Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

ויזואליזציה של כלי דם Ca 2 + איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני

doi: 10.3791/3511 Published: December 21, 2011

Summary

שיטה יעילה כדי להשיג תובנות לדמיין את האינדוקציה אוטוקריני הנגזרות ROS של האנדותל Ca2 + איתות מתואר. שיטה זו מנצלת את מדידת ROS נגזר אוטוקריני מופעלות Ca2 + לגיוס בתאי האנדותל בכלי הדם במודל שיתוף תרבות.

Abstract

סטרס חמצוני היה מעורב במספר מצבים פתולוגיים כולל נזק איסכמיה / reperfusion ועל אלח דם. הרעיון של סטרס חמצוני מתייחס היווצרות חריגה של ROS (מינים חמצן תגובתי), אשר כוללים O 2 -, H 2 O 2, רדיקלים הידרוקסיל. מינים החמצן מגיב משפיע שפע של תהליכים תאיים כולל התמרה האות, התפשטות תאים ומוות התא 1-6. ROS יש פוטנציאל נזק בכלי הדם ותאי איבר ישירות, והוא יכול ליזום תגובות כימיות משני שינויים גנטיים כי בסופו של דבר לגרום הגברה של הנזק ROS בתיווך הראשוני רקמות. רכיב מרכזי של מפל הגברה המחזקת נזק בלתי הפיך לרקמות הוא גיוס והפעלה של מחזורי תאים דלקתיים. במהלך דלקת, תאים דלקתיים לייצר ציטוקינים כגון נמק הגידול גורם-α (TNFα) ו-IL-1 כילהפעיל בתאי האנדותל (EC) ותאי אפיתל נוספת להגדיל את 7 התגובה הדלקתית. תפקוד אנדותל כלי דם הוא תכונה הוקמה דלקת חריפה. המקרופאגים לתרום תפקוד אנדותל במהלך דלקת על ידי המנגנונים אינם ברורים. הפעלה של תוצאות מקרופאגים לשחרור תאיים של O 2 • - שונות הפרו ציטוקינים דלקתיים, אשר מפעילה איתות פתולוגיים בתאים סמוכים 8. Oxidases NADPH הם המקור העיקרי והראשון במעלה של ROS ברוב סוגי התאים. לאחרונה, היא מופיעה על ידינו ואחרים 9,10 כי ROS המיוצר על ידי oxidases NADPH לעורר את הייצור המיטוכונדריאלי ROS במהלך תנאי pathophysiological רבים. מכאן מדידת הייצור המיטוכונדריאלי ROS חשוב לא פחות בנוסף למדידת cytosolic ROS. המקרופאגים מייצרים ROS על ידי האנזים מונואמין NADPH flavoprotein אשר ממלא תפקיד העיקרי לדלקת. הופעל פעם אחת,NADPH אוקסידאז phagocytic מייצרת כמויות עצומות של O 2 • - חשובים במנגנון ההגנה המארחת 11,12. למרות אוטוקריני הנגזרות O 2 • - ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות כלי הדם, ויזואליזציה של ROS-Induced אוטוקריני איתות תאיים, כולל גיוס Ca 2 + עדיין השערה. פיתחנו מודל שבו מקרופאגים מופעל משמשים כמקור של O 2 • - כדי transduce איתות לתאי אנדותל סמוכים. באמצעות מודל זה אנו מראים כי macrophage הנגזרות O 2 • - להוביל סידן איתות לתאי אנדותל סמוכים.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מינים חמצן תגובתי יכול להימדד בתאים חיים באמצעות צבעים חמצון רגיש (1 & 2) או באמצעות חיישני פלסמיד (3 & 4) על ידי מיקרוסקופיה confocal.

