Eine effiziente Methode, um Einblicke in die Visualisierung der parakrine-derived ROS-Induktion von endothelialen Ca2 + Signal-Verstärkung wird beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der Messung parakrine abgeleitete ROS ausgelöst Ca2 +-Mobilisierung in vaskulären Endothelzellen in einer Co-Kultur-Modell.
Oxidativer Stress ist in einer Reihe von pathologischen Bedingungen, einschließlich Ischämie / Reperfusionsschaden und Sepsis in Verbindung gebracht. Das Konzept von oxidativem Stress bezieht sich auf die abweichende Bildung von ROS (reaktive Sauerstoffspezies), die O 2 • gehören -, H 2 O 2 und Hydroxylradikale. Reaktive Sauerstoffspezies beeinflusst eine Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Signaltransduktion, Zellproliferation und Zelltod 1-6. ROS haben das Potenzial, Gefäß-und Organ-Zellen direkt schädigen, und kann sekundäre chemische Reaktionen und genetischen Veränderungen, die letztlich zu einer Verstärkung der ersten ROS-vermittelte Gewebeschäden führen zu initiieren. Ein wichtiger Bestandteil der Verstärkung Kaskade, die irreversible Gewebeschäden verschärft wird die Rekrutierung und Aktivierung von zirkulierenden Entzündungszellen. Während einer Entzündung, entzündliche Zellen Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) und Interleukin-1, dieaktivieren Endothelzellen (EC) und Epithelzellen und weiteren ergänzen die entzündliche Antwort 7. Vaskuläre endotheliale Dysfunktion ist ein fester Bestandteil der akuten Entzündung. Makrophagen dazu beitragen, die endotheliale Dysfunktion bei Entzündungen, die durch Mechanismen, die unklar bleiben. Die Aktivierung von Makrophagen Ergebnisse in der extrazellulären Freisetzung von O 2 • – und verschiedene pro-inflammatorische Zytokine, die pathologischen Signalisierung in benachbarten Zellen 8 auslöst. NADPH-Oxidasen sind die wichtigsten und primären Quelle von ROS in den meisten Zelltypen. In jüngster Zeit ist es von uns und anderen gezeigt, dass 9,10 ROS durch NADPH-Oxidasen produziert der mitochondrialen ROS-Produktion bei vielen pathophysiologischen Bedingungen zu induzieren. Daher Messung der mitochondrialen ROS-Produktion ebenso wichtig ist neben der Messung cytosolische ROS. Makrophagen produzieren ROS durch die Flavoprotein Enzym NADPH-Oxidase, die eine primäre Rolle bei Entzündungen spielt. Einmal aktiviert,phagocytic NADPH-Oxidase produziert reichlich O 2 • -, die wichtig sind in der Abwehrmechanismus des Wirts 11,12. Obwohl parakrine-derived O 2 • – spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Gefäßerkrankungen, Visualisierung von parakrine ROS-induzierte intrazelluläre Signalwege wie Ca 2 +-Mobilisierung ist noch Hypothese. Um ein Signal zu benachbarten Endothelzellen transduzieren – Wir haben ein Modell, in dem aktivierten Makrophagen als Quelle von O 2 • verwendet werden entwickelt. Mit diesem Modell zeigen wir, dass Makrophagen-derived O 2 • – auf Calcium-Signalgebung in angrenzenden Endothelzellen führen.
Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine schnelle und quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies in lebenden Zellen entweder durch Oxidation Farbstoffe oder Plasmid-Sensoren. Agonisten der TLRs (Toll-like-Rezeptoren) sind Verbindungen, die Zellen durch die TLRs präsentieren auf der Zelloberfläche zu stimulieren und lösen die nachgeschalteten Signalwege 15. In unserem Protokoll haben wir drei verschiedene TLR-Agonisten nämlich, Lipo-Teichonsäure-TLR2-Agonist, Poly (I: C). TLR3-Agonist, LPS…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grant (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) zu MM unterstützt. Unser Artikel ist teilweise von Carl Zeiss MicroImaging GmbH unterstützt.
Reagent | Company | Catalogue number |
Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
G418 | Invitrogen | 10131-027 |
Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
T-25 Flasks | Corning | 430639 |
T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |