VisioTracker, גישה אוטומטית חדשנית לניתוח oculomotor

Summary

VisioTracker היא מערכת אוטומטית לניתוח הכמותי של ביצועים חזותיים של דגים בוגרים וזחל קטנים המבוססים על ההקלטה של ​​תנועות עיניים. הוא כולל שליטה מלאה על תכונות גירוי חזותיים וניתוח בזמן אמת, המאפשר מחקר תפוקה גבוהה בתחומים כגון פיתוח מערכת ראייה ותפקוד, פרמקולוגיה, מחקרי מעגלים עצביים ואינטגרציה חושית.

Abstract

חקירות פיתוח מערכת הראייה והתפקוד מחייבות מודלים התנהגותיים מדידים של ביצועים חזותיים כי קלים לעורר, חזקים, ופשוט לתמרן. מודל מתאים כבר נמצא בתגובת optokinetic (OKR), התנהגותו בהווה בכל החוליות בשל ערך הבחירה הגבוהה שלה רפלקסיבי. OKR כרוך תנועות גירוי הבא איטיות של עיניים התחלפו בsaccades איפוס מהיר. המדידה של התנהגות זו מתבצעת בקלות בזחלי דג זברה, בשל הופעתו המוקדמת ויציבה (שפותח באופן מלא לאחר הפרית הודעת שעות 96 (hpf)), ומרוויח מן הידע המעמיק על דג זברת גנטיקה, במשך עשרות שנים אחד מהמודל המועדף אורגניזמים בתחום זה. בינתיים הניתוח של מנגנונים דומים בדגים בוגרים צבר חשיבות, במיוחד עבור יישומים תרופתיים וטוקסיקולוגי.

כאן אנו מתארים VisioTracker, אוטומטי לחלוטין, גבוה throughpuמערכת לא לניתוח הכמותי של ביצועים חזותיים. המערכת מבוססת על מחקר שבצע בקבוצתו של פרופ 'סטפן Neuhauss ועוצבה מחדש על ידי מערכות TSE. הוא מורכב ממכשיר משתק לדג קטן במעקב על ידי מצלמת וידאו באיכות גבוהה המצוידת בעדשת זום ברזולוציה גבוהה. מיכל הדגים מוקף מסך תוף, שעליו דפוסי גירוי מחשב שנוצר יכולים להיות מוקרנים. תנועות עיניים מוקלטות ונתחו באופן אוטומטי על ידי חבילת תוכנת VisioTracker בזמן אמת.

ניתוח נתונים מאפשר זיהוי מיידי של פרמטרים כגון משך איטי ומהיר שלב, תדירות מחזור תנועה, רווח איטי שלב, חדות ראייה, ורגישות לניגודיות.

תוצאות אופייניות תאפשרנה למשל זיהוי המהיר של מוטציות מערכת חזותיות המראות שום שינוי נראה לעין במורפולוגיה סוג פרועה, או בהחלטה על השפעות הכמותיות של תרופתי או רעיל ומוטגניותסוכנים על ביצועי מערכת ראייה.

Protocol

1. רבייה של דגים

עוברים נשמרו וגדלו בתנאים סטנדרטיים (מותג 2002) וביימו על פי התפתחות בהפרית הודעת ימים (DPF). מבוגרים וזחלים ב5 DPF נוצלו למדידות.

2. הליך ניסוי

1. הכנה של מכשיר

זחלים: זחלי דגים היו משובצים ב3% מראש התחמם (28 ° C) methylcellulose כדי למנוע תנועות גוף. העוברים הונחו צד הגבה בVisioTracker, מול מסך הקרנה. דגים בוגרים: דגים היו בקצרה מורדמים ב300 מ"ג / ליטר MS-222, מצוידים במכשיר המשתק והניח בVisioTracker. לפני מדידות יזמו, הם נותרו להתאושש במשך 1-2 דקות.