1. ויזואליזציה של cytosolic ROS ב J774 תאים

  1. לגדול J774.1 מונוציטים הנגזרות עכבר מקרופאגים (10 6 תאים / מ"ל) בתחתית כוס 35 מ"מ צלחות (Apparatus הרווארד) עבור 48 ח
  2. אתגר תאים עם אגוניסטים TLR (2 מיקרוגרם / מ"ל, שאיבה, teichoic חומצה TLR2 אגוניסט; 10μg/ml, פולי (אני: C)-TLR3 אגוניסט: 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​LPS-TLR4 אגוניסט) למשך 6 שעות על 37 ° C.
    הערה: המקרופאגים מטופלים בתנאים דומים שימשו שיתוף תרבות מודל Ca 2 + גיוס.
  3. מוסיפים את חמצון רגיש צבע H 2 DCF-DA (Invitrogen) לתת הריכוז הסופי של 10 מיקרומטר ECM (בינוני תאיים: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 10 mM Na-HEPES, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH 2 PO 4, 1.2 mM MgSO 4, 2 מ"מ CaCl 2, 10mM גלוקוז 2.0% dextran, pH 7.4, כל המתקבלים Sigma) המכיל BSA 2% ל מנות ותאים דגירה של 20 דקות לפני להדמיה תחת מיקרוסקופ confocal.
  4. לאחר טעינת צבע, לדמיין תאים להציב על הבמה טמפרטורה מבוקרת של מערכת ההדמיה המתאימה. אנו משתמשים Carl Zeiss LSM 510 הדמיה confocal Meta המערכת יחד עם ארגון מקור לייזר יון על עירור של 488 ננומטר עבור DCF הקרינה באמצעות אובייקטיבי שמן 40X 13 (איור 1A ו-D).
  5. ניתוח תמונות באמצעות ImageJ תוכנה (1.44), תוכנה להורדה חופשית מ-National Institutes of Health (Rasband, היה, ImageJ, ארה"ב National Institutes of Health, Bethesda, מרילנד, ארה"ב, http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. ויזואליזציה של תאים mROS ב J774

  1. לגדול J774.1 מונוציטים הנגזרות עכבר מקרופאגים (10 6 תאים / מ"ל) בתחתית כוס 35 מ"מ צלחות (Apparatus הרווארד) עבור 48 ח
  2. האתגר התאים עם ligands TLR לגרום הייצור mROS (2 מיקרוגרם / מ"ל, שאיבה, teichoic חומצה TLR2; 10μg/ml, פולי (אני: C)-TLR3: 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​LPS-TLR4) במשך 6 שעות ב 37 מעלות ג
  3. הוסף המיטוכונדריה אינדיקטור superoxide MitoSOX האדום (Invitrogen) לתת הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר ECM BSA המכיל 2% ל מנות ותאים דגירה למשך 30 דקות ב 37 מעלות על מנת לאפשר טעינה של MitoSOX האדום.
  4. לאחר טעינת צבע, לדמיין תאים על במה טמפרטורה מבוקרת של קרל צייס LSM 510 לזוג Meta מערכת הדמיה confocal עם מקור ארגון לייזר יון על עירור של 561 ננומטר במשך MitoSOX האדום הקרינה באמצעות אובייקטיבי שמן 40X (איור 1B ו-E).
  5. על הניסויים שליטה, לאחר טעינת צבע להוסיף PBS או DMSO (בקרה שלילית) או Antimycin 2μM (כמו המיטוכונדריה superoxide גנרטור חיובי שליטה) לתאי לפני התמונה מדגם כמתואר 2.4 (איור 1C).
  6. לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ (1.44).

3. Visualizatiעל cytosolic של ROS ב MPMVECs יציב Hyper-Cyto

  1. אנו משתמשים pHyPer-Cyto (Evrogen) קידוד יונקים וקטור ביטוי Hyper חיישן פלורסנט שמתאימה בציטופלסמה ובמיוחד החושים ריכוז submicromolar של H 2 O 2 14.
  2. Transfect תאים Murine ריאתי אנדותל כלי הדם (MPMVECs) עם וקטור pHyPer-Cyto שימוש או electroporation או ריאגנטים transfection. אנו משתמשים בגודל 10 x 10 6 תאים transfect עם 10μg של pHyPer-Cyto דרך electroporation באמצעות BioRad ג'ין pulser מערכת electroporator (250V; μF 500). MPMVECs תרבות בינוני DMEM בתוספת 10% FBS, חומצות אמינו חיוניות, תוספת צמיחה האנדותל אנטיביוטיקה.
    הערה: בעקבות transfection, תאים צלחת בצפיפות נמוכה כדי להקל על גידול המושבה.
  3. החלף בינוני עם בינוני תרבות שלמה בתוספת 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​G418, 48 שעות לאחר transfection. מסך עבור שיבוטים כי יש האחוז הגבוה ביותר של H yPer תאים חיוביים Hyper מעבר שיבוטים חיובית להגדיל את מספר התאים חיובי Hyper (איור 2).
    הערה: אנו משתמשים דילול סדרתי של תאים משובטים לבחירה של תאים בודדים מסך עבור תאים מאוד יציבה מביע Hyper.
  4. לגדול יציב Hyper-Cyto MPMVECs על 0.2% coverslips מצופה ג'לטין (80 מפגש%). האתגר הבא יום תאים עם ligands TLR (2 מיקרוגרם / מ"ל, חומצה TLR2 Lipoteichoic; 10μg/ml, פולי (אני: C)-TLR3: 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​LPS-TLR4) במשך 6 שעות ב 37 ° C. בתאים שלא טופלו לשמש מלאה.
  5. לאחר הטיפול, הר coverslips על Attofluor תא תא (Invitrogen). הוסף 1ml של טרום חימם פתרון הנקס מלח מאוזנת (HBSS) לתא והמקום קאמרית על הבמה טמפרטורה מבוקרת של Carl Zeiss LSM מערכת 510 Meta הדמיה confocal. המחש הקרינה התמונה להשתנות בכל עירור של 488 ננומטר באמצעות אובייקטיבי שמן 40X (איור 3A ו-D).
  6. ניתוח תמונות באמצעות ImageJ תוכנה (1.44) (ראה סעיף 6).
itle "> 4. ויזואליזציה של המיטוכונדריה ROS ב MPMVECs יציב Hyper-dMito

  1. אנו משתמשים pHyPer-dMito (Evrogen) ביטוי יונקים וקטור קידוד המיטוכונדריה במיקוד Hyper שמתאימה בריכוז החושים המיטוכונדריה ובמיוחד submicromolar של H 2 O 2.
  2. MPMVECs Transfect עם pHyPer-dMito וליצור יציבה Hyper-dMito MPMVECs הבאים השלבים המתוארים בסעיף 3.2-3.3.
  3. לגדול יציב Hyper-dMito MPMVECs על 0.2% coverslips מצופה ג'לטין (80 מפגש%).
  4. האתגר הבא יום תאים עם ligands TLR (2 מיקרוגרם / מ"ל, חומצה TLR2 Lipoteichoic; 10μg/ml, פולי (אני: C)-TLR3: 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​LPS-TLR4) במשך 6 שעות ב 37 ° C. בתאים שלא טופלו לשמש בקרה שלילית. הוסף Antimycin 2μM המדגם (הבקרה המיטוכונדרי inducer חיובי superoxide) לפני חזותי.
  5. לאחר הטיפול, הר coverslips על Attofluor תא תא (Invitrogen). הוסף 1ml של תמיסת הנקס מראש חימם מלח מאוזנת (HBSS) לתאוהמקום קאמרית על הבמה טמפרטורה מבוקרת של Carl Zeiss מערכת LSM 510 confocal הדמיה מטה. המחש לשנות את התדמית הקרינה על עירור של 488 ננומטר באמצעות אובייקטיבי שמן 40X (איור 3B, C ו-E).
  6. ניתוח תמונות באמצעות ImageJ תוכנה (1.44) (ראה סעיף 6).

5. Co-תרבות מודל הדמיה של אוטוקריני הנגזרות ROS מופעלות Ca 2 + איתות לתאי אנדותל

להדמיה ומדידה של [Ca 2 +] i שינויים אנו משתמשים Ca 2 + צבע פלואורסצנטי רגיש fluo, 04:00 (Invitrogen).

