Summary
En rask måte å utføre farging av sebrafisk embryonale hjertet er beskrevet. Sammenlignet med hele montere farging tilnærming, øker denne metoden dramatisk penetrasjon av antistoffer, som gjør skaffe høyoppløselige bilder som avslører mobil / subcellular strukturer i hjertet innenfor en mye redusert saksbehandlingstid.
Abstract
Sebrafisk embryo blir et populært in vivo virveldyr modell for å studere hjerte utvikling og menneskets hjerte sykdommer på grunn av sin fordelaktige embryologi og genetikk 1,2. Om 100-200 embryo er lett tilgjengelig hver uke fra et enkelt par av voksen fisk. Det transparente fostre som utvikler ex utero gjør dem ideelle for å vurdere kardiale defekter 3. Uttrykket av genet kan manipuleres via morpholino teknologi eller RNA injeksjon fire. Videre framover genetiske skjermer har allerede generert en liste med mutanter som påvirker ulike perspektiver av cardiogenesis 5.
Hele montere farging er en viktig teknikk i denne dyremodell å avsløre uttrykk mønster av målrettet protein til et bestemt vev 6. Imidlertid har høy oppløsning som kan avsløre mobilnettet eller subcellular strukturer vært vanskelig, hovedsakelig på grunn av fysiske location av hjertet og de fattige gjennomtrengning av antistoffer.
Her presenterer vi en metode for å løse disse flaskehalsene ved å dissekere hjerte først og deretter gjennomføre misfarging prosessen på overflaten av et objektglass. For å hindre tap av lite hjerte prøver og legge til rette løsningen håndtering, vi begrenset hjertet prøvene innenfor en sirkel på overflaten av objektglass trukket av en immEdge penn. Etter flekker, kan fluorescens signalene direkte observert av et sammensatt mikroskop.
Vår nye metode forbedrer penetrasjon for antistoffer, ettersom et hjerte fra en embryonisk fisk bare består av få celler lag. Bilder av høy kvalitet fra intakt hjerter kan skaffes innen en mye redusert prosesjon tid for sebrafisk embryo i alderen fra dag 2 til dag 6. Vår metode kan være potensielt utvides til stain andre organer dissekert fra enten sebrafisk eller andre små dyr.
Protocol
1. Utarbeidelse av lysbilder og fuktet kammer
- Den fuktet kammer kan gjøres fra en boks som en tømt tips boks. Pakk både kammer og dekk med aluminiumsfolie for å beskytte prøvene mot lys.
- Inne i kammeret, satt en haug med vått tørkepapir til å opprettholde fuktigheten i kammeret, noe som vil hindre hjertet prøvene fra tørking. Sett en liten mikroplate på toppen av papir håndkle som et rack for lysbildene.
- Tegn enten linjer eller sirkler på overflaten av et objektglass med immEdge penn for å gjøre brønner for hjerte prøver med en dimensjon ca 5x5 mm. La lysbilder tørke.
- Sett lysbilder i fuktet kammer og tilsett 50ul frisk 4% formaldehyd i hver brønn.
2. Disseksjon av embryonale hjerte
- Anesthetize fisken embryo i E3 egg vann 7 inneholder 0,4% Tricaine i ca 1 minutt før fisken stopper kroppsbevegelse, men fortsatt har normalt hjertejuling.
- Sett en konkav objektglass på scenen av en disseksjon mikroskop. Overfør embryoene til concaved godt.
- Juster lyset kombinasjon av dissecting mikroskop for å tydelig avsløre hjertet. Avhengig av personlige preferanser, kan det være enten mørkt felt eller DIC-aktig polarisert lys tilstand.
- Clean to insulin sprøyter med 75% etanol, deretter tørr.
- Juster disseksjon mikroskop til høyere forstørrelse og fokus på hjertet. Fysisk fikse et embryo ved å sette inn en nålespissen inn eggeplomme-somite grense tett inntil hodet. Sett inn en annen nål nær hjertet regionen og dra hjertet ut raskt. Hvis hjertet ikke er helt adskilt fra embryo, kuttet av de resterende koblet vevet mellom hjertet og eggeplomme.
