Summary
VisioTracker는 안구 운동의 기록을 바탕으로 애벌레의 작은 성인 물고기의 시각적 성능의 정량 분석을위한 자동화 된 시스템입니다. 이 같은 시각 시스템 개발 및 기능, 약리학, 신경 회로 연구와 sensorimotor 통합 등의 분야에서 높은 처리량 연구를 활성화, 시각 자극 속성과 실시간 분석에 대한 모든 권한을 제공합니다.
Abstract
시각 시스템 개발과 기능에 조사가 조작 할, 유도하기 쉬운 강력하고 단순 시각적 성능을 객관적 행동 모델을 할 거에요. 적절한 모델은 optokinetic 응답 (OKR), 높은 선택 가치로 인해 모든 vertebrates에 존재하는 재귀 행동에 발견되었습니다. OKR은 빠른 재설정 saccades과 가끔 눈의 느린 자극 - 다음과 같은 운동을 포함한다. 이 동작의 측정은 쉽게 수십 년 선호 모델 중 하나의 초기 안정적인 발병 (완전 96시간 게시물 수정을 (hpf) 이후에 개발) 및 zebrafish 유전학에 대한 철저한 지식에서 benefitting으로 인해, zebrafish 애벌레에서 실시 이 분야에서 생물. 한편 성인 물고기 유사한 메커니즘의 분석은 특히 약리 및 toxicological 응용 프로그램, 중요성을 얻었습니다.
여기 우리는 완전히 자동화, 높은 throughpu을 VisioTracker을 설명시각적 성능의 정량 분석을위한 t 시스템입니다. 이 시스템은 교수 스테판 Neuhauss의 그룹에서 수행 연구에 기반을두고 있으며 TSE 시스템에 의해 다시 설계되었습니다. 이 고해상도 줌 렌즈가 장착 된 고품질의 비디오 카메라에 의해 모니터링 작은 생선 immobilizing 장치로 구성되어 있습니다. 생선 컨테이너는 컴퓨터 생성 자극 패턴이 예상 할 수있는시, 북 화면으로 둘러싸여 있습니다. 눈 움직임이 기록하고 자동으로 실시간으로 VisioTracker 소프트웨어 패키지에 의해 분석됩니다.
데이터 분석은 느리고 빠른 위상 시간, 운동주기 주파수, 속도가 느린 상 이득, 시력 및 대비 감도와 같은 매개 변수의 즉시 인식 할 수 있습니다.
일반적인 결과는 예를 들어 야생 타입 형태에 명백한 변경을 표시하지 영상 시스템 돌연변이의 급속한 식별, 또는 정량적 효과의 결정을 허용 약리 또는 독성 mutagenic시각 시스템 성능에 에이전트.
Protocol
1. 물고기의 번식
태아도 보관하고 사육 표준 약관 (브랜드 2002)에서와 일 게시물 수정을 (dpf)에 개발에 따라 개최되었다. 5 dpf에서 성인과 애벌레는 측정에 활용했다.
2. 실험 절차
- 악기의 준비
애벌레 : 생선 유충은 3 %에 포함 된 사전 예열 (28 ° C) 몸의 움직임을 방지하기 위해 methylcellulose. 배아는 투영 화면을 마주 VisioTracker에 발등 쪽을 배치했다. 성인 생선 : 생선은 immobilizing 장치에 장착하고 VisioTracker에 위치, 300 밀리그램 / 리터 MS-222에 간단히 anesthetized했다. 측정이 시작되기 전에, 그들은 1-2 분 동안 복구 할 수 남아 있었다.