  1. לגדול MPMVECs על 0.2% coverslips מצופה זכוכית 25mm ג'לטין (80 מפגש%).
  2. דגירה התאים גדל על coverslips בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ב ECM BSA המכיל 2% חומצה pluronic 0.003% עם 5 מיקרומטר fluo, 04:00 (Invitrogen) הריכוז הסופי כדי לאפשר טעינה של fluo, 04:00. לאחר הטעינה, לשטוף תאים עם פתרון הדמיה ניסיוני (ECM המכיל 0.25% BSA) המכיל sulfinpyrazone כדי להקטין את איבוד הצבע.
  3. לאחר טעינת fluo-4, הר coverslips על Attofluor תא תא (Invitrogen). הוסף 800μl מראש חימם פתרון הדמיה ניסיוני לתא והנח אותו על הבמה טמפרטורה מבוקרת של Carl Zeiss מערכת LSM 510 confocal הדמיה מטה.
  4. בתווית צינור להפריד את מקרופאגים nonactivated או מופעל מבודד או wild-type או gp91 phox-/ - עכברים (LPS שטופלו במשך 6 שעות) עם תא גשש אדום CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) ב ECM BSA המכיל 2% ו pluronic 0.003% חומצה. לשטוף ו resuspend תאים עם 200μl של פתרון הדמיה ניסיוני.
  5. הוסף מקרופאגים שכותרתו על fluo, 04:00 טעון MPMVECs באסיפה קאמרית.
  6. הקלט את פלואורסצנטי ירוק ואדום כל -3 דקות 10-20 באמצעות Carl Zeiss LSM510 Meta מערכת הדמיה confocal עם מקור ארגון לייזר יון עם עירור ב 488 ו 561 nm עבור fluo, 04:00 ותא גשש אדום פלואורסצנטי respectively (Fig.4 AC).
    הערה: לחילופין, J774.1 קו התא יכול לשמש כדי לעורר MPMVECs Ca 2 + גיוס.
  7. ניתוח fluo-4 שינויים בעוצמת הקרינה באמצעות ImageJ תוכנה (1.44) (ראה סעיף 6).

6. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה ImageJ

העברת התמונות המתקבלות במערכת confocal כקובץ. LSM פורמט לניתוח נתונים. ZEN ZEN 2009 ו 2010 בתוכנה המסופקת עם מיקרוסקופ 510 Meta LSM LSM confocal או 710 מיקרוסקופ multiphoton confocal בהתאמה שומר קבצים בפורמט. LSM. אנו ממליצים להשתמש זה הילידים. LSM לניתוח קבצי תמונה כמו באיכות המקורית נשמרת. פורמט קובץ זה ניתן לפתוח ישירות ניתוח התמונה תמונה ג'תוכנית השלבים הבאים לספק דוגמה ניתוח כמותי של תמונה בודדת. תוספים נוספים לא נדרשות לניתוח נתונים זה.

  1. LSM פתח. או. TIFF הקובץ בתוכנית J תמונה באמצעות קובץ> פתח
  2. לחץ על התמונה הכרטיסייה> COלורביר> ערוצים לפצל לפצל את ערוצי ירוק DIC. השתמש תמונה מערוץ ירוק לניתוח שלאחר מכן.
  3. לחץ לחיצה כפולה ובחר את "מברשת אליפטית בחירה" הכרטיסייה ולהגדיר את הערך פיקסל 20.
  4. עבור Hyper-Cyto תמונות, לחץ על תא אחד כדי להגדיר את האזור מעגלי המדידה. לאחר מכן לחצו על "M" מפתח כדי למדוד את העוצמה של האזור הנבחר. הערכים נשמרים בחלון התוצאות החדשות.
  5. הבא על ידי החזקת "Shift" לחץ על מקש תא אחר כדי לבחור אזור אחר, ולאחר מכן על ידי לחיצה על "M" המפתח. עוצמת נרשם חלון התוצאה. חזור על השלבים 4-5 על 50 תאים שונים.
  6. לקבלת תמונות Hyper d-מיטו, להגדיר את הערך פיקסל עד 10 בבחירת מברשת אליפטית. אזור של עניין (ROI) יש לעקוב באופן ידני כולל במיטוכונדריה של תאים מסוימים.
  7. שימוש חופשי, לאתר את האזור סביב המיטוכונדריה ולאחר מכן הקש "M". חזור על השלבים 6-7 על 50 תאים שונים.
  8. העתק את לי ערכים מחלון התוצאות ולהדביק בגיליון Excel או כל תוכנה לעלילה את התוצאות. אנו משתמשים גם SigmaPlot או PRISM Graphpad להתוות את הנתונים בתרשים.

7. נציג תוצאות

איור 1 מציג cytosolic ואת המיטוכונדריה ייצור ROS על האתגר עם ligands TLR. תמונות confocal נציג להראות גידול של DCF (cytosolic) ו MitoSOX האדום (מיטוכונדריה) פלואורסצנציה לאחר 6 שעות של גירוי. שינויים הקרינה היו מנורמל והביע כשינוי לקפל.