2. דור של דפוסי גירוי

דפוסי תמריצים בהיקף של gratings השחור ולבן האנכי סינוס גל מסתובב סביב הדגים נוצרובאמצעות חבילת תוכנת הקניינית. הם יכולים להיות מווסתים באמצעות חבילת התוכנה בהתאם לצורת גל, לעומת זאת, עצמה, מהירות הזוויתית ותדר המרחבי. דפוסים היו מוקרנים על המסך באמצעות מקרן אור דיגיטלי הכלול בתוך VisioTracker. המרחק המשוער בין עיניו של הדג והמסך היה 4.5 סנטימטר וגודל הקרנה על המסך היה 360 מעלות אופקיות ואנכי 55 מעלות. לדגי זחל, כיוון של גירוי השתנה בתדירות של 0.33 הרץ להפחתת תדירות saccade. דגים בוגרים היו מגורה unidirectionally ורק עין מגורה בכיוון זמני לאף נחשב, מאז מהירות עין אף להרקתית באופן כללי היא נמוכה באופן משמעותי ופחות קבועה (ראה מילר וNeuhauss, 2010).

3. הקלטה של ​​תנועות עיניים

תמונה בהירה תחום ראשו של הדג הייתה נמאסת למצלמת וידאו אינפרא אדומה. תאורת אינפרא האדומה של דגים בוצעה f rom להלן. המצלמה רשמה תמונות בקצב של 5 מסגרות / שניות (זחלים) או 12.5 מסגרות / 2 (מבוגרים), בהתאמה. תמונות מעובדות באופן אוטומטי, תקנו והחליקו לצורת עין. אורינטצית עין ביחס לציר האופקי הייתה אז נקבע באופן אוטומטי ומהירות עין חושבת על ידי חבילת תוכנת הקניינית. תנועות קטנות של הדגים תוקנו באופן אוטומטי על ידי התוכנה. כל ההקלטה והניתוח הושגה בזמן אמת.

3. עיבוד נתונים שלאחר הניסוי

1. מדידות גלם של מהירויות עיניים סוננו לsaccades כדי לחלץ מהירות איטית שלבים.
2. עקומות מהירות עין Saccade מסוננת-הוחלקו על ידי ממוצע רץ עם חלון זזה של 7 פריימים.
3. מהירות עין הייתה בממוצע לכל מסגרות עם תנאי תמריצים זהים.
4. לדגי זחל, מהירות עין הייתה בממוצע לשני העיניים.

4. תוצאות נציג:

ילדה = "jove_content"> כדי להעריך את היכולות של VisioTracker לדגי זחל ומבוגרים, ניסויים בוצע עם זחלי דג זברה בשעת 5 DPF, ודג זברה בוגרת.

לדג זברת הזחל, מוטצית הפגוש נבחרה. ב, עדשת מוטצית תאי האפיתל hyperproliferate, מה שמוביל לירידה בגודל עדשה ומיקום מחוץ לרחם של העדשה. שינויים מורפולוגיים אלה באים לידי ביטוי בירידה משמעותית ברגישות לניגודיות וחדות ראייה (Schonthaler et al., 2010). איור 1 מדגים את ההבדל ברגישות לקונטרסט של מוטציות פגוש לעומת אחי סוג פראי. מוטנטים פגוש יותר להיכשל להתאים מהירות עין כמו ירידות ניגוד התמריצים. לשם השוואה, כאשר התדר המרחבי הגירוי מוגבר, כלומר רוחב פס הגירוי יורד, מוטנטים פגוש גם מדגימים מופחתים חדות ראייה (איור 2)

התלות של מבוגרי דג הזברה visuaביצועי ליטר בתנאים סביבתיים נחקרו על ידי חשיפת הדגים לריכוזים שונים של אלכוהול במכל המים שלהם במשך 30 דקות ולאחר מכן מדידת תגובת optokinetic בתנאי תמריצים שונים. דג זברה מבוגר להראות ירידה ניכרה ברגישות לניגודיות, כאשר נשמר בריכוזי אלכוהול גובר (3 איור). ירידה תלויה במינון דומה של מהירות כוללת עין על פני טווח רחב של תדרים מרחביים יכולה להיבחן כשהדגים טופלו בריכוזי אלכוהול גובר (איור 4). טיפול אלכוהול במינון יתר dependently מקטין את ביצועי oculomotor במשימות תובעניות יותר, כפי שהודגם במהירויות גירוי מוגברות (איור 5).