- 자극 패턴 생성
물고기 주위에 회전 수직 검은 색과 흰색 사인파 격자로 구성된 자극 패턴이 만들어졌습니다독점 소프트웨어 패키지를 사용합니다. 그들은 파형, 대비, 강도, 각도 속도와 공간 주파수에 따라 소프트웨어 패키지를 통해 조절 될 수 있습니다. 패턴은 VisioTracker에 포함 된 디지털 광 프로젝터를 사용하여 화면에 투영했다. 물고기의 눈과 화면 사이의 대략적인 거리를 4.5 cm, 그리고 프로젝션 크기에 화면에 수평으로 360 ℃ 일이고 수직으로 55 ℃ 일이었다. 애벌레의 물고기를 들어, 자극의 방향 saccade 주파수를 줄이기 위해 0.33 Hz의 주파수로 변경되었습니다. 성인 물고기는 unidirectionally 자극되었으며, 일반적으로 코 - 투 - 시간적 눈 속도가 (뮐러와 Neuhauss, 2010 참조) 크게 낮은과 거의 일정했기 때문에 시간적 - 투 - 코 방향으로 자극 눈이 고려되었습니다.
- 안구 운동의 기록
물고기의 머리 밝은 필드 이미지는 적외선 비디오 카메라에 싫증이 났을 것입니다. 물고기의 적외선 조명은 f를 영향을했습니다아래 ROM. 카메라는 각각 5 프레임 / 초 (애벌레) 또는 12.5 프레임 / 초 (성인)의 속도로 이미지를 기록했다. 이미지는 자동으로 처리 수정 및 눈의 모양에 부드럽게되어 있습니다. 수평 축에 따른 눈의 방향이 자동으로 결정되었으며, 눈 속도는 독점 소프트웨어 패키지에 의해 계산되었다. 생선의 작은 움직임이 자동으로 소프트웨어에 대한 수정되었습니다. 모든 기록과 분석은 실시간으로 달성되었다.
3. 후 실험 데이터 처리
- 눈 속도의 원료 측정은 속도가 느린 상 속도를 추출하기 위해 saccades에 대한 필터링되었습니다.
- Saccade - 필터링 눈 속도 곡선은 7 프레임의 슬라이딩 창에 실행중인 평균에 의해 부드럽게했다.
- 눈 속도는 동일한 자극 조건에 프레임 평균했습니다.
- 애벌레의 물고기를 들어, 눈 속도는 두 눈으로 평균했습니다.
4. 대표 결과 :
애벌레의의 Zebrafish를 들어, 범퍼 돌연변이가 선정되었습니다. 이 돌연변이, 렌즈에 상피 세포가 감소 된 렌즈 크기와 렌즈의 이소성 위치로 이어지는 hyperproliferate. 이러한 형태학의 변경은 대비 감도의 중요한 감소와 시력 (Schonthaler 외., 2010)에 의해 반영됩니다. 그림 1은 야생 형 형제 대 범퍼 돌연변이의 대비 감도의 차이를 보여줍니다. 범퍼 돌연변이가 점점 더 자극 대비 감소로 눈 속도를 조절 실패합니다. 비유함으로써, 자극 공간 주파수가 증가하면 자극 스트라이프 폭이 감소 즉, 범퍼 돌연변이는 마찬가지로 시력 (그림 2) 감소 입증
성인 Zebrafish visua의 의존환경 조건에 '성능은 30 분 동안 자신의 탱크 물에 알코올의 농도를 변화로 물고기를 subjecting하고 이후 다양한 자극 조건에서 optokinetic 응답을 측정하여 조사되었다. 성인 Zebrafish가 증가 알코올 농도 (그림 3)에서 유지 대비 감도에 표시된 감소를 보여줍니다. 생선 증가 알코올 농도 (그림 4)로 치료 때 공간 주파수의 폭 넓은 범위에 걸쳐 전반적으로 눈 속도의 비슷한 용량에 따라 달라 감소 관찰 될 수 있습니다. 알코올 치료는 나아가 복용 - dependently 증가 자극 속도 (그림 5)에서 예시로 더 까다로운 작업에서 눈 돌림 성능을 감소시킨다.