תרשים 2 מציג את הדור של יציבה Hyper-Cyto ו Hyper-dMito לתאי אנדותל. עכבר לתאי אנדותל היו transfected עם pHyPer-Cyto או pHyPer-dMito בונה פלסמיד דרך electroporation. תאים פלסמידים ביציבות לבטא נבחרו G418 במשך שבועיים. לאחר הבחירה, התאים היו זורעים מדולל ב 96 צלחות היטב. מושבות בודדים היו מבודדים הדמיה לביטוי הומוגני.

"e_content> איור 3 מציג את המדידה של האנדותל cytosolic ואת המיטוכונדריה H 2 O 2 רמות. תמונות confocal נציג להראות גידול של Hyper-Cyto (cytosolic) ו - Hyper-dMito (מיטוכונדריה) פלואורסצנציה לאחר 6 שעות של גירוי. לשינויים בעוצמת הקרינה היו מנורמל והביע כשינוי לקפל.

איור 4 מראה את ההערכה של macrophage הנגזרות ROS המושרה אנדותל cytosolic Ca 2 + גיוס. LPS-גירוי מקרופאגים נוספו על ריאתי לתאי אנדותל כלי הדם (PMVEC) שהיה טעון קודם לכן עם תאיים Ca 2 + ([Ca 2 +] i) אינדיקטור צבע Fluo-4. יישום של LPS-הופעל מקרופאגים בר סוג עוררו [Ca 2 +] i עלייה PMVECs זה היה נחלש בנוקאאוט של מונואמין NADPH תפקודית (gp91 phox-/ -).

איור 1
באיור 1. Visualizatiעל של macrophage שנוצר הסלולר ROS ו superoxide המיטוכונדריה. J774.1 התאים היו תיגר עם ligands TLR2, 3 ו - 4 (2 מיקרוגרם / מ"ל, חומצה TLR2 Lipoteichoic; 10μg/ml, פולי (אני: C)-TLR3: 1 מיקרוגרם / מ"ל LPS-TLR4). עבור 6 שעות בבית 37 ° C. לאחר הטיפול התאים עמוסות (א) הסלולר ROS אינדיקטור (H 2 DCF-DA: ירוק פלואורסצנטי) או (ב) אינדיקטור superoxide המיטוכונדריה (MitoSOX האדום, אדום פלואורסצנטי). (ג) Antimycin שימשה כביקורת חיובית עבור ייצור ROS המיטוכונדריה. שינויים בעוצמת הקרינה נבדקו בעזרת מיקרוסקופיה confocal. (ד) ו - (ה) quantitation השינוי פלואורסצנציה מתכוון.

איור 2
באיור 2. ייצוג סכמטי של יצירת ביטוי יציב של cytosolic תא האנדותל המיטוכונדריה אינדיקטורים ROS.

איור 3
באיור 3. V. isualization של האנדותל cytosolic ואת המיטוכונדריה H 2 O 2 רמות MPMVECs ביציבות להביע (א) Hyper-Cyto או (ב) Hyper-dMito הותקפת עם ligands TLR2, 3 ו - 4 (2 מיקרוגרם / מ"ל, חומצה TLR2 Lipoteichoic; 10μg / מ"ל, פולי (אני: C)-TLR3: 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​LPS-TLR4) במשך 6 שעות ב 37 ° C. (ג) Antimycin שימשה כביקורת חיובית עבור ייצור ROS המיטוכונדריה. לאחר הטיפול, שינויים בעוצמת הקרינה נבדקו בעזרת מיקרוסקופיה confocal. (ד) ו - (ה) quantitation השינוי פלואורסצנציה מתכוון.

