Summary
Un moyen rapide pour effectuer immunocoloration des embryons de poisson zèbre coeur est décrite. Comparativement à l'approche immunologique monter ensemble, cette méthode augmente considérablement la pénétration de l'anticorps, ce qui permet d'obtenir des images haute résolution qui révèlent des structures cellulaires / subcellulaires dans le coeur dans un temps de traitement beaucoup plus réduite.
Abstract
L'embryon de poisson zèbre devient un populaire dans le modèle in vivo pour l'étude des vertébrés développement cardiaque et les maladies cardiaques humaines en raison de sa embryologie et la génétique avantageuse 1,2. Environ 100-200 embryons sont disponibles chaque semaine d'un seul couple de poissons adultes. Les embryons transparents qui se développent ex utero les rendent idéales pour évaluer les défauts cardiaques 3. L'expression de tout gène peut être manipulé par l'intermédiaire morpholino la technologie d'injection ou de l'ARN 4. Par ailleurs, avant de cribles génétiques ont déjà généré une liste de mutants qui affectent différentes perspectives de cardiogenèse 5.
Whole immunomarquage de montage est une technique importante dans ce modèle animal de révéler le profil d'expression de la protéine ciblée à un tissu particulier 6. Toutefois, les images à haute résolution qui peut révéler des structures cellulaires ou subcellulaires ont été difficiles, principalement en raison de la locat physiquesion du cœur et la faible pénétration de l'anticorps.
Ici, nous présentons une méthode pour répondre à ces goulots d'étranglement en disséquant le cœur d'abord et ensuite la conduite du processus de taches sur la surface d'une lame de microscope. Pour éviter la perte des échantillons de petit coeur et pour faciliter la manipulation solution, nous avons limité les échantillons coeur dans un cercle à la surface du microscope diapositives tirées par un stylo immEdge. Après la coloration, les signaux de fluorescence peut être directement observé par un microscope composé.
Notre nouvelle méthode améliore significativement la pénétration des anticorps, car un cœur à partir d'un embryon de poisson ne se compose que de quelques couches de cellules. Des images de haute qualité de coeurs intacts peuvent être obtenus dans un délai très réduit pour le défilé des embryons de poisson zèbre âgés de jour 2 au jour 6. Notre méthode peut être potentiellement étendue à d'autres organes disséqués tache soit de poisson zèbre ou autres petits animaux.
Protocol
1. Préparation des lames et la chambre humidifié
- La chambre humide peut être faite d'une boîte comme une boîte de pointe vidé. Enveloppez la fois la chambre et le couvrir de papier aluminium pour protéger les échantillons de la lumière.
- A l'intérieur de la chambre, mettre une pile de serviettes en papier humide pour maintenir l'humidité dans la chambre, ce qui empêchera les échantillons coeur de sécher. Régler une microplaque petits sur le dessus de serviette en papier comme un support pour les diapos.
- Dessinez des lignes ou des cercles, soit sur la surface d'une lame de microscope à l'aide du stylet pour faire immEdge puits pour les échantillons de cœur avec une dimension environ 5x5 mm. Laissez les lames sèches.
- Mettez les diapositives dans la chambre humide et ajouter 50ul de formaldéhyde frais 4% dans chaque puits.
2. La dissection de coeur embryonnaire
- Anesthetize l'embryon de poisson dans l'eau d'œuf E3 7 contenant 0,4% tricaïne pendant environ 1 minute jusqu'à ce que le mouvement du corps du poisson arrêter, mais ont encore cardiaque normalbattre.
- Mettez une lame de microscope concave sur la platine d'un microscope de dissection. Transfert des embryons pour le bien concave.
- Ajustez la combinaison de la lumière du microscope disséquant révéler clairement le cœur. Selon les préférences personnelles, il peut être soit en champ sombre ou DIC-comme condition de la lumière polarisée.
- Nettoyer deux seringues d'insuline avec de l'éthanol 75%, puis séchez.
- Régler le microscope à dissection au plus fort grossissement et de se concentrer sur le cœur. Fixer physiquement un embryon en insérant une aiguille dans la limite de jaune-somite près de la tête. Insérez un autre proche aiguille pour la région du coeur et tirez le cœur rapidement. Si le cœur n'est pas totalement séparé de l'embryon, couper le tissu restant connecté entre le cœur et le jaune.