그림 1. Zebrafish 애벌레의 눈 속도는 자극 대비에 따라 달라집니다. 10 범퍼 돌연변이와 10 야생 형 형제는을 변화에서 5 dpf에서 분석 하였다 timulus 줄무늬 대비 조건. 그래프는 평균 눈 속도 ± 1 SEM을 보여줍니다.
그림 2. Zebrafish 애벌레의 눈 속도는 공간 주파수에 따라 달라집니다. 10 범퍼 돌연변이와 10 야생 형 형제 자매는 5 dpf에서 다른 자극 스트라이프 폭을 받게과 같은 설명 분석 하였다. 그래프는 평균 눈 속도 ± 1 SEM을 보여줍니다.
그림 3. 대비 감도의 성인 Zebrafish 쇼 알코올 농도에 따라 달라 감소. 성인 Zebrafish는 30 분 동안 표시 및 다양한 자극 스트라이프 대비 조건 하에서 분석으로 알코올 농도를 변화 유지했다. (: N = 11 대조군 제외) 그래프는 평균 시간적 - 투 - 코 눈 속도 ± 그룹 당 9 물고기의 한 SEM을 보여줍니다.
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그림 4. 자극 스트라이프 폭 넓은 범위에 걸쳐 전반적으로 안구 운동의 성인 Zebrafish 쇼 알코올 농도에 따라 달라 감소. 성인 Zebrafish는 30 분 동안 표시 및 다양한 자극 스트라이프 너비 조건 하에서 분석으로 알코올 농도를 변화 유지했다. (: N = 11 대조군 제외) 그래프는 평균 시간적 - 투 - 코 눈 속도 ± 그룹 당 9 물고기의 한 SEM을 보여줍니다.
그림 5. 자극 속도의 다양한 범위에 걸쳐 전반적으로 눈의 움직임에 성인 Zebrafish 쇼 알코올 농도에 따라 달라 감소. 성인 Zebrafish는 30 분 동안 표시 및 경기 부양 속도 조건을 변화에 따라 분석으로 알코올 농도를 변화 유지했다. 그래프는 평균 시간적 - 투 - 코 눈 속도 ± 그룹 당 9 물고기 (제어 그룹을 제외한 1 SEM을 보여줍니다 :N = 11).
Discussion
시각 기능의 연구 OKR의 중요성은 오랜 시간 (부활절 및 니콜라 1996, 1997)에 대한 과학 지역 사회에서 인정되었고, 진정으로 패러다임을 수량화하려는 시도는 10여 전에 잘 시작했습니다. 부활절과 니콜라 (1996)는 방문객이 눈의 움직임의 비디오 녹화를 수동으로 분석 한 스트라이프 드럼을, 회전과 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 위치 조정 자주 설명서를 필요한 생선 배아의 고정의 부족으로 고통하며, 큰 어려움과 눈의 추적 움직임을 감지 수 있습니다. 단계는 앞으로 더 많은 변수를 컴퓨터 생성 자극 프리젠 테이션 (., Rinner 외, 2005a Roeser 및 Baier, 2003)를 허용 할 수있는 비디오 투영 줄무늬 드럼의 사용이었다.
촬영 레코딩의 대부분 수동, 프레임 분석은 매우 힘든 것으로 입증하고, 관찰자 편견 (벡 외.에 의해 방해 어느 정도에있다2004). 실시간으로 자동 분석 행동 피드백 학습 메커니즘 (주요 외., 2004)의 사용을 허용하는 제안되었다. 적외선 조명 및 주파수 제어 회전 자극의 사용은 벡 외에 의해 개척되었습니다. (2004). 그러나, 시스템은 애벌레 위해 사용 된 설명과 분석은 오프라인 실시되었다. 또한, VisioTracker함으로써 실험의 과정에 유연성과 자연 영향력을 수 있도록 실험이 진행되는 동안 자극을 변경 포함 자극, 완벽하게 제어 할 수 있습니다. 또한, VisioTracker에서 사용하는 디지털 자극 생성 줄무늬 자극 드럼 (벡 외., 2004)의 불활성 질량 가속 앞서 언급 한 문제를 극복.
methylcellulose의 애벌레 구속이 크게 눈의 움직임을 방해하지 않으며, zebrafish 웰빙에 대한 장기 효과가 없습니다. 생선 애벌레가 성공적으로되었습니다피부를 통해 산소 공급이 증가 세 (키안 외., 2005)와 수요 부족 될 때까지 유지가 며칠 동안 methylcellulose에 포함.