- Juster mikroskop til lavere forstørrelse og fokusere på den separerte hjertet. Bruk en 10μl pipetteman og sett den til 1μl volum. Bruk tuppen av pipetteman å enten tegne eller berørhjerte prøve, slik at den isolerte hjertet vil være enten innenfor eller festet til overflaten av spissen.
- Dypp pipettespissen på 4% formaldehyd løsning på forberedt lysbilder og trykke pipetten stempel å frigjøre hjertet i løsningen. Spenningen av vann overflate bidrar også til å frigjøre hjertet fra pipettespissen til løsningen. Sett mindre enn 3 hjerter i hver brønn.
3. Farging
- Lukk kammeret og satte den på en shaker med en myk, vuggende bevegelse. Fix hjertet utvalget for 20 minutter ved romtemperatur.
- Tørk av vannet på baksiden av lysbilder og sette lysbilder på scenen av en disseksjon mikroskop for buffer utveksling.
- Dyppe fra en 10μl pipetteman inn i et tomt område i hver brønn og beholde spissen så langt som mulig fra hjertet prøver. Ta forholdsregler for å unngå hjerte knyttet til tuppen, fordi hjerter kan bevege seg med vannstrømmen når løsningen er trukket inn i tuppen. Endretuppen lokalisering, om nødvendig.
- Kast løsningen på en vev og unngå å produsere noen bobler i spissen siden hjertet prøven er lett tapt i nærvær av luft bobler. Holde hjertet prøvene delvis tørr for en kort tid kan hjelpe hjerter opphold festet til lysbildene.
- Legg 50μl PBST å dekke hjertet prøven og inkuber i fuktet kammer i en langsom rocking bevegelse i 5 min. Gjenta skyll en gang til. Etter dette trinnet, kan hjertet prøvene skal lagres i fuktet kammeret inntil 1 uke ved 4 ° C.
- Block hjertet prøven med 10% sauer serum i PBST i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber hjertet prøven med primære antistoffer, som 1:200 fortynning av β-catenin antistoff og 1:200 fortynning av mef2 spesifikt antistoff i 10% sau serum / PBST i 1 time ved romtemperatur.
- Vask hjertet prøven med PBST tre ganger (5 min. Hver) ved romtemperatur.
- Inkuber prøven med sekundæreantistoffer, som 1:1000 fortynning av Alexa-merkede anti-mus og / eller anti-kanin antistoffer, i PBST i 0,5 time.
- Vask hjertet prøver med PBST tre ganger (5 min. Hver) ved romtemperatur.
Fire. Imaging
- Fjern PBST og tilsett 10 mL montering medium til hver brønn. Rock kammeret i flere minutter før løsningen blir klar.
- Fjern det meste av montering medium og dekker alle brønnene i ett lysbilde med et mikroskop cover glass (24x50).
- Bilde fisk hjerte bruke Zeiss Axioplan 2 mikroskop utstyrt med ApoTome (Carl Zeiss).
5. Representant Resultater
Et eksempel på et bilde som avslører membran og kjerner av alle sebrafisk cardiomyocytes er vist i fig. 1. mef2c og β-catenin antistoffer ble brukt sammen for å stain hjertet prøver dissekert fra 52 HPF sebrafisk embryo. Mens mef2c antistoff flekker kjernen av cardiomyocytes, β-cateninantistoff avslører grensen av hver celle 8-10. Ved å justere fasen av det sammensatte mikroskop, kan bilder av hjertet prøvene justeres til samme orientering, som vil tillate observasjon av ytre kurvatur og indre krumning i hjertet 11. Det totale cardiomyocyte antall, cardiomyocyte celle størrelse, og sirkularitet kan deretter måles.