- Régler le microscope faible grossissement et de se concentrer sur le cœur séparé. Utilisez un pipetteman 10 ul et réglez le volume 1 microlitre. Appliquer la pointe de l'pipetteman à dessiner ou toucher lescoeur de l'échantillon, de sorte que le cœur isolé sera à l'intérieur ou attachés à la surface de la pointe.
- Trempez la pointe de la pipette dans la solution de formaldéhyde à 4% sur les lames préparées et appuyer sur le piston pipette pour libérer le cœur dans la solution. La tension de surface de l'eau aide aussi à libérer le cœur de pointe de la pipette à la solution. Mettez moins de 3 coeurs dans chaque puits.
3. Immunocoloration
- Fermer la chambre et le mettre sur un shaker avec un mouvement doux balancement. Fixer l'échantillon coeur pendant 20 minutes à température ambiante.
- Essuyez l'eau sur le dos de la glisse et de mettre la glisse sur la platine d'un microscope de dissection pour le tampon de l'échange.
- Tremper la pointe d'un pipetteman 10 ul dans une région vide dans chaque puits et de garder la pointe autant que possible à partir d'échantillons du cœur. Prenez garde à éviter le cœur attachés à l'extrémité, car le cœur peut se déplacer avec le débit d'eau lorsque la solution est aspiré dans l'embout. Changerla localisation pointe, si nécessaire.
- Eliminer la solution sur un mouchoir et éviter de produire des bulles dans la pointe du cœur, puisque l'échantillon est facilement perdu dans la présence de bulles d'air. Garder les échantillons coeur sécher partiellement pour une courte durée peut aider les cœurs restent attachés à la glisse.
- Ajouter 50 pl PBST pour couvrir l'échantillon coeur et incuber dans la chambre humide dans un mouvement de bascule lente pendant 5 min. Répéter le rinçage une fois de plus. Après cette étape, les échantillons du cœur peuvent être stockés dans la chambre humidifié jusqu'à 1 semaine à 4 ° C.
- Bloc de l'échantillon coeur avec du sérum de mouton de 10% en PBST pendant 1 heure à température ambiante.
- Incuber l'échantillon coeur avec des anticorps primaires, tels que la dilution de 1:200 β-caténine anticorps et la dilution de 1:200 MEF2 anticorps spécifique, chez les ovins 10% de sérum / PBST pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver l'échantillon avec PBST coeur à trois reprises (5 min. Chacun) à température ambiante.
- Incuber l'échantillon avec du secondaireanticorps, comme dilution de 1:1000 d'Alexa-marqués anti-souris et / ou anticorps anti-lapin, dans le PBST pendant 0,5 heure.
- Laver les échantillons coeur avec PBST trois reprises (5 min. Chacun) à température ambiante.
4. Imagerie
- Retirer PBST et ajouter 10 pl de milieu de montage à chaque puits. Rocher de la chambre pendant quelques minutes jusqu'à ce que la solution devient limpide.
- Retirer la plupart des moyennes de montage et couvrent l'ensemble des puits dans une diapositive avec un couvercle en verre de microscope (24x50).
- Coeur de poissons à l'aide d'images Zeiss Axioplan 2 microscope équipé d'ApoTome (Carl Zeiss).
5. Les résultats représentatifs
Un exemple d'une image qui révèle la membrane et des noyaux de tous les cardiomyocytes poisson zèbre est montré dans la Fig. 1. anticorps mef2c et β-caténine ont été utilisés ensemble pour colorer les échantillons coeur disséqué à partir de 52 embryons de poissons zèbres HPF. Alors que les taches d'anticorps mef2c les noyaux de cardiomyocytes, β-caténined'anticorps révèle la frontière de chaque cellule de 80-10. En ajustant la platine du microscope composé, des images des échantillons cœur peut être ajusté à la même orientation, ce qui permettra l'observation de la courbure extérieure et courbure interne dans le coeur 11. Le nombre total des cardiomyocytes, la taille des cellules cardiomyocytes, et la circularité peut alors être mesuré.
Un autre exemple qui révèle la structure du sarcomère d'un cœur embryonnaire est montré dans la Fig. 2. Nous avons effectué immunomarquage utilisant F59, un anticorps myosine, dans un cœur découpé embryonnaire. Le réseau myofibrille dans un coeur entier embryonnaires peuvent être clairement révélé à faible grossissement, tandis que la bande striée de filaments d'épaisseur peut être révélé à un plus fort grossissement (Fig. 2) 6.
Figure 1. Immunocoloration des MEF2 (rouge) et β-caténine (vert) pour montrer les noyaux et outlines de cardiomyocytes dans un ventricule du poisson zèbre. Barre d'échelle = 10 microns
Figure 2. Immnostaining de la myosine de montrer le filament épais dans un ventricule zebrafish soit à un faible grossissement (A) ou à fort grossissement (B). Barre d'échelle = 10 microns
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Comparé à l'ensemble des méthodes classiques immunomarquage monter, notre méthode présente les avantages suivants. D'abord, beaucoup plus fort des signaux fluorescents peuvent être systématiquement obtenu grâce à une meilleure pénétration. Dans la méthode immunologique monter ensemble, les tissus de la peau épaisse qui entoure le cœur significativement réduit la pénétration de nombreux anticorps, résultant en bruit de fond élevé dans le corps entier. Ce problème est particulièrement grave pour les embryons âgés de plus de 3 jours après la fécondation (DPF). En revanche, les cœurs disséqués ne se composent d'un petit nombre de couches de cellules, rendant la pénétration beaucoup mieux. Deuxièmement, en raison de la pénétration est beaucoup améliorée, l'ensemble du processus immunologique peut être réduite de 1 jour à plusieurs heures juste. Nous avons réussi à réduire le temps d'incubation de 1 heure à 30 minutes pour certains anticorps tels que Actinin, Integin kinase liée (ILK), et β-caténine anticorps spécifiques. Troisièmement, des images haute résolution peuvent être systématiquement obtenu à partir de coeurs intactsde révéler des informations cellulaires / subcellulaires. En raison de la localisation du cœur à l'intérieur du sac péricardique qui est à côté du jaune, plus un grossissement des lentilles d'objectif ne peut être utilisé pour les embryons d'image intacte. Par conséquent, le cœur devra être disséquée si les images d'un cœur intact sont nécessaires. Toutefois, les détergents tels que Triton-X-100 qui sont utilisés pour améliorer la pénétration dans la procédure de coloration monter toute affaiblir les embryons. En conséquence, les cœurs se brisent facilement lors de la procédure de dissection. En revanche, un cœur vivant est beaucoup plus forte, qui peut être facilement séparé de ses tissus voisins. Par conséquent, la morphologie intacte sont plus facilement maintenus en utilisant la méthode proposée. Bien que la dissection d'un coeur de poisson zèbre petites pourrait sembler difficile, la plupart des gens peuvent facilement effectuer cette procédure après plusieurs pratiques.
Nous avons utilisé cette méthode pour colorer les cœurs âgés de 2 à 6 dpf DPF. En raison de son emplacement physique, le cœur du comte, mêmeIER scène embryons sont difficiles à disséquer. Il reste à déterminer si cette méthode peut être ajusté pour larve ou adulte coeurs. Il est intéressant de souligner que des dommages locaux au cœur pourrait entraîner au cours du processus de dissection, ce qui implique la force physique. Cette complication peut être surmontée en évaluant plusieurs cœurs, et puis en sélectionnant des images avec des résultats cohérents et de la meilleure morphologie maintenue.
En raison de la résolution nettement améliorée, cette méthode peut être utilisée pour révéler des structures à la fois cellulaire et subcellulaire d'un coeur de poisson zèbre en développement. Par exemple, nous avons déjà appliqué cette méthode pour compter le nombre total de cardiomyocytes, de quantifier la taille des cardiomyocytes individuels afin d'évaluer la prolifération et l'apoptose, et de révéler le processus de sarcomère Assemblée 6,12. Avec les outils génétiques uniques chez le poisson zèbre, la présente méthode facilitera l'étude de la biologie cardiovasculaire dans ce modèle in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous remercions Beninio Jomok pour son aide dans le poisson-zèbre élevage. Ce travail est financé par le NIH HL81753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
|||
| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