성인 생선 접근 금지 방법은 동물에 동등하게 간단합니다. 빠르게 다른 하나 시험 동물을 교환 할 수있는 옵션과 결합 실험의 짧은 기간은 더 시스템의 긍정적 인 동물 복지 측면에 추가됩니다. 아가미가 지속적으로 바다로 플러시되기 때문에, 그것은 스파이크 눈 움직임과 시각적 성능에 미치는 영향을 연구하기 위해 선택의 화학 물질과 물을 편리하게 이용할 수 있습니다. 마찬가지로 세척 아웃 실험은 실험의 동물을 처리 할 필요없이 추가 할 수 있습니다.
비디오 사진의 픽셀 노이즈가 눈 위치와 각도 속도의 매우 정확한 측정을 가능하게 독점 VisioTracker 소프트웨어의 알고리즘을 부드럽게하여 최소화했다. 또한, 통계 촉진하기분석 소프트웨어는 고정 속도에서 발생하고 실험 진술에 기여하지 않는 saccadic 움직임을 필터링. 7 비디오 프레임 이상의 속도 곡선의 평균 나중에 분석을 촉진.
VisioTracker는 많은 다양한 연구 분야에 새로운 차원을 엽니 다. 시스템 및 그 전임자가 이미 같은 시력, 대비 감도와 가벼운 적응 (Rinner 외., 2005a, Schonthaler 외., 2010) 등의 매개 변수를 사용하여 zebrafish 애벌레의 시각적 성능을 수량화하기 위해 성공적으로 사용되었습니다의 기능 분석을위한 . 시각 전달 캐스케이드 (.. 예 Rinner 외, 2005b, Renninger 외, 2011), 또는 돌연변이 zebrafish의 애벌레 (예 : Schonthaler 외, 2005, 2008 년 시각적 결함의 분석 구성원의 조작에 따라 콘 photoreceptors, Bahadori 외., 2006). 시각 시스템의 형태학 및 기능 성숙의 상호 의존성그 시력은 주로하지만, 완전히 애벌레의 단계 (호그 외., 2010)에서 photoreceptor 간격에 의해 제한되지 않습니다 보여 OKR 측정에 의해 연구되었습니다.
VisioTracker 성인 zebrafish 및 기타 유사한 크기의 물고기 종 (뮐러와 Neuhauss (2010),이 보고서)에 시각적 기능을 분석 할 동등하게 적합합니다.
이 같은 조사 할 물질이 성인 아가미가 주변의 물 흐름에 추가 될 수 있습니다 상기 독성학이나 약학 등의 연구 분야에서 시스템을 활용하는 것도 고려할 수 있습니다. 또한, VisioTracker의 다양성은 시각적 기능, 신경 회로 기능과 개발, 또는 sensorimotor 제어 (황 & Neuhauss, 2008 년 검토 참조) ontogenetics의 예를 들어보다 철저한 분석을 할 수 있습니다.
Disclosures
올리버 DR Schnaedelbach와 홀거 D. Russig는이 문서에서 사용되는 시각적 성능 추적 시스템을 생산 TSE 시스템 GmbH의 직원입니다. 이 문서의 생산은 TSE 시스템 GmbH의에 의해 후원되었다. 스테판 CF Neuhuass 판매 각 시스템에 대해 TSE 시스템에 의해 보수를받는 취리히 대학의 직원입니다.
Acknowledgments
KPM은 EU FP7 (RETICIRC)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
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