האיור 1. מהירות עין זחל דג זברה תלוי בניגוד גירוי. 10 מוטציות מתנגשות, 10 אחי סוג פראי נותחו ב 5 DPF תחת משתנה של תנאים בניגוד פס timulus. גרף מראה מהירות ממוצעת עין ± 1 SEM.

איור 2. מהירות עין זחל דג זברה תלוי בתדר המרחבי. 10 מוטציות מתנגשות, 10 אחי סוג פראי היו נתונים לרוחב פס תמריצים שונים ב 5 DPF ונותחו כמתוארים. גרף מראה מהירות ממוצעת עין ± 1 SEM.

איור 3. הפחתת מבוגרי דג זברת תכנית אלכוהול ריכוז תלוי ברגישות לניגודיות. מבוגרי דג הזברה נשמרו בריכוזים שונים אלכוהול כפי שמצוין במשך 30 דקות ונתח בתנאי ניגוד פס תמריצים שונים. גרף מראה את המהירות הממוצעת זמנית לאף עין ± 1 SEM של 9 דגים לכל קבוצה (מלבד קבוצת ביקורת: N = 11).

דואר 4 "src =" / files/ftp_upload/3556/3556fig4.jpg "/>
איור 4. הפחתת מבוגרי דג זברת תכנית אלכוהול ריכוז תלוי בתנועות עיניים הכוללות על פני טווח רחב של רוחב פס גירוי. מבוגרי דג הזברה נשמרו בריכוזים שונים אלכוהול כפי שמצוין במשך 30 דקות ונתח בתנאי רוחב פס תמריצים שונים. גרף מראה את המהירות הממוצעת זמנית לאף עין ± 1 SEM של 9 דגים לכל קבוצה (מלבד קבוצת ביקורת: N = 11).

איור 5. הפחתת מבוגרי דג זברת תכנית אלכוהול ריכוז תלוי בתנועות עיניים הכוללות על פני טווח רחב של מהירויות תמריצים. מבוגרי דג הזברה נשמרו בריכוזים שונים אלכוהול כפי שמצוין במשך 30 דקות ונתח תחת תנאים משתנים במהירות תמריצים. גרף מראה את המהירות הממוצעת זמנית לאף עין ± 1 SEM של 9 דגים לכל קבוצה (מלבד קבוצת ביקורת:n = 11).

Discussion

החשיבות של OKR לחקר תפקוד ראייה הוכרה בקהילה המדעית במשך זמן רב (חג הפסחא וניקולה 1996, 1997), וניסיונות באמת לכמת את הפרדיגמה החלו גם לפני למעלה מעשור. הפסחא וניקולה (1996) פתחו מערכת עם ממונע מסתובב תופי פסים, שבו הקלטת הווידאו של תנועת עין נותחה באופן ידני. מערכת זו סבלה מחוסר הקיבוע של עובר הדגים, שחייב שימוש תכוף מיצוב מחדש, ויכולה לזהות את תנועות מעקב של עיניים רק בקושי רב. צעד קדימה היה השימוש בתוף פסי וידאו מוקרן על מנת לאפשר למצגת משתנית יותר מחשב שנוצר גירוי (Roeser & Baier, 2003;. Rinner et al, 2005a).

הניתוח בעיקר הידני, מסגרת לפי המסגרת של קלטות מצולמות הוכיח להיות מאוד מייגע, ובמידה מסוימת הקשתה על ידי משקיף הטיה (בק et al.2004). ניתוח אוטומטי בזמן האמת הוצע לאפשר שימוש במנגנוני למידת משוב התנהגותיות (et al רס"ן., 2004). השימוש בתאורת אינפרא אדום וגירויים מסתובבים תדירות ששליטה כבר חלוץ ידי בק et al. (2004). עם זאת, המערכת מתוארת יש רק שמשה במשך זחלים, והניתוח בוצע מחובר. יתר על כן, VisioTracker מאפשר שליטה מלאה על גירויים, כולל שינוי הגירוי במהלך הניסוי, ובכך מאפשר גמישות רבה יותר והשפעה ספונטנית על מהלך הניסוי. כמו כן, יצירת הגירוי הדיגיטלית המשמשת את VisioTracker התגברה על בעיות שהוזכרו קודם לכן בתאוצה של המסה הדוממת של תוף גירוי מפוספס (בק et al., 2004).

