Summary
O VisioTracker é um sistema automatizado para a análise quantitativa do desempenho visual de peixes adultos e larvas pequeno baseado no registro dos movimentos oculares. Ele possui total controle sobre propriedades de estímulo visual e análise em tempo real, permitindo alto rendimento de pesquisa em campos como o desenvolvimento do sistema visual e função, farmacologia, estudos de circuitos neurais e integração sensório-motora.
Abstract
As investigações sobre o desenvolvimento do sistema visual e função exigir quantificáveis modelos comportamentais de desempenho visual que são fáceis de obter, robusto e simples de manipular. Um modelo adequado foi encontrado na resposta optocinético (OKR), um comportamento reflexivo presente em todos os vertebrados, devido ao seu valor elevado de selecção. O OKR envolve lentos estímulo seguintes os movimentos dos olhos alternados com rápidos sacadas reajuste. A medição deste comportamento é facilmente realizado em larvas de peixe-zebra, devido ao seu início precoce e estável (plenamente desenvolvida após 96 horas pós-fertilização (hpf)), e beneficiando de o conhecimento completo sobre zebrafish genética, por décadas um do modelo preferido organismos nesta área. Enquanto isso, a análise de mecanismos similares em peixes adultos ganhou importância, principalmente para aplicações farmacológicas e toxicológicas.
Aqui descrevemos VisioTracker, totalmente automatizada e de alta throughput sistema para análise quantitativa do desempenho visual. O sistema é baseado em pesquisas realizadas no grupo do Prof Stephan Neuhauß e foi re-desenhado por Sistemas TSE. Ele consiste de um dispositivo de imobilização para os peixes pequenos monitorado por uma câmera de vídeo de alta qualidade equipada com uma lente zoom de alta resolução. O recipiente de peixe está rodeado por uma grade do tambor rotativo, em que os padrões gerados por computador de incentivos pode ser projectada. Os movimentos dos olhos são registadas e analisadas automaticamente pelo pacote de software VisioTracker em tempo real.
A análise dos dados permite o reconhecimento imediato de parâmetros tais como duração da fase de lenta e rápida, frequência do ciclo de movimento lento, em fase de ganho, acuidade visual e sensibilidade ao contraste.
Os resultados típicos permitir, por exemplo, a rápida identificação de mutantes do sistema visual que mostram nenhuma alteração aparente na morfologia do tipo selvagem, ou na determinação dos efeitos quantitativos do farmacológicos ou tóxicos e mutagénicosagentes no desempenho do sistema visual.
Protocol
1. Criação de peixes
Os embriões foram mantidos e criados em condições normais (Marca 2002) e encenado acordo com o desenvolvimento em dias pós fertilização (dpf). Adultos e larvas a 5 dpf, foram utilizados para as medições.
2. Procedimento experimental
- Preparação do instrumento
Larvas: larvas de peixes foram embebidas em 3% pré-aquecido (28 ° C) de metilcelulose a evitar os movimentos do corpo. Os embriões foram colocados lado dorsal para cima no VisioTracker, de frente para a tela de projecção. Peixes adultos: Os peixes foram anestesiados brevemente em 300 mg / l MS-222, montado no dispositivo de imobilização e colocado no VisioTracker. Antes medições foram iniciadas, foram deixados a recuperar durante 1-2 min.
- Geração de padrões de estímulo
Padrões de estímulos que consistem em verticais em preto-e-branco de onda sinusoidal grades que giram em torno do peixe foram criadosusando o pacote de software proprietário. Podiam ser modulada por meio do pacote de software de acordo com a forma de onda, o contraste, a intensidade, a velocidade angular ea frequência espacial. Padrões foram projetadas na tela usando um projetor digital de luz contida dentro da VisioTracker. A distância aproximada entre o olho do peixe e da tela foi de 4,5 cm, eo tamanho de projeção em tela foi de 360 graus na horizontal e 55 ° na vertical. Para larvas de peixes, direção de estimulação foi alterada com uma freqüência de 0,33 Hz para reduzir a frequência dos movimentos sacádicos. Peixes adultos foram estimuladas unidireccional e apenas o olho estimulada em tempo-para-nasal direcção foi considerada, desde nasal-to-temporal do olho de velocidade, em geral, é significativamente mais baixa e quase constante (ver Mueller e Neuhauß, 2010).
- Registro dos movimentos oculares
A imagem de campo brilhante da cabeça do peixe foi alimentado a uma câmara de vídeo de infravermelhos. Iluminação infravermelha de peixes foi feita from abaixo. A câmera gravou imagens a uma taxa de 5 quadros / segundo (larvas) ou 12,5 frames / segundo (adultos), respectivamente. As imagens são automaticamente processadas, corrigidas e alisou para a forma dos olhos. Orientação do olho, em relação ao eixo horizontal foi então determinada automaticamente e velocidade do olho foi calculado com o pacote de software proprietário. Pequenos movimentos dos peixes foram corrigidas automaticamente pelo software. Toda a gravação ea análise foi realizada em tempo real.