Et annet eksempel som avslører sarcomeric strukturen i en embryonale hjerte er vist i fig. 2. Vi utførte farging bruke F59, en myosin antistoff, i en dissekert embryonale hjerte. Den myofibril nettverk i en hel embryonale hjerte kan tydelig avslørt ved lavere forstørrelse, mens striated band av tykk filament kan avsløres ved høyere forstørrelse (Fig 2) 6.
Figur 1. Farging av mef2 (rød) og β-catenin (grønn) for å vise kjerner og outlInes av cardiomyocytes i en sebrafisk ventrikkel. Scale bar = 10μm
Figur 2. Immnostaining av myosin å vise tykk filament i en sebrafisk ventrikkel på enten lav forstørrelse (A) eller høy forstørrelse (B). Skala bar = 10μm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med klassiske hele montere farging metoder, har vår metode følgende fordeler. Først kan mye sterkere fluorescerende signalene være konsekvent oppnådd takket være forbedret penetrasjon. I hele montere farging metoden, den tette huden vev rundt hjertet betydelig redusert inntrengning av mange antistoffer, som resulterer i høy bakgrunn i hele kroppen. Dette problemet er spesielt alvorlig for fostre eldre enn 3-dagers post-fertilisering (DPF). I kontrast, det dissekert hjerter bare bestå av noen få cellelag, rendering mye bedre penetrasjon. Dernest på grunn av den mye bedre penetrasjon, kan hele prosessen med farging reduseres fra 1 dag til bare flere timer. Vi har nå redusert inkubasjonstiden fra 1 time til 30 minutter for noen antistoffer som Actinin, Integin-koblede kinase (ilk), og β-catenin spesifikke antistoffer. Tredje, høyoppløselige bilder kan være konsekvent hentet fra intakt hjerterå avsløre mobil / subcellular informasjon. På grunn av lokalisering av hjertet inne i pericardiac sac som ligger ved siden av eggeplomme, kan høyere forstørrelse objektiv ikke brukes til bilde intakt embryoer. Derfor vil hjertet må dissekert hvis bilder av en intakt hjerte er nødvendig. Men, vaskemidler som Triton-x-100 som brukes til å forbedre penetrasjon i hele montere flekker prosedyre svekke embryoer. Som en konsekvens, blir hjertene lett brutt under disseksjon prosedyren. I kontrast er et levende hjerte mye sterkere, som lett kan skilles fra sine naboland vev. Derfor er intakte morfologi lettere opprettholdes med den foreslåtte metoden. Selv dissecting en liten sebrafisk hjerte kan virke utfordrende, de fleste kan lett gjennomføre denne prosedyren etter flere praksis.
Vi har benyttet denne metoden å farge hjerter i alderen fra 2 DPF til 6 DPF. På grunn av sin fysiske plassering, hjerter fra selv EarlIer iscenesatte embryo er vanskelig å dissekere. Det gjenstår å fastslå om denne metoden kan justeres for larve eller voksen hjerter. Det er verdt å påpeke at lokale skader på hjertet kan resultere i løpet av disseksjon prosessen, som innebærer fysisk makt. Denne komplikasjonen kan overvinnes ved å vurdere flere hjerter, og deretter velge bilder med konsistente resultater og best vedlikeholdt morfologi.
På grunn av mye bedre oppløsning, kan denne metoden brukes til å avsløre både cellulære og subcellular strukturer i et utviklingsland sebrafisk hjerte. For eksempel har vi allerede brukt denne metoden for å telle antall cardiomyocytes, å kvantifisere individuelle cardiomyocyte størrelse, for å vurdere spredning og apoptose, og å avsløre prosessen med sarcomere montering 6,12. Sammen med unik genetisk verktøy i sebrafisk, vil presentere metoden rette studiet av kardiovaskulære biologi i denne in vivo modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Beninio Jomok for hans hjelp i sebrafisk underhaldande. Dette arbeidet er finansiert av NIH HL81753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
|||
| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E.
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A.
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