איור 4
איור 4. Macrophage הנגזרות ROS לעורר אנדותל לקוי תא Ca 2 + גיוס. (א) ייצוג סכמטי של בתאי האנדותל / מחקר macrophage שיתוף תרבות מודל. (ב) מקרופאגים Murine מבודד טרי משני WT ו gp91phox עכברים null (המעבדה ג'קסון), הופעלו על ידי 1 מיקרוגרם / מ"ל LPS עבור 6 ח Macrophages תויגו עם תא גשש האדום (אדום), והוסיף על Fluo-4 PMVECs נטען (ירוק) כדי להעריך O אוטוקריני 2 • -. איתות (C) LPS המופעל מקרופאגים מעכברים מבודד WT מופעלות גדול ומהיר Ca 2 + גיוס ב PMVECs לעומת מקרופאגים מעכברים gp91phox ריק. אימות של הפעלת macrophage הוכח בעבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השיטה המתוארת כאן מאפשר מדידה כמותית מהירה של מינים חמצן תגובתי בתאים חיים או באמצעות צבעים חמצון רגיש או חיישנים פלסמיד. אגוניסטים של TLRs (קולטני Toll-כמו) הם תרכובות לגרות את התאים דרך TLRs הנוכחי על פני התא ההדק מסלולי איתות במורד 15. בפרוטוקול שלנו, אנו השתמשו בשלושה דהינו אגוניסטים שונים TLR, שאיבה, teichoic חומצה TLR2 אגוניסט, פולי (אני: C). TLR3-אגוניסט, LPS-TLR4 אגוניסט אשר דיווחו לגרום ROS כמודל למערכת כדי להדגים את המדידה ROS . מדידה של ROS באמצעות חמצון צבען רגיש הוא מהיר וניתן להשתמש בו כדי למדוד מגוון של מינים ROS. השימוש Hyper פלסמיד חיישן מבוסס סלקטיבי מזהה H 2 O 2 רמות. H 2 O 2 הוא חמצון יציב יותר גם את השימוש Hyper Cyto ו Hyper-dMito במסגרת התא יציב מוסיף יתרון על פני autooxidation-תמונה של צבעי ניאון ROS רגיש.Hyper אינו גורם artifactual דור ROS והוא יכול לשמש לצורך זיהוי של שינויים מהירים של ריכוז H 2 O 2 בתאים תאים שונים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. תאים ביציבות המבטא את Hyper חיישנים המשמשים מבחר המשובטים של האוכלוסייה, אשר מציעה מדידה אמין ומדויק יותר של H 2 O 2 רמות. חשוב לציין, ששיטה זו מתאר גם את זיהוי ומדידה כמותית של Ca 2 + גיוס בתאים חיים מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני מתאי שכנות כמו תאים חיסוניים מולדים. הליך ניסיוני בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal עשוי להיות שימושי מאוד חשוב לחשוף במרחב ובזמן שינויים האות תא אירועים התמרה במיוחד במקרים שבהם שני סוגי תאים שונים מעורבים. אמנם, נציג את הניסויים מפורט במאמר זה הן רק דוגמה אחת לסוג של אינטראקציה למד, טכניקה זו יכולה להיות בקלותdapted ללמוד אינטראקציות הסלולר בין מספר סוגי תאים חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים מענק (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) ל-MM. מאמר שלנו נתמך בחלקו על ידי Carl Zeiss MicroImaging LLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor cell chamber Invitrogen A7816
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
DMEM low glucose medium Invitrogen 10567-014
Endothelial growth factor supplement (ECGS) Upstate, Millipore 02-102
Fetal Bovine Serum Invitrogen 12662011
G418 Invitrogen 10131-027
Gelatin Sigma-Aldrich G1393
H2DCFDA Invitrogen D-399
LPS Sigma-Aldrich L4516
LTA Sigma-Aldrich L2515
MitoSOX Red Invitrogen M36008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Invitrogen 51985091
Pen/Strep (10x) Invitrogen 15140163
pHyPer-cyto Evrogen FP941
pHyPer-dMito Evrogen FP942
Poly(I:C) Sigma-Aldrich P0913
Prism software 5.0 GraphPad Software Inc.
SigmaPlot 11.0 Systat software, Inc.
Trypsin-EDTA (10x) Invitrogen 15400054
T-25 Flasks Corning 430639
T-75 Flasks BD Biosciences 353136
96-well TC micro well plate BD Biosciences 353072
Zen 2009 software Carl Zeiss, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
  2. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).
  3. Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 Forthcoming.
  4. Hawkins, B. J. S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis. J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).
  5. Madesh, M., Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
  6. Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
  7. Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).
  8. Sanlioglu, S. Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa. 276, 30188-30198 (2001).
  9. Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling. Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).
  10. Vliet, A. vander NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more. Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).
  11. Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).
  12. Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).
  13. Mukhopadhyay, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).
  14. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
  15. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
ויזואליזציה של כלי דם Ca<sup> 2 +</sup> איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mallilankaraman, K., Gandhirajan, R. K., Hawkins, B. J., Madesh, M. Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS. J. Vis. Exp. (58), e3511, doi:10.3791/3511 (2011).More

Mallilankaraman, K., Gandhirajan, R. K., Hawkins, B. J., Madesh, M. Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS. J. Vis. Exp. (58), e3511, doi:10.3791/3511 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter