन खुर्दबीन के मंच पर एक अवतल खुर्दबीन स्लाइड रखो. Concaved अच्छी तरह से भ्रूण स्थानांतरण.
- दिल के लिए स्पष्ट रूप से प्रकट विदारक माइक्रोस्कोप के प्रकाश संयोजन को समायोजित करें. निजी पसंद पर निर्भर करता है, यह या तो अंधेरे क्षेत्र या डीआईसी की तरह polarized प्रकाश हालत हो सकता है.
- 75% इथेनॉल के साथ दो इंसुलिन सीरिंज साफ़ है, तो सूखी.
- दिल पर बढ़ाई उच्च और ध्यान केंद्रित करने के लिए विच्छेदन खुर्दबीन समायोजित करें. शारीरिक जर्दी - विखंड सिर के पास सीमा में एक सुई टिप सम्मिलित करके एक भ्रूण को ठीक. दिल क्षेत्र के लिए एक सुई करीब सम्मिलित करें और दिल बाहर खींच जल्दी. यदि दिल पूरी तरह से भ्रूण से अलग नहीं है, बंद दिल और जर्दी के बीच शेष जुड़ा ऊतक में कटौती.
- खुर्दबीन और अलग दिल पर कम बढ़ाई ध्यान केंद्रित करने के लिए समायोजित करें. 10μl pipetteman का प्रयोग करें और यह 1μl मात्रा करने के लिए सेट. Pipetteman की टिप या तो आकर्षित या स्पर्श लागू करेंदिल नमूना है, ताकि पृथक दिल के भीतर या तो या टिप की सतह से जुड़ी हो जाएगा.
- 4% तैयार स्लाइड पर formaldehyde समाधान में पिपेट टिप डुबकी और विंदुक पिस्टन समाधान में दिल जारी दबाना. पानी की सतह के तनाव भी विंदुक टिप से समाधान के लिए दिल रिहाई में मदद करता है. प्रत्येक कुएं में 3 से कम दिल रखो.
3. Immunostaining
- चैम्बर बंद करो और एक प्रकार के बरतन पर यह एक सौम्य कमाल आंदोलन के साथ डाल दिया. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए दिल नमूना फिक्स.
- स्लाइड्स की पीठ पर पानी पोछो और बफर का आदान प्रदान के लिए एक विच्छेदन खुर्दबीन के मंच पर स्लाइड्स डाल दिया.
- प्रत्येक अच्छी तरह से एक खाली क्षेत्र में एक 10μl pipetteman से टिप डुबकी और टिप दिल के नमूनों से यथासंभव रखना. टिप करने के लिए संलग्न दिल से बचने चेताते लो, दिल के बाद से पानी के प्रवाह के साथ कदम है जब समाधान टिप में तैयार की है हो सकता है. परिवर्तनटिप स्थानीयकरण, अगर जरूरत है.
- एक ऊतक पर समाधान फेकें और टिप में किसी भी बुलबुले के उत्पादन से बचने के बाद से दिल नमूना आसानी से हवाई बुलबुले की उपस्थिति में खो दिया है. दिल नमूने आंशिक रूप से सूखी रखते हुए एक कम समय के लिए मदद कर सकते हैं दिल स्लाइड्स के लिए संलग्न रहने के.
- दिल नमूना कवर और 5 मिनट के लिए एक धीमी गति से कमाल आंदोलन में humidified कक्ष में सेते 50μl PBST जोड़ें. दोहराएँ एक बार कुल्ला करें. इस कदम के बाद, दिल के नमूने 4 पर humidified कक्ष 1 सप्ताह डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जा सकता है है
- 10% PBST में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए भेड़ सीरम के साथ दिल नमूना ब्लॉक.
- 1:200 β-catenin एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने और mef2 विशिष्ट एंटीबॉडी के 1:200 कमजोर पड़ने के रूप में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दिल नमूना सेते हैं, 10% भेड़ों में PBST / 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सीरम.
- PBST कमरे के तापमान पर तीन बार (5 मिनट प्रत्येक) के साथ दिल नमूना धो लें.
- माध्यमिक के साथ नमूना सेतेAlexa टैग विरोधी माउस और / या विरोधी खरगोश एंटीबॉडी के 1:1000 कमजोर पड़ने के रूप में 0.5 घंटे के लिए में से PBST, एंटीबॉडी.
- PBST तीन बार के साथ दिल के नमूने कमरे के तापमान पर धो (5 मिनट प्रत्येक.).
4. इमेजिंग
- PBST निकालें और एक अच्छी तरह से 10 μl बढ़ते मध्यम जोड़ने. कई मिनट के लिए चैम्बर रॉक तक समाधान स्पष्ट हो जाता है.
- बढ़ते मध्यम के सबसे निकालें और एक खुर्दबीन कवर ग्लास (24x50) के साथ एक स्लाइड में कुओं की सभी को कवर.
- छवि मछली Zeiss Axioplan 2 माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दिल ApoTome (कार्ल Zeiss) के साथ सुसज्जित है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
एक छवि है जो झिल्ली और सभी zebrafish cardiomyocytes के नाभिक से पता चलता है की एक उदाहरण छवि में दिखाया गया है. 1. mef2c और β-catenin एंटीबॉडी के साथ इस्तेमाल किया गया 52 HPF zebrafish भ्रूण से dissected दिल नमूने दाग. जबकि mef2c एंटीबॉडी cardiomyocytes के नाभिक दाग, बीटा cateninएंटीबॉडी प्रत्येक कोशिका 8-10 की सीमा का पता चलता है. यौगिक सूक्ष्मदर्शी के स्तर का समायोजन करके, दिल के नमूनों की छवियों को एक ही अभिविन्यास, जो बाहरी वक्रता और 11 दिल में भीतर वक्रता के अवलोकन की अनुमति देगा करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. कुल संख्या cardiomyocyte, cardiomyocyte सेल आकार, और घेरा तो मापा जा सकता है.