3. Pós-processamento de dados experimentais
- Medições de velocidades olho-primas foram filtrados para sacadas, a fim de extrair lenta fase de velocidade.
- Curvas de velocidade Sacada-filtradas dos olhos foram suavizadas por uma média de execução com uma janela deslizante de 7 frames.
- Velocidade de olho foi em média mais de quadros com condições de estímulo idênticos.
- Para larvas de peixes, a velocidade média foi de olho sobre ambos os olhos.
4. Os resultados representativos:
Para Zebrafish larval, o mutante pára-choques foi o escolhido. Nesta lente, mutante células epiteliais hyperproliferate, levando a lente tamanho reduzido e localização ectópica da lente. Estas alterações morfológicas são reflectidas por uma redução significativa da sensibilidade ao contraste e acuidade visual (Schonthaler et al., 2010). A Figura 1 demonstra a diferença de sensibilidade de contraste de mutantes contra carros de tipo selvagem siblings. Mutantes carros cada vez falha em ajustar a velocidade do olho como as diminuições de contraste de estímulo. Por analogia, quando a frequência de estímulo espacial é aumentada, isto é, a largura de banda é reduzida estímulo, os mutantes para carros igualmente demonstram diminuição da acuidade visual (Fig. 2)
A dependência do adulto Zebrafish visual de desempenho em condições ambientais foi investigada sujeitando o peixe a variação das concentrações de álcool no tanque de água durante 30 minutos e, subsequentemente, medindo a resposta optocinético sob condições de estímulo variados. Peixe-zebra adultos mostram uma redução na sensibilidade de contraste, quando mantidos em concentrações crescentes de álcool (Fig. 3). A redução dependente da dose semelhante de velocidade global do olho ao longo de um vasto leque de frequências espaciais pode ser observado quando os peixes foram tratadas com concentrações crescentes de álcool (Fig. 4). Tratamento do álcool, além disso, dependente da dose, reduz o desempenho oculomotor em tarefas mais exigentes, como exemplificado por velocidades de estímulo aumentados (Fig. 5).
Figura 1. Zebrafish velocidade olho larval depende de contraste estímulo. 10 mutantes para carros e 10 do tipo selvagem irmãos foram analisadas em cinco dpf sob diferentes s contraste timulus condições de distribuição. Gráfico mostra a velocidade média olho ± 1 SEM.
Figura 2. Zebrafish velocidade olho larval é dependente de freqüência espacial. 10 e 10 para carros mutantes do tipo selvagem irmãos foram submetidas a diferentes larguras de banda de estímulo a 5 dpf e analisados como descrito. Gráfico mostra a velocidade média olho ± 1 SEM.
Figura 3. Adulto Zebrafish álcool mostram redução dependente da concentração na sensibilidade ao contraste. Adulto Zebrafish foram mantidas em diferentes concentrações de álcool, tal como indicado, durante 30 minutos e analisadas sob variadas condições de contraste de estímulo de banda. O gráfico mostra a velocidade média temporal de olho-de-nasal ± 1 SEM, de 9 de peixe por grupo (com excepção do grupo de controlo: n = 11).
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Figura 4. Adulto Zebrafish álcool mostram redução dependente da concentração nos movimentos oculares geral sobre uma vasta gama de largura de faixa do estímulo. Adulto Zebrafish foram mantidas em diferentes concentrações de álcool, tal como indicado, durante 30 minutos e analisadas sob variadas condições de estímulo de largura de banda. O gráfico mostra a velocidade média temporal de olho-de-nasal ± 1 SEM, de 9 de peixe por grupo (com excepção do grupo de controlo: n = 11).
Figura 5. Adulto Zebrafish mostra álcool redução dependente da concentração nos movimentos dos olhos em geral sobre uma ampla gama de velocidades de estímulo. Adulto Zebrafish foram mantidas em diferentes concentrações de álcool, tal como indicado, durante 30 minutos e analisados sob condições variáveis de velocidade do estímulo. Gráfico mostra a velocidade média temporal de olho-de-nasal ± 1 SEM de 9 de peixes por grupo (exceto grupo controle:n = 11).