איפוק זחלים ידי methylcellulose אינו משמעותי להפריע לתנועת עין ואין שום השפעות ארוכות טווח על דג זברה ורווחתם. זחלי דגים כבר בהצלחהשמר מוטבע בmethylcellulose במשך כמה ימים, עד שאספקת חמצן דרך העור הופכת להיות מספיקה לביקוש עם עלייה בגיל (צ'יאן et al., 2005).

שיטת הרחקת הדגים הבוגרים באותה מידה קלה על החיה. משך הזמן הקצר של הניסוי, יחד עם האפשרות של החלפת בעלי חי מבחן במהירות לאחד אחר, עוד מוסיף להיבטים החיוביים של רווחת בעלי החיים במערכת. מאז הזימים סמוקים ברציפות על ידי מים, זה נוח לספייק מים עם כל חומר כימי של בחירה ללמוד את השפעתו על תנועות עיניים וביצועים חזותיים. כמו ניסוי wash-out ניתן להוסיף ללא צורך לטפל בחיה בין הניסויים.

רעש פיקסל בתמונת הווידאו ממוזער על ידי החלקת אלגוריתמים של תוכנת קניינית VisioTracker, המאפשר מדידות מדויקות מאוד של מצב עין ומהירות זוויתית. יתר על כן, על מנת להקל סטטיסטיניתוח, התוכנה תסונן תנועות saccadic שמתרחשים במהירות קבועה ואינו תורמות להצהרה הניסיונית. מיצוע של עקומות מהירות מעל 7 מסגרות וידאו אפשר מאוחר יותר ניתוח.

VisioTracker נפתח ממד חדש לתחומי מחקר רבים ומגוונים. המערכת וקודמותיה כבר השתמשו בהצלחה כדי לכמת ביצועים חזותיים בזחלי דג זברה, תוך שימוש בפרמטרים כגון חדות ראייה, רגישות לקונטרסט והסתגלות קלה (ואח' Rinner., 2005a, Schonthaler et al., 2010), לניתוח פונקציונלי של photoreceptors קונוס בעקבות מניפולציה של חברי המפל החזותי תמרה (למשל Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011..), או הניתוח של פגמים חזותיים בזחלי דג זברת מוטציה (לדוגמא Schonthaler et al, 2005, 2008;. Bahadori et al., 2006). התלות ההדדית של התבגרות מורפולוגית והפונקציונלית של מערכת הראייהנחקר על ידי מדידות OKR להראות שחדות הראייה היא בעיקר, אך לא רק לחלוטין על ידי ריווח photoreceptor בשלבי זחל (האוג et al., 2010).

VisioTracker מתאים באותה מידה לניתוח תפקוד ראייה בדג זברה בוגר ומינים אחרים דומים בגודל דגים (מילר וNeuhauss (2010), דוח זה).

זה גם מתקבל על דעת כדי לנצל את המערכת בתחומי מחקר כגון רעלים או פרמקולוגיה לפי חומרים שנחקרו אולי יתווספו לזרימת המים המקיפים את זימי דגים הבוגרים. יתר על כן, את הרבגוניות של VisioTracker מאפשרת ניתוח מעמיק יותר, למשל של ontogenetics של תפקוד חזותי, תפקוד מעגלים עצביים ופיתוח, או הסנסורית שליטה (ראה ביקורת בואנג & Neuhauss, 2008).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0387
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521
35 mm cell culture dish	Corning	430165
Serum pipette	Greiner Bio-One	612 361
VisioTracker	TSE Systems	302060