एक और उदाहरण है जो एक भ्रूण के दिल की sarcomeric संरचना का पता चलता है छवि में दिखाया गया है. 2. हम एक dissected भ्रूण के दिल में F59, एक मायोसिन एंटीबॉडी, उपयोग immunostaining प्रदर्शन किया. एक पूरी भ्रूण के दिल में myofibril नेटवर्क स्पष्ट रूप से कम बढ़ाई पर प्रकट हो सकते हैं, जबकि मोटी फिलामेंट की धारीदार बैंड उच्च (चित्र 2) बढ़ाई 6 पर प्रगट किया जा सकता है.
चित्रा 1 (लाल) mef2 और β-catenin (हरा) के नाभिक और outl दिखाने Immunostaining.एक zebrafish वेंट्रिकल में cardiomyocytes की ines. स्केल पट्टी = 10μm
चित्रा 2 मायोसिन की Immnostaining या तो कम (ए) बढ़ाई या उच्च वृद्धि (बी) पर एक zebrafish वेंट्रिकल में मोटी फिलामेंट दिखाने के लिए.. पैमाने बार = 10μm
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Discussion
क्लासिक पूरे माउंट immunostaining तरीकों की तुलना में, हमारे विधि निम्नलिखित फायदे हैं. सबसे पहले, बहुत मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत लगातार सुधार पैठ के कारण प्राप्त कर सकते हैं. पूरे माउंट immunostaining विधि में, घने त्वचा दिल आसपास के ऊतकों में काफी कई एंटीबॉडी के प्रवेश को कम, उच्च पृष्ठभूमि में पूरे शरीर में जिसके परिणामस्वरूप. यह समस्या विशेष रूप से 3 दिन पोस्ट निषेचन (DPF) से अधिक पुराने भ्रूण के लिए गंभीर है. इसके विपरीत, विच्छेदित दिल केवल कुछ सेल परतों के मिलकर बनता है, बहुत बेहतर पैठ प्रतिपादन. दूसरे, ज्यादा बेहतर प्रवेश की वजह से, immunostaining की पूरी प्रक्रिया सिर्फ 1 दिन से कई घंटे के लिए कम किया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक Actinin Integin से जुड़े kinase (जैसे लोग), और बीटा catenin विशिष्ट एंटीबॉडी के रूप में कुछ एंटीबॉडी के लिए 1 घंटे से 30 मिनट ऊष्मायन समय कम है. तीसरा, उच्च संकल्प छवियों को लगातार बरकरार दिल से प्राप्त किया जा सकता हैसेलुलर / subcellular जानकारी प्रकट. Pericardiac थैली है कि जर्दी के बगल में है अंदर दिल का स्थानीयकरण की वजह से, उच्च बढ़ाई उद्देश्य लेंस छवि बरकरार भ्रूण के लिए नहीं किया जा इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, दिल अगर एक अक्षुण्ण दिल की छवियों की जरूरत है dissected की आवश्यकता होगी. हालांकि, नरमीन-x-100 है कि पूरे माउंट धुंधला प्रक्रिया में पैठ सुधार भ्रूण कमजोर करने के लिए उपयोग किया जाता है जैसे डिटर्जेंट. एक परिणाम के रूप में, दिल को आसानी से विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान टूट रहे हैं. इसके विपरीत, एक जीवित दिल बहुत मजबूत है, जो आसानी से अपने पड़ोसी के ऊतकों से अलग किया जा सकता है है. इसलिए, बरकरार आकारिकी और अधिक आसानी से प्रस्तावित पद्धति का उपयोग करके रखा जाता है. हालांकि एक छोटे से zebrafish हृदय विदारक चुनौतीपूर्ण दिखाई दे सकता है है, ज्यादातर लोगों को कई प्रथाओं के बाद आसानी से इस कार्यविधि का आचरण कर सकते हैं.
हम इस पद्धति का उपयोग किया है के लिए 2 DPF से 6 DPF आयु वर्ग के दिल दाग. इसके भौतिक स्थान, भी अर्ल से दिल की वजह सेier मंचन भ्रूण करने के लिए टुकड़े करना मुश्किल हैं. यह निर्धारित किया कि इस विधि लार्वा या वयस्क दिल के लिए समायोजित किया जा सकता है है रहता है. यह बाहर बिंदु है कि दिल को स्थानीय क्षति विच्छेदन प्रक्रिया है, जो शारीरिक बल शामिल के दौरान परिणाम हो सकता है सार्थक है. इस जटिलता कई दिलों का आकलन, और तब अनुरूप परिणाम और सर्वश्रेष्ठ बनाए रखा आकारिकी के साथ छवियों का चयन करके दूर किया जा सकता है.
बहुत सुधार संकल्प की वजह से, इस विधि के लिए एक विकासशील zebrafish दिल की दोनों सेलुलर और subcellular संरचनाओं प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम पहले से ही इस पद्धति लागू किया है cardiomyocytes की कुल संख्या गिनती करने के लिए व्यक्तिगत cardiomyocyte आकार यों, प्रसार और apoptosis का आकलन, और sarcomere विधानसभा 6,12 की प्रक्रिया प्रकट. एक साथ zebrafish में अद्वितीय आनुवंशिक उपकरणों के साथ, वर्तमान विधि इस में vivo मॉडल में हृदय जीव विज्ञान के अध्ययन की सुविधा होगी .
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम Beninio Jomok zebrafish पालन में उनकी मदद के लिए धन्यवाद. इस काम HL81753 NIH द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
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| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