Discussion
A importância da OKR para o estudo da função visual foi reconhecido na comunidade científica por um longo tempo (Páscoa e Nicola 1996, 1997), e as tentativas de realmente quantificar o paradigma começaram bem mais de uma década atrás. Páscoa e Nicola (1996) desenvolveu um sistema motorizado com tambores rotativos listradas, onde a gravação de vídeo de movimento dos olhos foi analisada manualmente. Este sistema sofreu da falta de imobilização do embrião de peixe, que é exigido manual do reposicionamento frequente, e podem detectar os movimentos de rastreamento de olhos apenas com grande dificuldade. Um passo foi a utilização de um tambor de vídeo-listrado projectada para permitir a apresentação do estímulo mais variáveis geradas por computador (Roeser & Baier, 2003;. Rinner et al, 2005a).
A maior parte manual, análise do quadro-a-quadro de gravação em vídeo tem provado ser extremamente laborioso, e até um certo grau dificultada pelo observador viés (Beck et al.,2004). Análise automatizada em tempo real foi sugerido para permitir a utilização de mecanismos de feedback comportamentais de aprendizagem (Major et al., 2004). O uso de iluminação infravermelha e frequência controlada estímulos rotativas foi iniciada por Beck et al. (2004). No entanto, o sistema descrito não só tem sido utilizado para as larvas, e a análise foi realizada off-line. Além disso, o VisioTracker permite o controlo completo sobre a estímulos, incluindo alterar o estímulo durante a experiência, permitindo assim uma maior flexibilidade e espontânea influência sobre o curso da experiência. Além disso, a criação de estímulo digital utilizado pelo VisioTracker superaram os problemas mencionados anteriormente com a aceleração da massa inerte de um tambor de estímulo listrado (Beck et al., 2004).
Restrição larvas por metilcelulose não interfere significativamente com o movimento dos olhos e não tem quaisquer efeitos de longo prazo sobre zebrafish bem-estar. Larvas de peixes foram sucessomantida incorporado em metilcelulose durante vários dias, até que o fornecimento de oxigénio através da pele torna-se insuficiente para a procura com o aumento da idade (Qian et al., 2005).
O adulto método de restrição de peixe é igualmente fácil sobre o animal. A curta duração da experiência, em conjunto com a opção de trocar rapidamente o animal de teste para uma diferente, aumenta ainda mais os aspectos positivos do bem-estar dos animais do sistema. Uma vez que as brânquias são continuamente lavado com água, é conveniente a espiga da água com os produtos químicos de escolha para estudar o seu efeito sobre os movimentos dos olhos e do desempenho visual. Da mesma forma um experimento de wash-out podem ser adicionados sem a necessidade de manusear o animal entre as experiências.
Ruído pixel da imagem de vídeo foi minimizado pelo alisamento algoritmos do software VisioTracker proprietário, permitindo medições altamente precisas da posição do olho e velocidade angular. Além disso, para facilitar a estatísticaanálise, o software filtrados movimentos sacádicos que ocorrem em velocidade fixa e não contribuem para a afirmação experimental. Uma média de curvas de velocidade mais de 7 quadros de vídeo facilitou a análise posterior.
O VisioTracker abre uma nova dimensão para muitas áreas de pesquisa variadas. O sistema e os seus antecessores já foram utilizados com sucesso para quantificar o desempenho visual em larvas do peixe, usando parâmetros como acuidade visual, sensibilidade ao contraste e adaptação à luz (Rinner et al., 2005a, Schonthaler et al., 2010), de análise funcional do fotorreceptores cone após a manipulação dos membros da cascata de transdução visual (por exemplo, Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011..), ou a análise dos defeitos visuais em larvas do peixe mutante (por exemplo, Schonthaler et al, 2005, 2008,. Bahadori et al., 2006). A interdependência de maturação morfológica e funcional do sistema visualfoi estudado através de medições okr para mostrar que a acuidade visual é principalmente, mas não completamente limitada por espaçamento de fotorreceptores em estágios larvais (Haug et al., 2010).
O VisioTracker é igualmente adequado para analisar a função visual em zebrafish adultos e outras semelhantes espécies de peixes de tamanho (Mueller e Neuhauß (2010), este relatório).
Também é concebível utilizar o sistema em áreas de pesquisa, tais como a farmacologia toxicologia ou em que as substâncias a serem investigadas podem ser adicionados ao fluxo de água em torno das guelras dos peixes adultos. Além disso, a versatilidade do VisioTracker permite análises mais completas, por exemplo, de ontogenéticas da função visual, a função do circuito neural e desenvolvimento, ou controle sensório-motor (ver revisão em Huang & Neuhauß, 2008).
Disclosures
Oliver DR Schnaedelbach e Holger D. Russig são funcionários do TSE Systems GmbH, que produz o sistema de rastreamento visual de desempenho utilizado neste artigo. A produção deste artigo foi patrocinado pelo TSE Systems GmbH. Stephan CF Neuhuass é funcionário da Universidade de Zurique, que recebe uma remuneração por sistemas TSE para cada sistema vendido.
Acknowledgments
KPM foi apoiado pela UE FP7 (RETICIRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
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